一株有孢汉逊酵母及其应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株有孢汉逊酵母及其应用。

技术背景

随着果蔬深加工产业的蓬勃发展，含有丰富有机酸的天然产物或其废弃物不断增多，过高的有机酸含量不利于资源化利用，有必要筛选具有高效降酸能力的微生物进行降酸处理。如在陈皮加工产业，柑果肉是副产物，柑果汁柠檬酸含量较高，直接饮用的口味并不理想，因此果肉被大量废弃，造成了极大的资源浪费与环境破坏。柑果汁除了含有以柠檬酸为主的有机酸以外，还含有氨基酸、维生素、柠檬苦素、黄酮和多酚类化合物等活性成分，具有良好的开发和利用价值，但因其酸度高导致糖酸比不协调，口感不佳而阻碍了其应用开发。为了符合大众健康饮食理念而无需额外添加糖或稀释勾兑就可达到酸甜比例适合、口感风味良好的柑果汁，生物降酸法比物理和化学降酸法能更好地实现对柑汁的降酸并保证其营养价值。与柑果相同，其他以有机酸为主要组分构成的酸性农产品及天然产物均可以通过生物降酸技术有效降解其有机酸改善其资源开发的品质，使其符合市场需求。

国家发明专利申请CN 113604369A公布了一株葡萄有孢汉逊酵母，对低浓度有机酸有一定的降解率，如对柠檬酸(1.487g/L)、苹果酸(0.575g/L)、酒石酸(0.059g/L)的降解率分别为29.67％、29.76％、7.42％，但对于高有机酸含量水果的降酸作用并不显著。国家发明专利申请CN 111334441A公布了一株卡利比克迈耶氏酵母菌，对柠檬酸(1.16g/L)、草酸(0.021g/L)、D-苹果酸(0.023g/L)、L-苹果酸(0.034g/L)和酒石酸(0.081g/L)的降解率分别为51.18％、13.32％、17.37％、39.63％和66.81％；国家发明专利申请CN 111019847A和国家发明申请CN 108676736A分别公布了一株陆生伊萨酵母菌和一株毕赤酵母，可用于高浓度柠檬酸的生物降酸，但只显示了对柠檬酸的降解作用，没有涉及到其他有机酸的降解效果，未知是否适用于复合有机酸含量较高的水果。

针对现有技术存在的问题，本专利申请旨在筛选出一株新型酵母，对高浓度的有机酸也具有较高的降酸率，适用于含有不同有机酸，如含柠檬酸、苹果酸、酒石酸和琥珀酸等有机酸的农产品及天然产物，具有广泛的市场前景。

发明内容

本发明的首要目的是提供一株有孢汉逊酵母。

本发明的另一目的在于提供上述有孢汉逊酵母的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一株有孢汉逊酵母，名称为有孢汉逊酵母(Hanseniasporapseudoguilliermondii)B4，已于2022年9月30日保藏于位于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62848。

上述有孢汉逊酵母在降酸中的应用。

所述的酸为有机酸，包括柠檬酸、苹果酸、酒石酸和琥珀酸等。

所述的有孢汉逊酵母特别适合用于制备果汁，用于降低果汁中的酸度，从而改善果汁酸度大的问题；优选包括如下步骤：

(1)将待降低酸度的果汁进行除菌；

(2)在除菌得到的果汁中加入上述有孢汉逊酵母进行发酵，得到降低酸度的果汁。

步骤(1)中所述的果汁优选为柑果汁。

步骤(1)中所述的除菌包括过滤除菌或巴氏灭菌，条件80±5℃灭菌15min。

步骤(2)中所述的发酵条件为：于30℃、180rpm的条件下发酵72～96h。

本发明相对于现有的技术，具有以下优点及有益效果：

本发明以柠檬为分离材料，分离纯化到一株可以高效降解柠檬酸的酵母菌，即有孢汉逊酵母B4。其不仅可以降解柠檬酸，也能降解琥珀酸、酒石酸、苹果酸等有机酸，且能耐受高浓度有机酸。在以柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸作为唯一碳源下的降解率分别为47.06％、58.93％、81.85％和31.82％；加入还原糖后减小了对酒石酸降解，但促进了对其它酸降解。该酵母可用于含低浓度至高浓度有机酸场合的降酸应用，对柑果汁中有机酸的降酸率达到97％以上，降酸发酵过程可同时提高果汁的总黄酮含量，提升营养价值。将其应用于柑果汁降酸，这一研究在理论和实际中均具有重要意义，可为生物降酸提供一条可行的技术路线，为提高果汁加工产品品质提供了技术支持，而且能够带动柑果等果汁产业发展。

附图说明

图1为有孢汉逊酵母B4的序列系统进化树图。

图2为有孢汉逊酵母B4菌落形态照片图。

图3为有孢汉逊酵母B4革兰氏染色细胞形态(100倍)照片图。

图4为有孢汉逊酵母B4在单一有机酸为唯一碳源培养基下发酵的酸含量变化结果图。

图5为有孢汉逊酵母B4在混合有机酸为唯一碳源培养基下发酵的酸含量变化结果图。

图6为有孢汉逊酵母B4在葡萄糖与单一有机酸作为复合碳源的培养基下发酵的酸含量变化结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述。

本发明中采用的测定方法：

总酸和pH测定：总酸参考GB/T12456 2021；pH用pH计(PB-10)测定。

降酸率测定：

式中，A0为未发酵样品总酸含量；A1为发酵后样品总酸含量。

有机酸组分测定：

有机酸测定的液相色谱条件具体为，色谱柱：COSMOSIL PBr，流动相A：流动相B体积比为95:5，流动相A是pH＝2.5的0.02M磷酸缓冲溶液，流动相B是甲醇，液相条件：等度洗脱15min，流速：0.8mL/min，进样量：10μL，柱温：35℃，检测波长：210nm。依次测定混标和样品。用标样浓度对峰面积制作标准曲线，采用外标法计算样液中的有机酸含量。

标准曲线：分别用超纯水溶解配制不同浓度的L-苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸混合标准溶液，经0.22μm的微孔滤膜过滤后上机进行HPLC分析，得到峰面积(x)和有机酸质量浓度(y)的回归方程及相关系数。

发酵液处理：发酵液离心(10000r/min、5min)，吸取上清液于容量瓶中，用超纯水稀释为适合浓度。经0.22μm滤膜过滤后上机测定，每个样品重复试验3次。

实施例1

有孢汉逊酵母B4的筛选、分离纯化及鉴定

将柠檬整果切片，放入以2g/L柠檬酸为唯一碳源的富集培养基中，分别以振摇(30℃、180rpm)和静置(30℃)两种方式培养3天。分别取1mL振摇和静置发酵后的富集菌液以10

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运用BLAST在NCBI基因库中比对后使用MEGA5软件进行系统进化树分析，其序列系统进化树分析结果如图1所示，最终得到一株有孢汉逊酵母(Hanseniasporapseudoguilliermondii)B4。该菌株B4在YPD固体培养基上生长较快，培养1天后菌落形态呈圆形，中心点微凸起，乳白色，边缘处颜色微浅，菌落形态如图2所示；挑取单菌落于载玻片上，用革兰氏染色法在显微镜下观察到细胞呈纺锤形，革兰氏染色呈红色，如图3所示。

富集培养基的组成如下：硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，硫酸亚铁0.1g，酵母蛋白胨0.5g，柠檬酸2g，用蒸馏水定容至1L，pH调至4.0。

选择培养基的组成如下：硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，硫酸亚铁0.1g，酵母蛋白胨0.5g，柠檬酸2g，琼脂粉15g，1％溴香草酚蓝乙醇溶液(溶质为溴香草酚蓝，溶剂为95％乙醇溶液)10mL，用蒸馏水定容至1L，pH调至4.0。

以柠檬酸为唯一碳源的液体培养基的组成如下：硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，硫酸亚铁0.1g，酵母蛋白胨0.5g，柠檬酸20g，溶于1L蒸馏水中，pH调至4.0。

将该有孢汉逊酵母B4于2022年9月30日保藏于位于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62848，检测结果为存活。

实施例2

有孢汉逊酵母B4在以浓度为10g/L的柠檬酸、苹果酸、酒石酸和琥珀酸等四种单一酸为唯一碳源培养基时对有机酸的降解作用，培养基初始pH调节至4.0进行发酵。

具体操作如下：将有孢汉逊酵母B4种子液以2％(v/v)接种量分别接种到以柠檬酸、苹果酸、酒石酸和琥珀酸为唯一碳源的液体培养基中，于30℃、180rpm下发酵4天，每隔1天检测其酸含量。液体培养基的配制方法为：硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，硫酸亚铁0.1g，酵母蛋白胨10g，有机酸10g，用蒸馏水溶解，pH调至4.0，再用蒸馏水定容至1L；分装50mL于150mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，待其冷却后加入1mL维生素B1和维生素C的混合溶液(两种维生素的浓度各为0.5mg/mL)。

结果如图4所示，在以有机酸为唯一碳源的培养基中，有孢汉逊酵母B4均能利用单一有机酸进行生长，发酵4天后对柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸的降解率分别为47.06％、58.93％、81.85％和31.82％。

实施例3

有孢汉逊酵母B4在以浓度为30g/L柠檬酸为唯一碳源培养基时的降解作用，培养基初始pH调节至4.0进行发酵。

具体操作如下，将有孢汉逊酵母B4种子液以2％(v/v)接种量分别接种到30g/L柠檬酸为唯一碳源的培养基中，于30℃、180rpm下发酵4天后检测酸含量。所述培养基配制方法为：硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，硫酸亚铁0.1g，酵母蛋白胨10g，柠檬酸分别为30g，溶于1L蒸馏水中，pH调至4.0，分装50mL于150mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，待其冷却后加入1mL维生素B1和维生素C的混合溶液(各0.5mg/mL)。

发酵4天后发酵液中柠檬酸含量为2.93g/L，降酸率高达89.94％，说明该有孢汉逊酵母B4能高效降解柠檬酸。

实施例4

有孢汉逊酵母B4在以柠檬酸、苹果酸、酒石酸和琥珀酸四种混合酸为碳源的培养基时对有机酸的降解作用，培养基初始pH调节至4.0进行发酵。

具体操作如下：将有孢汉逊酵母B4种子液以2％(v/v)接种量分别接种到以混合有机酸为唯一碳源的液体培养基中，于30℃、180rpm下发酵4天，每隔1天检测其酸含量。所述培养基配制方法为：硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，硫酸亚铁0.1g，酵母蛋白胨10g，柠檬酸5g，苹果酸5g，酒石酸5g，琥珀酸5g，溶于1L蒸馏水中，pH调至4.0，分装50mL于150mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，待其冷却后加入1mL维生素B1和维生素C的混合溶液(各0.5mg/mL)。

在混合四种有机酸的培养基中对有机酸的降解速率顺序是柠檬酸>琥珀酸>苹果酸>酒石酸，最大降解率分别为71.06％、60.72％、35.12％和26.24％(图5)。

实施例5

有孢汉逊酵母B4在以10g/L葡萄糖以及10g/L单一有机酸(柠檬酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸)作为复合碳源的培养基时对有机酸的降解作用，培养基初始pH调节至4.0进行发酵。

具体操作如下：将有孢汉逊酵母B4种子液以2％(v/v)接种量分别接种到葡萄糖和有机酸作为复合碳源的培养基中，于30℃、180rpm下发酵4天，每隔1天检测其酸含量。所述培养基配制方法为：硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，硫酸亚铁0.1g，酵母蛋白胨10g，有机酸10g，葡萄糖10g，溶于1L蒸馏水中，pH调至4.0，分装50mL于150mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，待其冷却后加入1mL维生素B1和维生素C的混合溶液(各0.5mg/mL)。

结果如图6所示，在有葡萄糖作为复合碳源时，有孢汉逊酵母B4降解酒石酸受到抑制，发酵4天后对柠檬酸、苹果酸和琥珀酸的降解率分别为48.05％、64.71％和85.12％。

实施例6

有孢汉逊酵母B4在新会柑果汁中的降酸应用，具体步骤如下：在柑果汁中，接入5％(v/v)的有孢汉逊酵母B4种子液，于温度30℃，装液量为20％，转速180rpm的条件下振荡发酵84h，测定柑果汁的降酸率、pH和总黄酮增量。

发酵后柑果汁总酸由13.61g/L变为0.19g/L，降酸率(以总酸计)达98.62％，pH由3.13变为6.02，总黄酮由105.63g/100g变为125.37g/100g，增量为18.69％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。