吲哚-3-乙醛酰胺衍生物制备p53蛋白激活剂的应用

技术领域

本发明属于药物制备领域，具体涉及首次公开的吲哚-3-乙醛酰胺衍生物制备p53蛋白激活剂的应用。

背景技术

编码393个氨基酸组成的53kD的核内磷酸化蛋白被称为p53蛋白，p53基因是细胞生长周期中的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关，被誉为“基因组守护者”。p53会响应细胞中的各种应激源(例如DNA损伤)而被激活。p53的激活会促进DNA修复，或促进异常的细胞受控死亡，从而阻止病症的发生和发展。现有的p53蛋白激活剂包括以下几种，

如何筛选出与p53蛋白相关的化合物，进一步丰富具有成药性的化合物以及提高p53蛋白激动剂的效果是当前研究的焦点之一。

发明内容

为解决现有技术中的上述问题，本发明提供吲哚-3-乙醛酰胺衍生物制备p53蛋白激活剂的应用，并从中筛选出具有p53蛋白相关的式(I)的吲哚草酰胺化合物。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下所述：

式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物制备p53蛋白激活剂的应用，其特征在于所述化合物的结构如式(I)所示，

并且，药理试验显示：本发明式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物与p53蛋白相关，给药后4-8h内能明显上调MCF-7中p53的蛋白含量，因此，本发明式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物能够用于制备p53蛋白激活剂。

式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物通过直接结合鼠双微体X(Murine double minuteX,MDMX)，阻断MDMX与p53的相互作用从而激活p53蛋白的活性，达到抑制与p53蛋白相关疾病。

有益效果

本发明式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物能够用于制备p53蛋白激活剂。

本发明式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物能够在4h-8h显著提升p53蛋白含量，一定剂量的式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物可以用于提升p53蛋白含量。

式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物通过直接结合MDMX，阻断MDMX-p53的相互作用从而激活p53蛋白的活性，达到抑制与p53蛋白相关的药物用途。

附图说明

图1为Western blot检测给药后各时间点MCF-7细胞p53的蛋白表达情况图。

图2为Octet检测式(I)与MDMX蛋白的分子间相互作用图。

具体实施方式

实施例1药理试验

式(I)的吲哚-3-乙醛酰胺衍生物对TP53乳腺癌细胞MCF-7中p53蛋白的影响。

1.将处于对数生长期的MCF-7细胞接种于6cm细胞培养皿，细胞密度为50％，置于含5％的CO

2.待细胞完全贴壁后，弃掉旧培养基。设置4个组别，在其中1个组中加入4ml不含化合物的培养基，另外3组加入4ml含20μM的所述吲哚-3-乙醛酰胺衍生物的培养基。加药完毕后，将4组给药的细胞培养皿置于含5％的CO

3.收样时取出细胞培养皿，弃掉培养基，用4℃预冷的PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入含20％PMSF的RIPA裂解液，冰上孵育5min后，用细胞刮刮下后收集细胞裂解液，装入1.5ml EP管置于冰上充分裂解30min。于4℃，12000rpm离心10min，吸取上清作为蛋白样品。

4.用BCA法测定细胞总蛋白浓度。将浓度为0.5mg/mL的标准蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中作标准品孔，加PBS缓冲液补足到20μL。取1μL样品到96孔板样品孔中，加PBS补足到20μL。按A液:B液＝50:1比例配制适量BCA工作液，震荡充分混匀。每孔加入200μLBCA工作液，摇匀，于37℃条件下静置反应30min。利用多功能酶标仪在562nm波长处检测各孔吸收值，根据标准曲线计算细胞的总蛋白浓度。

5.从各样品中取等量的总蛋白分别与5×蛋白上样缓冲液按1:4比例充分混合，沸水中煮流沸5min使蛋白变性，每孔蛋白的上样量为50μg。

6.在电泳槽内加入电泳缓冲液，接通电源，80V，电泳30min后转为120V，至溴酚蓝条带接近电泳槽边缘。

7.电泳后，采用湿电转膜仪将凝胶上蛋白转移到PVDF膜上，加入缓冲液，80V冰浴转膜时间约为70min。

8.转膜结束后，用1×TBST洗涤PVDF膜，将PVDF膜浸泡于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中，置于摇床上缓慢摇动，室温封闭2～4h。

取出已封闭的PVDF膜，用1×TBST室温洗3次，每次5min。用1×TBST稀释一抗，4℃孵育过夜。

9.一抗孵育后的PVDF膜，用1×TBST室温洗3次，每次5min。然后室温孵育相应辣根过氧化物酶标记山羊抗小二抗稀释液1h，将PVDF膜移入玻璃平皿中用1×TBST洗膜3次，每次5min。

10.将PVDF膜放于细胞培养皿中，置于Image Quant LAS 4000ECL凝胶呈像仪内，据化学发光试剂盒使用说明，等体积混合适量BeyoECLPlusA液和B液，配制成发光工作液；PVDF膜上均匀缓慢滴加发光工作液，使用ECL化学发光系统自动反应，曝光显色。

试验结果如图1所示:式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物在MCF-7细胞中，以GAPDH为内参，保证每个样品中总蛋白量相同，通过比对每个样品中p53蛋白在总蛋白中含量表征给药后4-8h内能明显上调MCF-7中p53的蛋白含量。以上表明，本发明提供的式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物与p53的蛋白相关，式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物能够作为制备p53的蛋白激活剂应用。

而且，通过Octet仪器检测式(I)的吲哚-3-乙醛酰胺衍生物在各个浓度梯度(3.0μM、6.3μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)下与MDMX蛋白每0.2s发生相互作用的响应值。试验结果如图2所示:式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物与MDMX蛋白相互作用的解离常数(KD)为10.6μM，表明式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物与MDMX蛋白有较好的亲和力。

因此，本发明能够解决现有研究中直接靶向MDMX的小分子抑制剂缺乏的问题，通过提供式(I)吲哚-3-乙醛酰胺衍生物直接结合MDMX并阻断MDMX-p53的相互作用从而激活p53蛋白的活性，可以有效提升p53蛋白量，进而用于抑制与p53蛋白相关的药物用途，本发明提供了一种直接靶向MDMX的抑制剂。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内的等同变换均属于本发明的保护范围。