一种测定左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体含量的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种测定左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体含量的方法。

背景技术

乙基锂氨物，化学名为13-乙基-3-甲氧基孕甾-2(3),5(10)-二烯-17β-醇，是合成左炔诺孕酮原料药的中间体，其质量以及成本直接影响后续产品的质量以及成本，从它的分子结构中能看出13、17位手性碳，现有技术尚未公开对乙基锂氨物的异构体进行有效地检测，因此对乙基锂氨物的异构体建立分析方法进行质量控制对左炔诺孕酮原料药及制剂的生产具有重要的意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明提出了一种测定左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体含量的方法，能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物3种异构体含量，有利于提高左炔诺孕酮的产品质量，提高患者用药安全性。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种测定左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体含量的方法，配置含乙基锂氨物的待测溶液，采用高效液相法测定左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体的含量。

进一步地，所述测定左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体含量的方法，包括以下步骤：

(1)配制供试品溶液和对照品溶液；

(2)设置高效液相检测条件；

(3)量取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪检测器，量取对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，分别记录色谱图，测定乙基锂氨物异构体含量。

进一步地，高效液相检测条件为：色谱柱为十八烷基键合硅胶填充剂，规格为250mm×4.6mm,5μm，流动相由水和乙腈组成，柱温30℃，流速1.0mL/min。

进一步地，所述液相色谱仪检测器的检测波长为210nm。

进一步地，所述高效液相测试的流动相中水与乙腈体积比35-45:65-55。

进一步地，供试品溶液的制备包括：取乙基锂氨物10mg置于20ml量瓶中，加溶剂溶解后稀释至刻度，混匀；对照品溶液的制备包括：量取所述供试品溶液1mL置于100mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。

进一步地，供试品溶液色谱图中如有乙基锂氨物异构体峰，乙基锂氨物中3种异构体峰面积和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5％)。

进一步地，所述供试品溶液和对照品溶液中所加溶剂为甲醇。

相比于现有技术，本发明的优点：

(1)本发明采用高效液相色谱法能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体，在本发明的色谱条件下主成分和异构体能很好地分离，ISO-1与主成分分离度为3.1，ISO-2与主成分分离度为1.4，ISO-3与主成分分离度为1.5，且空白溶剂没有微小倒峰干扰，溶剂峰不会干扰主成分的测定。

(2)本发明在各破坏条件下，均未检测出异构体，供试品产生的降解产物与主峰均能有效分离，降解物不干扰异构体的测定，主峰破坏减少量与其含量下降应基本一致，主峰纯度不小于990，各个条件下破坏产生的杂质均可与主峰实现很好地分离，有关物质检测专属性良好。

(3)本发明通过高效液相色谱快速检测左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体，精准、稳定性好，有利于提高左炔诺孕酮的产品质量，提高患者用药安全性。

附图说明

图1为本发明色谱条件下测试色谱图，

其中，图1a为系统适用性图谱，图1b为供试品图谱，图1c为对照品图谱；

图2：为破坏性试验中测试色谱图，

其中，图2a为乙基锂氨物未破坏图谱，图2b为乙基锂氨物-氧化破坏图谱，图2c为乙基锂氨物-高温破坏图谱，图2d为乙基锂氨物-热解破坏图谱，图2e为乙基锂氨物-光照破坏图谱，图2f为乙基锂氨物-酸破坏图谱，图2g为乙基锂氨物-碱破坏图谱。

图3为标准曲线图，

其中，图3a为乙基锂氨物异构体1标准曲线图，图3b为乙基锂氨物异构体2标准曲线图，图3c为乙基锂氨物异构体3标准曲线图，图3d为乙基锂氨物标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

一种测定左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体含量的方法，采用高效液相法测定左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体的含量，具体包括以下步骤：

(1)配制对照品溶液、供试品溶液和混合溶液。

供试品溶液的制备：取乙基锂氨物约10mg置20ml量瓶中，加甲醇溶解后稀释定容，混匀；对照品溶液的制备：精密量取所述供试品溶液1mL置于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液；配制混合溶液进样测试本发明的方法的测试效果，混合溶液的配制为：取乙基锂氨物和乙基锂氨物混旋体适量，用甲醇溶解稀释制成含乙基锂氨物0.5mg/ml和乙基锂氨物混旋体25μg/ml的混合溶液；供试品溶液、对照品溶液和混合溶液中的溶剂均为甲醇；

(2)设置高效液相检测条件；检测条件：十八烷基键合硅胶填充剂为色谱柱，规格为250mm×4.6mm,5μm，流动相由水和乙腈组成，以水为流动相A，乙腈为流动相B，流速为1.0mL/min进行洗脱，水与乙腈的体积比为35-45:65-55；柱温30℃；高效液相色谱仪检测器的检测波长为210nm；

(3)取自身对照溶液10μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰的峰高约为满量程的10％～20％，再精密量取混合溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图1，由图1可知，在此色谱条件下主成分与3个异构体均能很好分离，ISO-1分离度为3.1，ISO-2分离度为1.4，ISO-3与主成分分离度为1.5，且空白溶剂无干扰，此方法适用。

实施例2

对实施例1的检测方法进行方法验证，分别从系统适用性、破坏性试验、定量限、检测限、线性关系、精密度、准确度、溶液稳定性等几个方面进行验证，下面进行详细的说明。

1)系统适用性测定：

取乙基锂氨物混旋体适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml含乙基锂氨物混旋体约1mg的贮备液，移取贮备液适量，加溶剂制成每1ml含混旋体约为10μg的定位溶液。

精密称定供试品适量于量瓶中，加入混旋体贮备液适量于同一量瓶中，用溶剂溶解稀释制成每1ml约含乙基锂氨物约为0.5mg，混旋体约为25μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

分别取空白溶剂、系统适用性溶液及杂质定位溶液各10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，考察各成分的分离情况，结果见表1，由表1可知，在210nm检测波长下，混合溶液出峰顺序为异构体1、异构体2、异构体3、乙基锂氨物，乙基锂氨物、异构体及其他杂质之间均能有效分离，且溶剂峰不干扰乙基锂氨物及异构体的测定。

表1杂质定位及分离度

2)破坏性试验

未破坏溶液：取本品约10mg，置于20ml容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为破坏前溶液。

酸破坏溶液：取本品约10mg，置于20ml容量瓶中，加0.01mol/L的盐酸溶液1ml，室温破坏30分钟，加0.01mol/L的氢氧化钠溶液1ml中和，用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏溶液。

碱破坏溶液：取本品约10mg，置于20ml容量瓶中，加0.01mol/L的氢氧化钠溶液1ml，室温破坏30分钟，加0.01mol/L的盐酸溶液1ml中和，用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏溶液。

氧化破坏溶液：取本品约10mg，置于20ml容量瓶中，加3％的双氧水1ml，室温破坏2小时，用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏溶液。

高温破坏溶液：取本品约10mg，置于20ml容量瓶中，置于105℃烘箱中破坏2小时，冷却至室温，再用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为高温破坏溶液。

热解破坏溶液：取本品约10mg，置于20ml容量瓶中，加适量溶剂溶解，再于90℃水浴锅中破坏2小时，冷却至室温，再用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，作为热解破坏溶液。

光照破坏溶液：取未破坏溶液置于4500lx±500lx紫外100uw下光照3小时，作为光照破坏溶液。

分别取以上供试液各10μl注入色谱仪，记录色谱图，分析各杂质变化。对各种破坏条件下的供试品溶液，采用二极管阵列测定，进行峰纯度或光谱相似度测定。结果见表2，由表2可知，在各破坏条件下，均未检测出异构体，供试品产生的降解产物与主峰均能有效分离，降解物不干扰异构体的测定，主峰破坏减少量与其含量下降应基本一致，主峰纯度不小于990，物料守恒。

表2物料平衡考察结果

3)定量限和检测限试验

取乙基锂氨物混旋体适量，用溶剂溶解后稀释制成每1ml含乙基锂氨物混旋体约10μg的贮备液，用逐级稀释法测其定量限(S/N≥10)、检测限(S/N≥3)。结果见表3，由表3可知，本色谱条件下，乙基锂氨物及其异构体的定量限与检测限符合异构体检查要求。

表3定量限和检测限

4)线性关系

取乙基锂氨物混旋体适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml含乙基锂氨物混旋体约为20μg溶液，作为200％线性贮备液。按表4配制线性溶液。

表4线性溶液配制

注：1#为ISO-2、ISO-3定量限浓度，ISO-1线性考察2#～6#。

精密量取上述溶液10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积A为纵坐标、浓度C为横坐标作线性回归。结果见下表5。

表5线性关系试验结果

已知杂质校正因子计算结果见表6：

计算公式：

式中：K主成分：乙基锂氨物标准曲线斜率；

K杂质：异构体标准曲线斜率。

表6已知杂质校正因子

由表5及表6可知，乙基锂氨物及其异构体在各自相应的浓度范围内与其峰面积呈良好线性(r>0.999)，乙基锂氨物异构体1、2、3校正因子均在0.9～1.1范围内，可按自身对照法计算其含量。

5)进样精密度

取乙基锂氨物混旋体适量，用溶剂溶解并稀释制成每1ml含乙基锂氨物混旋体约10μg的混合溶液，取10μl注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积。结果见表7，由表7可知，连续进样6针，乙基锂氨物及乙基锂氨物异构体峰面积RSD％≤5.0％，进样精密度良好。

表7进样精密度结果

6)溶液稳定性测试

分别对对照品溶液和供试品溶液进行溶液稳定性测试。

对照品溶液稳定性

取乙基锂氨物混旋体适量，用溶剂稀释制成每1ml含乙基锂氨物混旋体约10μg的混合溶液，分别于不同时间进样，考察其日内稳定性。结果见表8，由表8可知，乙基锂氨物及乙基锂氨物异构体对照品在24小时内溶液稳定性良好(RSD≤5.0％)。

表8杂质对照品溶液稳定性结果

供试品溶液稳定性

取本品按拟定方法配制成含乙基锂氨物0.5mg/ml的供试品溶液，分别于不同时间进样，按面积归一化法计算杂质含量，考察其杂质日内稳定性。结果见表9，由表9可知，供试品在32小时内异构体均未检出，无明显变化，稳定性良好。

表9供试品溶液稳定性结果

7)重复性试验

取乙基锂氨物供试品适量置20ml容量瓶，加甲醇溶解后稀释至刻度，制备成每ml约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；移取供试品溶液1ml至100ml，用甲醇稀释至刻度，作为自身对照溶液。

重复测定6份。结果见表10，由表10可知，6个重复性样品检验结果异构体均未检出，重复性良好。

表10重复性结果

8)准确度试验(加样回收率)

取乙基锂氨物混旋体适量，加溶剂溶解稀释制成每1ml含乙基锂氨物混旋体约5μg、10μg、20μg的溶液，作为50％、100％、200％回收率贮备液。

照重复性试验方法，精密称取乙基锂氨物10mg于20ml量瓶，用上述50％、100％、200％回收率贮备液溶解后定容至刻度，每种浓度配制3份。

吸取上述样品各10μl进样，记录各异构体峰面积，计算其回收率及RSD。结果见表11，由表11可知，异构体1回收率及平均回收率在92.86％～102.59％范围内，异构体2回收率及平均回收率在100.02％～106.91％范围内，异构体3回收率及平均回收率在91.10％～99.10％范围内，回收率良好。

表11回收率结果

9)中间精密度

由不同操作人员于不同仪器在不同时间照重复性试验方法对同一批号样品进行异构体含量检查。结果见表12，由表12可知，本品异构体检查方法中间精密度良好。

表12中间精密度试验结果

10)耐用性试验

左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体方法耐用性主要从流动相不同比例、不同柱温及不同流速、不同色谱柱四个方面进行验证。

按照表13条件进行实验，结果见表14，由表14可知，在流动相比例、流速、柱温发生微小变化及更换同型号色谱柱时，左炔诺孕酮中间体乙基锂氨物异构体及乙基锂氨物均能有效分离，对检测结果无明显影响，符合要求，表明本色谱条件耐用性良好。

表13耐用性条件

表14耐用性结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。