OBP促进剂

技术领域

本发明涉及OBP(气味结合蛋白，odorant binding protein)的表达促进剂和促进或抑制OBP的表达的物质的筛选方法。

背景技术

到现在为止大量鉴定了对者们动物有害的物质。然而，也存在未进行是否有害这样的鉴定、是否对身体带来损伤这样的影响不清楚的物质。作为这样的物质的一例，考虑眼睛看不见的小分子、挥发了的物质、蒸气等中包含物质的情况。这样的物质即使接触也没有意识到，可能没有留意而慢性地持续暴露、缓缓受到损伤。

作为防御生物体避免这样的有害物质的方法，在动物中，具有通过眼泪、鼻涕等体液而排出的机制。例如，鼻为通过气味而感知有害物质的传感器，并且具有通过覆盖鼻腔内的粘膜的鼻涕而捕捉有害物质的防御功能。在鼻涕中，包含被称为OBP(气味结合蛋白，odorant binding protein)的蛋白质物质，提示可能通过OBP捕捉有害物质，从而防止来自外部的有害物质向体内侵入。进一步报导了OBP在眼泪、前列腺、乳腺等中也包含(非专利文献1～3)。

对于皮肤，作为防御机制，通过角质层的屏障功能等而阻止大的分子等向皮肤内部的侵入。另一方面，考虑OBP捕捉那样的小分子等可能通过角质形成细胞。关于如何能够防御这样的分子通过皮肤的详细阐述基本没有进展。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平11-286423号公报

专利文献2：日本特开平11-286428号公报

专利文献3：日本特开2012-32287号公报

非专利文献

非专利文献1：FEBS Journal 273(2006)：5131-5142

非专利文献2：Free Radical Research(2014)48(7):814-822

非专利文献3：Biochemical Journal(2001)356(1):129-135

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的之一是提供促进OBP(气味结合蛋白，odorant binding protein)的表达的物质。此外，本发明也将提供促进或抑制OBP的表达的物质的筛选方法作为目的之一。

用于解决课题的手段

令人惊讶的是，本发明者们发现了百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物这样的物质促进OBP的表达。基于这样的看法，本发明者们反复进行深入了研究，从而完成了涉及OBP表达促进剂的本发明。

本申请包含下述发明：

(1)一种OBP(气味结合蛋白，odorant binding protein)表达促进剂，其特征在于，含有选自百合提取物、百叶蔷薇提取物和樱花提取物中的物质作为有效成分。

(2)根据项目1所述的OBP表达促进剂，为了促进表皮细胞和/或角质形成细胞中的OBP的表达而使用。

(3)根据项目1或2所述的OBP表达促进剂，为了促进OBP活性降低了的皮肤中的OBP的表达而使用。

(4)根据项目1～3中任一项所述的OBP表达促进剂，为了提高皮肤的保湿功能和/或屏障功能而使用。

(5)根据项目1～4中任一项所述的OBP表达促进剂，为了降低有害物质对皮肤的损伤而使用。

(6)根据项目5所述的OBP表达促进剂，有害物质从醛、脂肪酸和大气污染物质中选择。

(7)一种美容方法或非治疗方法，包括：应用含有选自百合提取物、百叶蔷薇提取物和樱花提取物中的物质作为有效成分的OBP表达促进剂。

(8)选自百合提取物、百叶蔷薇提取物和樱花提取物中的物质在OBP的表达的促进中的应用。

(9)一种皮肤外用剂，含有OBP表达促进剂，上述OBP表达促进剂含有选自百合提取物、百叶蔷薇提取物和樱花提取物中的物质作为有效成分。

(10)一种皮肤有害物质抑制剂，含有选自百合提取物、百叶蔷薇提取物和樱花提取物中的物质作为有效成分。

(11)一种促进或抑制OBP的表达的物质的筛选方法，包括下述工序：使细胞与该物质接触的工序；测定该细胞中的OBP表达量的工序；确定由该物质的有无引起的OBP表达量的变化的工序。

发明的效果

根据本发明，提供OBP的表达促进剂。该OBP表达促进剂例如可以为了促进OBP活性降低了的皮肤(表皮细胞和/或角质形成细胞)中的OBP的表达而使用，可以为了降低有害物质对皮肤的损伤、提高皮肤的保湿功能和/或屏障功能而使用。此外，通过本发明涉及的筛选方法，可以鉴定作为OBP表达促进剂有用的物质。

附图说明

图1为显示在角质形成细胞和3D皮肤模型中观察OBP(OBP2A和OBP2B)的转录的图。

图2为显示t-2-壬烯醛对敲低了OBP2A/OBP2B的角质形成细胞的存活率带来的影响的图。

图3为显示油酸对敲低了OBP2A/OBP2B的角质形成细胞的存活率带来的影响的图。

图4为显示棕榈油酸对敲低了OBP2A/OBP2B的角质形成细胞的存活率带来的影响的图。

图5为显示显示了OBP捕捉t-2-壬烯醛的状况的模拟结果的图。

图6为显示显示了OBP捕捉油酸的状况的模拟结果的图。

图7为显示显示了OBP捕捉棕榈油酸的状况的模拟结果的图。

图8为显示植物提取物使OBP的转录量增大的图。

图9为显示樱花提取物增大聚丝蛋白的转录量的图。

图10为显示樱花提取物增大激肽释放酶10的转录量的图。

图11为显示樱花提取物增大胱天蛋白酶14的转录量的图。

图12为显示百合提取物增大聚丝蛋白的转录量的图。

图13为显示百合提取物增大激肽释放酶10的转录量的图。

图14为显示百合提取物增大胱天蛋白酶14的转录量的图。

图15为显示樱花提取物和百合提取物改善TEWL的图。

具体实施方式

[气味结合蛋白质]

已知OBP(odorant binding protein；气味结合蛋白质)在许多动物、昆虫中存在，其结构虽然根据种类而各种各样，但是是具有通过3个二硫键而结合的6个半胱氨酸保守的α螺旋结构的10～30kDa的蛋白质。对于脊椎动物，OBP为脂质运载蛋白家族的一部分，具有由反平行β折叠构成的β桶基序。人具有OBP2A、OBP2B、LCN1这3种OBP。OBP2A存在于鼻涕等，与脂肪酸、醛具有高亲和性。OBP2B存在于前列腺、乳腺，LCN1存在于眼泪。

OBP的功能虽然未被充分确立，但报导了作为针对哺乳类的鼻粘膜中的4-羟基-2-壬烯醛的清除剂发挥作用(非专利文献1)、通过牛OBP单体型的过表达从而保护大肠杆菌免受由化学物质引起的氧化应激(非专利文献2)、人眼泪脂质运载蛋白在细胞培养体系中作为可能为有害物质的脂质过氧化产物的氧化应激诱导性清除剂发挥作用(非专利文献3)等，因此提示可能具有进行保护而避免外部有害物质的作用。

本发明者们通过迄今为止的研究，发现了OBP在皮肤中也存在。对于分子量大的有害物质，可以通过角质层等而防止向皮肤内部的侵入，但如果分子量小则可能贯穿角质层而向皮肤内部侵入。可以认为存在于皮肤的OBP发挥进行防御而避免这样的小分子的作用。

[OBP(气味结合蛋白，odorant binding protein)表达促进剂]

本发明的一个侧面涉及OBP(气味结合蛋白，odorant binding protein)表达促进剂。在若干实施方案中，OBP表达促进剂可以含有选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的物质作为有效成分。所谓OBP的表达促进，是指增加OBP的转录产物的量、和/或蛋白质的量。

能够作为OBP表达促进剂的有效成分而使用的物质可以为选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的植物提取物。在若干实施方案中，可以将多种植物提取物组合而混配。

在发明中使用的“植物提取物”，可以使用全植株、叶、花部、茎、根、子实等作为使用部位。另外，在使用花部的情况下，开花时期和大小等没有特别限定，可以使用花瓣、或萼、或包含它们全部。这些植物提取物可以通过本领域技术人员公知的方法而从植物原料提取。植物提取物例如可以使用利用了溶剂的提取法、包含粉碎、压榨工序的方法等本领域技术人员公知的任意方法而获得。

在将植物的提取部位根据需要预先进行水洗而除去了异物后，直接或进行了干燥后，根据需要切细或粉碎，使其与提取溶剂接触而进行提取。提取能够通过按照浸渍法等常规方法与提取溶剂接触来进行，但也可以使用超临界提取法、水蒸气蒸馏法。

作为提取溶剂，可举出水；甲醇、乙醇、丙醇等低级醇类、油醇、硬脂醇、辛基十二烷醇等高级醇类；乙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等多元醇类；乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯、三辛酸甘油酯等酯类；丙酮、甲基乙基酮等酮类；乙基醚、异丙基醚等醚类；正己烷、甲苯、氯仿等烃系溶剂等，它们可以单独使用或二种以上混合使用。

关于使用混合溶剂的情况下的混合比，优选例如如果为水与乙醇的混合溶剂，则以体积比(以下相同)计为1:1～25:1的范围；如果为水与甘油的混合溶剂则为1:1～15:1的范围；或如果为水与1,3-丙二醇或1,3-丁二醇的混合溶剂则为1:1～15:1的范围。

在进行提取物的制备的情况下，pH没有特别限定，但一般而言优选为pH3～9的范围。根据需要可以在上述提取溶剂中混配氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾等碱性调节剂、或柠檬酸、盐酸、磷酸、硫酸等酸性调节剂，以成为所希望的pH的方式调整。

提取温度、提取时间等提取条件根据所使用的溶剂的种类、pH而不同，没有限定，例如，如果是以水或1,3-丁二醇、或水与1,3-丁二醇的混合液作为溶剂的情况，则提取温度只要为0℃～90℃的范围即可，此外提取时间只要为0.5小时～7天即可。

可以在提取处理之前，或与提取处理同时，根据需要对提取部位实施水解处理。由此，可以改善该提取物的皮肤刺激性、有效性或保存稳定性等从而能够更有效地利用提取物。

此外，可以使用市售的植物提取物。

在若干实施方案中，可以将本公开的OBP表达促进剂混配于例如化妆料、医药部外品、药品、功能性食品等组合物。在混配于化妆料的情况下，虽然没有限定，但是可以混配于防晒、化妆水、美容液、乳液、美容霜、晒后护理液等应用于皮肤的任意化妆料。通过将这样的组合物向例如OBP活性降低了的对象施与从而可以预防/改善由皮肤有害物质引起的损伤。

本发明涉及的OBP表达促进剂在不损害其效果的范围，可以根据需要适当混配在化妆品、药品等中使用的任意混配成分。作为上述任意混配成分，可举出例如，油分、表面活性剂、粉末、色料、水、醇类、增稠剂、螯合剂、有机硅类、抗氧化剂、紫外线吸收剂、保湿剂、香料、各种药效成分、防腐剂、pH调节剂、中和剂等。作为其它成分，可以包含例如抗炎症成分、美白成分等。

OBP表达促进剂中包含的提取物的混配量只要是本领域技术人员就能够适当设定。

在若干实施方案中，OBP表达促进剂可以为了促进皮肤组织、特别是表皮细胞和/或角质形成细胞中的OBP的表达而使用。

本公开涉及的OBP表达促进剂通过应用于肌肤，从而可以在用于实现表皮细胞和/或角质形成细胞中的OBP的表达促进的美容方法中利用。这样的美容方法中的本公开涉及的皮肤外用剂的用法、用量没有特别限定，根据剂型、进行处置的皮肤的状态来适当确定，但典型地，可以每1天数次例如1次～5次，适量例如每1平方cm

在若干实施方案中，OBP表达促进剂可以为了促进OBP活性降低了的皮肤中的OBP的表达而使用。作为OBP活性降低的原因，可举出例如，老化、疲劳等。

例如，在由于老化、疲劳等而OBP活性降低了的情况下，有害物质不能通过OBP充分捕捉而侵入到皮肤内部的可能性增加。本发明在预防皮肤有害物质对OBP活性降低了的皮肤带来损伤这方面也是有用的。这里，在本说明书中所谓OBP活性的降低，是指OBP的量、表达量、和/或功能减少，例如，有时是指OBP基因的表达量和/或OBP蛋白质的量与活性未降低的状态相比，例如以显著性水平为5％的统计学上的显著性差异(例如，Dunnett检验等)而减少，或例如减少5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％。只要是本领域技术人员，就能够使用公知的方法评价OBP活性的降低。

在若干实施方案中，OBP表达促进剂可以为了提高皮肤的保湿功能和/或屏障功能而使用。

位于构成表皮的四层之中的最外层的角质层在皮肤的最外侧，具有防止来自外界的异物的侵入的屏障功能、和抑制来自体内的水分的蒸发的保湿功能。如果角质层的屏障功能、保湿功能降低，则引起肌肤粗糙、干燥肌肤等各种问题。如果皮肤的屏障功能丧失，则皮肤的水分丧失，此外发生来自外部的异物的侵入，成为敏感肌肤、干燥肌肤、肌肤粗糙、以及皮炎和变态反应等的原因。作为皮肤的屏障功能的指标，可举出例如，经表皮水分蒸发量(TEWL)、对使用了色素等指标物质的皮肤的渗透度等。皮肤的TEWL可以使用Vapometer等装置来测定。

通过促进OBP的表达，来防止皮肤有害物质对皮肤带来损伤，从而能够达到皮肤的保湿功能和/或屏障功能的提高。

在若干实施方案中，OBP表达促进剂可以为了降低有害物质对皮肤的损伤而使用。

皮肤损伤是指由有害物质引起的皮肤状态的恶化，可举出例如，包含人的动物的皮肤的减薄、毛孔的引人注目、毛孔研钵状部的扩大、肌理的紊乱、和/或角化不全等。然而，皮肤损伤由于根据皮肤有害物质的种类而不同，因此没有限定。

有害物质例如可以为醛、脂肪酸、大气污染物质等。醛例如可以为正己醛、正庚醛、正壬醛、正癸醛、十一烷醛、正十二烷醛、苯甲醛、α-甲基-3,4-(亚甲基二氧基)-氢化肉桂醛、或2-甲基-3-(4-叔丁基苯基)-丙醛，但不限定于这些。脂肪酸例如可以为辛烷酸(辛酸)、癸烷酸(癸酸)、十二烷酸(月桂酸)、十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕榈酸)、12-溴十二烷酸(BrC12-Ac)、或15-溴十五烷酸(BrC15-Ac)，但不限定于这些。大气污染物质例如可以为硫氧化物(SOx)、氮氧化物(NOx)、光化学氧化剂(Ox)、粒子状物质(PM)、悬浮粒子状物质(SPM)、或微小粒子状物质(PM2.5)，但不限定于这些。有害物质的例子在本说明书的其它部分中也被记述了。

[美容方法和非治疗方法]

本发明的一个侧面涉及包括应用OBP表达促进剂的美容方法或非治疗方法。在若干实施方案中，OBP表达促进剂可以含有选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的物质作为有效成分。这样的方法为以美容作为目的的方法，不是医生、医疗从业者的治疗所使用的方法。应用的对象例如为哺乳动物、特别是人。应用部位例如可以为面部、颈、头皮、手臂、脚等的皮肤。应用可以以通过手、涂抹工具等进行的涂抹等任意的方式进行。应用的次数、频率、量等根据所希望的效果等来适当设定。

[应用]

本发明的一个侧面涉及选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的物质在OBP的表达的促进中的应用。从其它观点来说，本发明的一个侧面涉及用于OBP的表达的促进的选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的物质。本说明书所公开的数据证实了选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的物质对OBP的表达促进是有用的。因此，可以使用上述植物提取物，制备用于OBP的表达促进的组合物。即，本发明的一个方案也涉及选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的物质在用于促进OBP的表达的组合物(例如，皮肤外用剂)的制造中的应用。

[皮肤外用剂]

本发明的一个侧面涉及含有OBP表达促进剂的皮肤外用剂，上述OBP表达促进剂含有选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的物质作为有效成分。

在若干实施方案中，OBP表达促进剂能够作为可以直接应用于皮肤的皮肤外用剂而被混配。在这样的皮肤外用剂中，除了植物提取物以外，还可以根据需要适当混配在化妆品、药品等中使用的任意混配成分。此外，皮肤外用剂可以以外用固体制剂、外用散剂、外用液剂、搽剂、喷雾剂、外用气雾剂、泵喷雾剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、贴附剂、胶带剂、巴布剂等任意的形态制备。

本公开涉及的皮肤外用剂的剂型没有特别限定，可以采用例如，溶液系、增溶系、乳化系、粉末分散系、水-油二层系、水-油-粉末三层系、软膏、凝胶、气雾等任意的剂型。此外，使用形态也没有特别限定，可以采用例如，化妆水、乳液、霜、精华、胶冻、凝胶、软膏、面膜(パック)、面膜(マスク)、粉底等任意的形态。

[皮肤有害物质抑制剂]

本发明的一个侧面涉及含有选自百叶蔷薇提取物、樱花提取物和百合提取物中的物质作为有效成分的皮肤有害物质抑制剂。

在本申请发明中，皮肤有害物质是指对皮肤带来损伤，通过OBP2A和OBP2B等OBP而活性被抑制的物质。所谓通过OBP而活性被抑制的，有时是指OBP存在的情况与不存在的情况相比皮肤有害物质的量、表达量、和/或皮肤有害作用例如以显著性水平为5％的统计学上的显著性差异(例如，Dunnett的检验等)而减少，或例如减少5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％。例如，如果使用OBP敲低的皮肤细胞，则与使用了非敲低的皮肤细胞的情况相比细胞的存活率低的情况下，可以将这样的物质作为皮肤有害物质而检测出。

所谓OBP敲低的皮肤细胞，是指例如，对OBP2A和OBP2B的一者或两者的基因实施敲低了处置，OBP表达受损或减少了的角质形成细胞等皮肤细胞。敲低处置可以使用例如，SciRep.2018Oct23；8(1):15610.等所记载那样的任意的公知技术。所谓非敲低的皮肤细胞，是指对在上述敲低的细胞中被敲低了的OBP基因未实施敲低处置，OBP表达正常的皮肤细胞。所谓通过敲低处置而OBP表达受损或减少了，有时是指实施了敲低处置的细胞的OBP基因的表达量和/或OBP蛋白质的量与非敲低细胞相比，例如以显著性水平为5％的统计学上的显著性差异(例如，Dunnett的检验等)而减少了，或例如减少5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％。

作为有害物质，虽然没有限定，但除了上述有害物质以外，还可以举出甲醛、乙醛、丙酸、正戊酸、正丁酸、异戊酸、乙酸乙酯、甲基异丁基酮、异丁醇、丙醛、丁醛、异丁醛、戊醛、异戊醛、壬烯醛这样的醛等恶臭物质、烯丙基硫醇、二甲基三硫化物等应激臭物质、油酸、棕榈油酸等不饱和脂肪酸等脂肪酸这样的对OBP的亲和性高的物质、例如公知作为Biochemistry.2002Jun11；41(23):7241-52.等所记载的OBP的配体的物质。

本发明者们鉴定了油酸、棕榈油酸、和壬烯醛作为皮肤有害物质。报导了油酸、棕榈油酸引起毛孔的扩大、毛孔研钵状部的扩大、肌理的紊乱、不全角化(J InvestDermatol.2005May；124(5):1008-13.,Br J Dermatol.2009Jan；160(1):69-74.)。壬烯醛(2-壬烯醛)在本说明书中是指反式体(t-2-壬烯醛)，报导了与老年臭、皮肤黄色化有关系(专利文献1～3)，但本发明者们发现了壬烯醛发挥以皮肤减薄为代表的皮肤有害作用(参照实施例)。

[筛选方法]

本发明的一个侧面涉及促进或抑制OBP的表达的物质的筛选方法。在若干实施方案中，本发明涉及的筛选方法可以包括下述工序：使细胞与物质接触的工序；测定细胞中的OBP表达量的工序；确定由物质的有无引起的OBP表达量的变化的工序。

细胞例如可以为表皮细胞或角质形成细胞。细胞与试验物质的接触例如可以通过在细胞的培养培养基中添加试验物质而进行。OBP表达量的测定可以通过本领域技术人员公知的任意的方法而进行。例如，可以通过RT-PCR等而定量OBP的mRNA量，或可以通过ELISA、蛋白质印迹而定量OBP的蛋白质的量。在观察到了由物质的有无引起的OBP表达量的变化的情况下，在表达量增加了的情况下，评价试验物质促进OBP的表达，在表达降低了的情况下，评价试验物质抑制OBP的表达。

促进或抑制OBP的表达的物质例如可以为化合物库、微生物/动植物等的提取物的库所包含的物质，例如植物提取物、低分子化合物、高分子聚合物、蛋白质、肽、抗体、酶、核酸、糖链、脂质等任意的物质、和包含它们的组合物。作为植物提取物组合物，作为一例，可举出芦荟提取物、银杏提取物、乌龙茶提取物、姜黄提取物、姜黄根茎提取物、汉城细辛根茎/根提取物、高山火绒草提取物、橄榄叶提取物、水解丝粉、茵陈蒿提取物、茵陈蒿花提取物、甘草提取物、树莓提取物、栀子提取物、桑提取物、龙胆根提取物、尼泊尔老鹳草提取物、茶提取物、咖啡提取物、芝麻提取物、米糠提取物、阳桃叶提取物、细辛提取物、樱叶提取物、银耳多糖体、阳桃叶提取物、蓍提取物、药鼠尾草提取物、药鼠尾草叶提取物、川芎提取物、玉米提取物、蕺菜提取物、番茄提取物、欧芹提取物、葡萄籽提取物、红花提取物、牡丹提取物、桑根皮提取物、圣母百合根提取物、月见草种子提取物、百合提取物、松雀茶提取物、迷迭香提取物等。

在本说明书中提及的全部文献其整体通过引用而被合并到到本说明书中。以下说明的本发明的实施例仅以例示作为目的，不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅通过权利要求书的记载而被限定。以不超出本发明的宗旨作为条件，可以进行本发明的变更例如本发明的构成要件的追加、删除和置换。

实施例

接下来通过实施例进一步详细地说明本发明。另外，本发明不限定于此。

实施例1：皮肤中的OBP的表达

角质形成细胞人表皮细胞通过利用Humedia-KG2(クラボウ)培养基在37℃下培养来制备。对于三维表皮模型的构建，在用在DPBS中稀释了50倍的CellStart(InvitrogenLifeTechnologies)液进行了涂布的细胞培养插件(φ12mm，多孔膜的平均孔径：0.4μm)中接种在CnTPrime培养基(CELLnTEC)溶液中进行了稀释的人表皮细胞(2.2×10

从通过上述方法进行制备、在Humedia-KG2(クラボウ)培养基中加入了Ca 1.8mM的条件下分化了0、24、或48小时的表皮细胞、以及分化了7天或14天的三维表皮模型使用ISOGEN(ニッポンジーン)提取RNA，使用SuperScript IV VILO MasterMix(ThermoFisherScientific)制作cDNA，通过使用了SYBRTM Green PCR MasterMix(ThermoFisherScientific)的qPCR而分析了OBP的表达。

将结果示于图1中。由图1可知，在培养角质形成细胞和三维表皮模型的任一者中确认到OBP2A、OBP2B等OBP的转录，在皮肤中存在OBP。

实施例2：OBP的敲低对细胞的存活率的影响的分析

将10μM的OBP2A与OBP2B的siRNA加入到Lipofectamine RNAiMAX TransfectionReagent(Thermo FisherScientific)与Opti-MEM IReduced SerumMedia(ThermoFisherScientific)的混合溶液中，将其添加到通过上述方法进行了培养的表皮细胞中培养24小时从而制作出OBP2A和OBP2B的双重敲低细胞。对照细胞不进行上述敲低处理，除此以外，在相同条件下培养使其分化了24小时。

使用如上述那样进行了培养和分化的双重敲低细胞和对照细胞，通过使用了Human odorant binding protein 2A ELISA Kit(MYBioSource)，Human odorant bindingprotein 2B ELISA Kit(MYBioSource)的ELISA而测定了OBP蛋白量，结果确认了47％的OBP2A和60％的OBP2B的蛋白量减少了。

作为皮肤有害物质的例子，制作出包含壬烯醛等醛类、油酸、棕榈油酸等脂肪酸等的多种试样。

表1

使用如上述那样操作而进行了分化和培养的对照细胞和双重敲低细胞，评价了由皮肤有害物质造成的影响。丢与仅对照细胞的体系、在对照细胞中添加了有害物质的体系、在双重敲低细胞中添加了有害物质的体系各自，在从添加起24小时后，通过上述方法而测定了细胞存活率。有害物质分别以壬烯醛成为25μM的浓度、油酸成为100μM的浓度、棕榈油酸成为50μM的浓度的方式添加了。

将结果示于图2～4中。由图2观察到了，如果在scRNA细胞中添加壬烯醛则存活率显著减少了，但对于OBP敲低细胞如果添加壬烯醛则其细胞存活率进一步大幅减少了。由这些结果显示出，壬烯醛作为皮肤有害物质发挥作用，使细胞的存活率降低。此外，关于图5和6，也通过同样的方法，显示出油酸和棕榈油酸作为皮肤有害物质发挥作用，细胞的存活率降低。

实施例3：关于采用OBP的皮肤有害物质的捕捉的分析

通过使用了Autodock(4.2.6)、Pymol(2.2.0)的模拟而进行了OBP和3种的物质(壬烯醛、油酸、棕榈油酸)的结构分析。将结果示于图5～7中。图5～7显示出这些物质都被OBP的结合口袋捕捉。

实施例4：由植物提取物引起的OBP表达促进的评价

对于若干植物提取物，即，百叶蔷薇提取物、樱花提取物、百合提取物，用细胞调查了促进OBP的转录的效果。

作为百叶蔷薇提取物，从丸善制药株式会社购入从百叶蔷薇的花提取出的提取物(ROSA CENTIFOLIA FLOWER EXTRACT，BUTYLENE GLYCOL，WATER)而使用(商品名：バラ抽出液BG)。

作为樱花提取物，从オリザ油化株式会社购入在从关山樱(Prunus lannesianaWils.cv.Sekiyama(Rosaceae))的花通过水提取而获得的滤液中加入了1,3-丁二醇的提取物而使用(商品名：コスメハーベスト(注册商标)サクラ)。该制品在关山樱(Prunuslannesiana Wils.cv.Sekiyama(Rosaceae))的花中加入乙醇，除去了香气成分、油分后，加入纯化水进行过滤，在所得的滤液中加入1,3-丁二醇，进行过滤而制成制品。

作为百合提取物，从CRODA社购入由微波提获得到的白花百合(百合)的提取物(Glycerin，Butylene Glycol，Water，Lilium Candidum Flower Extract)而使用(商品名：Phytofleur(商标)Lily NP)。

将人表皮细胞利用Humedia-KG2(クラボウ)培养基在37℃下进行了培养直到变为全汇合后，将各植物提取物添加于培养基。在对照中添加了相同量的作为溶剂的Humedia-KG2培养基。添加后24小时在37℃下培养，从添加后的细胞提取总RNA，将其通过反转录而制作了cDNA后，对OBP基因进行了定量PCR。将结果示于图8中。值显示将对照设为1时的相对值。统计分析通过对照相对于各植物提取物中的双侧t检验而进行。

作为结果明确了，这些植物提取物与对照(control)相比，提高OBP基因的转录。因此，这些植物提取物可以作为OBP表达促进剂而使用。

实施例5：由樱花提取物带来的皮肤的屏障功能的改善

对作为皮肤屏障功能的标记基因而公知的基因，调查了樱花提取物带来的效果。作为标记基因，选择了聚丝蛋白(例如，参照“Filaggrin and Skin Barrier Function”doi:10.1159/000441539)、激肽释放酶10(例如，参照“Epidermal Barriers”doi:10.1101/cshperspect.a018218)、胱天蛋白酶14(例如，参照“Phospho-ΔNp63αregulates AQP3,ALOX12B,CASP14and CLDN1 expression through transcription and microRNAmodulation”doi:10.1016/j.febslet.2013.09.023)。

将人表皮细胞利用Humedia-KG2(クラボウ)培养基在37℃下进行了培养直到变为全汇合后，将樱花提取物BG30添加于培养基。在对照中添加了相同量的作为溶剂的Humedia-KG2培养基。添加后24小时在37℃下培养，从添加后的细胞提取总RNA，将其通过反转录而制作出cDNA后，对各基因(聚丝蛋白、激肽释放酶10、胱天蛋白酶14)进行了定量PCR。将结果示于图9～11中。值显示将对照设为1时的相对值。统计分析通过双侧t检验而进行。

结果显示出，樱花提取物促进这些基因的转录，使皮肤的屏障功能提高。因此，包含樱花提取物的OBP表达促进剂可以为了使皮肤的屏障功能提高而使用。此外，樱花提取物能够作为皮肤屏障功能改善剂的有效成分而使用。

实施例6：由百合提取物带来的皮肤的屏障功能的改善

代替樱花提取物而使用百合提取物，进行了与实施例5同样的实验。将结果示于图12～14中。值显示将对照设为1时的相对值。

结果显示出百合提取物促进聚丝蛋白、激肽释放酶10、和胱天蛋白酶14的转录，使皮肤的屏障功能提高。因此，包含百合提取物的OBP表达促进剂可以为了使皮肤的屏障功能提高而使用。此外，百合提取物能够作为皮肤屏障功能改善剂的有效成分而使用。

实施例7：由樱花提取物和百合提取物带来的经表皮水分蒸发量(TEWL)的改善

皮肤的屏障功能可以通过经皮水分蒸发的抑制而评价，经表皮水分蒸发量(TEWL)越小则可以视为屏障功能越优异。

在用在DPBS中进行了50倍稀释的CellStart(Invitrogen Life Technologies)液进行了涂布的细胞培养插件中接种在CnT Prime培养基溶液中进行了稀释的人表皮细胞细胞，将CnT Prime培养基溶液加入插件下在37℃下培养了3天。然后，将插件上的培养基置换为加入了维生素C的CnT-PR-3D培养基，在37℃下培养了1天。在1天后，吸取插件上的培养基，将插件下的培养基置换为加入了维生素C的CnT-PR-3D培养基，在37℃下培养了1天。通过进行该操作8天从而构建了3D皮肤模型。在皮肤模型完成的3天前添加樱花提取物或百合提取物，进而在对照中添加相同量的作为溶剂的乙醇，在37℃下培养了3天。通过经时测定培养后的3D皮肤模型的重量从而测定了TEWL。

结果显示出，樱花提取物和百合提取物使经表皮水分蒸发量(TEWL)显著降低。该结果也显示出，樱花提取物、百合提取物等OBP表达促进剂可以为了使皮肤的屏障功能提高而使用。

在以上实验中，证实了若干植物提取物促进OBP的表达。因此，根据本发明，提供包含上述物质的OBP的表达促进剂。该OBP表达促进剂例如可以为了促进OBP活性降低了的皮肤(表皮细胞和/或角质形成细胞)中的OBP的表达而使用，可以为了降低有害物质对皮肤的损伤、提高皮肤的保湿功能和/或屏障功能而使用。此外，通过本发明涉及的筛选方法，从而能够鉴定作为OBP表达促进剂有用的物质。