一种检测唾液中新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及的是新型冠状病毒检测试剂盒领域，G01N33/569，尤其涉及一种检测唾液中新型冠状病毒中和抗体的试剂盒及应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科、冠状病毒属，是一种单股正链RNA病毒，也是一种广泛存在的人兽共患病。该病毒具有包膜结构，其主要的结构蛋白由刺突蛋白(S)、基质蛋白(M)、小包膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)组成。SARS CoV 2通过其表面刺突蛋白的受体结合域(RBD)与宿主细胞的人血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合，使病毒进入宿主细胞并进行病毒复制。针对S-RBD产生的特异性抗体即中和抗体可以阻断新冠病毒与ACE2结合，从而使病毒不能入侵。中和抗体具有特异性强、亲和力高的特点，与传统的临床上检测的IgM、IgG、IgA抗体在功能上有着较大的不同，是疫苗研发和临床评价过程中重要的指标之一，机体内中和抗体水平是免疫保护效力评价的主要指标。因此，建立快速检测新冠中和抗体的方法十分有意义。

专利申请CN202010218566.7公开了一种新型冠状病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，通过将新冠病毒抗原包被在包被板上，形成预包被新冠病毒抗原的包被板，检测时，需要将待检测血液样本稀释后滴入包被板上，然后采用酶联免疫反应进行测定，该测定方法需要用到特定仪器，而且样本为血液，属于有创取样，而且操作复杂，不适合普通人群适用。

唾液中的免疫球蛋白主要有2类：IgA(90％-98％)和IgG(1％-10％)，其余为极少量的IgM、IgD和IgE。血清中的IgG和IgA通过龈沟液、黏膜渗出液、唾液腺腺泡的超滤作用进入口腔，实现唾液中新型冠状病毒抗体的检测。专利申请CN202011230093.9公开了一种新冠病毒检测试纸条及其制备方法和使用方法，主要包括样品垫、金标记垫、检测垫和吸水板，通过唾液酸小分子与新冠病毒表面S蛋白识别结合来进行检测，该检测试纸条能快速、便捷地对样本极性判定，但是金标记垫的稳定性、灵敏度差，而且价钱昂贵。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种简单快捷的唾液新冠中和抗体的检测试剂盒，包括检测板和干燥剂。

在一些优选的实施方式中，所述检测试剂盒的制备方法为：将检测板和干燥剂于密封袋内密封，即得。

在一些优选的实施方式中，所述检测板包括：试剂条、吸液棒和塑料件。

在一些优选的实施方式中，所述试剂条包括：样品垫、试剂垫、NC膜、吸水纸、底板。

在一些优选的实施方式中，所述吸液棒为PBS缓冲液处理后的吸液棒；优选地，所述处理方法为将吸液棒浸没于PBS缓冲液至吸液棒完全浸透，烘干过夜。

在一些优选的实施方式中，本申请对PBS缓冲液的用量不做具体限定；优选地，所述PBS缓冲液的用量300mL/1000个吸液棒。

在一些优选的实施方式中，所述PBS缓冲液的摩尔浓度为30-65mM；优选地，所述PBS缓冲液的摩尔浓度为50mM。

在一些优选的实施方式中，所述PBS缓冲液中含有0.25-0.35mg/mL的二水合磷酸二氢钠、2-4mg/mL的十二水合磷酸氢二钠、0.7-1.0％(w/v)氯化钠；优选地，所述PBS缓冲液的组成包括：0.2968mg/mL的二水合磷酸二氢钠、2.98mg/mL的十二水合磷酸氢二钠、0.85％(w/v)氯化钠。

在一些优选的实施方式中，所述样品垫选自滤纸、玻璃纤维、无纺布、聚酯膜中的一种；优选地，所述样品垫为玻璃纤维；进一步优选地，所述样品垫为处理液处理后的玻璃纤维。

在一些优选的实施方式中，所述玻璃纤维的尺寸为254mm×300mm。

在一些优选的实施方式中，所述处理液处理具体为每张玻璃纤维用40mL的样品垫处理液浸润至表面无气泡，烘干过夜，随后裁切为20mm宽，干燥封存。

在一些优选的实施方式中，所述处理液为四硼酸钠缓冲水溶液。

所述四硼酸钠缓冲水溶液为0.05-0.2M；优选地，所述四硼酸钠缓冲水溶液为0.1M。

在一些优选的实施方式中，所述处理液中还含有：0.2-0.7％(w/v)CaseinNa、0.8-2.0％(w/v)EDTA、0.1-0.3％(w/v)胆酸钠、0.3-2.5％(w/v)BSA、3-6％(w/v)表面活性剂；优选地，所述处理液中还含有：0.5％(w/v)CaseinNa、1％(w/v)EDTA、0.3％(w/v)胆酸钠、1％(w/v)BSA、4％(w/v)表面活性剂。

在一些优选的实施方式中，所述表面活性剂包括Tetronic 1307、S17(表面活性剂S17 RHODASURF ON-870)、CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)、Tritonx-100中的至少一种；优选地，所述表面活性剂为Tetronic 1307、S17、CHAPS、Tritonx-100。

在一些优选的实施方式中，所述Tetronic 1307、S17、CHAPS、Tritonx-100的质量比为1：(0.7-1.3)：(0.8-1.5)：(0.6-1.1)；优选地，所述Tetronic 1307、S17、CHAPS、Tritonx-100的质量比为1：1：1：1。

玻璃纤维作为样品垫结构致密均匀、亲水性好，渗透性快，但易出现样本“回流”现象。本申请人发现通过对样品垫材料进行预处理，特别是处理液中含有0.2-0.7％(w/v)CaseinNa、0.8-2.0％(w/v)EDTA、0.1-0.3％(w/v)胆酸钠、0.3-2.5％(w/v)BSA、3-6％(w/v)表面活性剂、0.05-0.2M四硼酸钠，利用其对样品垫材料进行处理，能够明显改善该情况，同时增加样本的释放速率。推测可能原因是，CaseinNa中含有多种亲水基团和疏水基团，其可与其他组分协同作用，进一步降低样品垫的表面张力，促进唾液样本在样品垫中的润湿分散作用，而在样本进入试剂时，则成为一定的凝胶状，进而起到防止样本回流的现象，增加样品垫表面样本的浓度，同时还具有起到稳定样本的作用，进而提高检测试剂盒的灵敏度和准确率。

在一些优选的实施方式中，所述处理液的用量为30-50mL/每张玻璃纤维；优选地，所述处理液的用量为40mL/每张玻璃纤维。

在一些优选的实施方式中，所述试剂垫通过将稀释液稀释后的S-RBD标记抗体或鼠IgG标记抗体，分别铺于玻璃纤维上，烘干过夜得到；优选地，所述试剂垫的具体制备过程为：将S-RBD标记抗体或鼠IgG标记抗体用40％(v/v)的稀释液稀释15倍后，得到标记稀释液，随后用于处理玻璃纤维，烘干过夜，裁切为5mm宽，干燥封存，即得。

在一些优选的实施方式中，所述40％(v/v)的稀释液为用水将稀释液进行稀释后得到。

在一些优选的实施方式中，所述稀释液为含有蔗糖、海藻糖、TritonX100的Tris缓冲液；优选地，所述稀释液为含有0.8-1.3％(w/v)BSA、8-13％(w/v)蔗糖、3-5.5％(w/v)海藻糖、0.35-0.5％(w/v)TritonX100的65-75mM Tris缓冲液；优选地，所述40％(v/v)的稀释液为含有1％(w/v)BSA、0％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.4％(w/v)TritonX100的70mMTris缓冲液。

需要说明的是，本申请中各物质的百分含量％(w/v)为质量与体积的比，具体单位为1g/100mL。

在一些优选的实施方式中，所述70mM Tris缓冲液为70mM Tris-HCl缓冲液。

在一些优选的实施方式中，所述玻璃纤维的尺寸为200mm×300mm。

在一些优选的实施方式中，所述标记稀释液的用量为10-15mL/每张玻璃纤维；优选地，所述标记稀释液的用量为12mL/每张玻璃纤维。

在一些优选的实施方式中，所述S-RBD标记抗体和鼠IgG标记抗体为纳米碳标记的S-RBD蛋白和纳米碳标记的鼠IgG。

在一些优选的实施方式中，所述纳米碳标记的S-RBD蛋白的制备方法，包括如下步骤：

S1.将纳米碳分散处理后超声均匀；

S2.用MES偶联液分别配制EDC溶液、NHS溶液；

S3.取S1得到的400μL纳米碳于1.5mL离心管中，加入S2中配制得到的EDC溶液、NHS溶液，混匀，静置室温活化20-40min；

S4.于S3中加入0.1M MES偶联液稀释后的标记抗体S-RBD蛋白，室温偶联20-40min；

S5.于S4中依次加入封闭液A和封闭液B，混匀室温封闭25-35min，随后在12000rpm-16000rpm下离心10-20min，并去除上清液；

S6.于S5所得物质中加入纳米碳保存液，超声均匀，随后在12000rpm-16000rpm下离心10-20min，并去除上清液；

S7.与S6所得物质中继续加入纳米碳保存液，超声均匀，4℃保存，即可。

S1中，所述纳米碳分散处理的具体操作包括如下步骤：

(1)将纳米碳用溶剂超声分散；

(2)将(1)得到的纳米碳通过离心、重悬、离心、重悬、超声完成清洗；

(3)将(2)得到的纳米碳进行稀释，保存备用。

优选地，所述S1中纳米碳分散处理的具体操作包括如下步骤：

(1)将纳米碳加入到破碎杯中，加入纯水和5～13％(w/v)的PVP水溶液组成的混合溶剂，在冰水浴中超声12-24h；

(2)将(1)得到的纳米碳分装后，分别加入纯化水，在3000-7500rpm下离心8-15min，然后取其上清液，在8000-12000rpm下离心0.5-1h并去除上清液，加入0.05-0.2M的MES偶联液重悬，在8000-12000rpm下离心0.5-1h并去除上清液，加入0.05-0.15M的MES偶联液重悬、超声完成清洗；

(3)将(2)得到的纳米碳用0.05-0.2M MES偶联液进行调试至A400为0.105±0.005，即可，保存备用。

在一些优选的实施方式中，所述(1)中纳米碳的浓度为9-10mg/mL；优选地，所述(1)中纳米碳的浓度为9.6mg/mL。

在一些优选的实施方式中，所述混合溶剂中纯水和5-13％(w/v)的PVP的体积比为(20-28)：1；优选地，所述混合溶剂中纯水和5-13％(w/v)的PVP的体积比为24：1。

在一些优选的实施方式中，所述(2)中纳米碳分装后与纯化水的体积比为1：(4-6)，纳米碳分装后与0.05-0.2M的MES偶联液的体积比为1：(4-5.5)，纳米碳分装后与0.05-0.15M的MES偶联液的体积比为1：(3-4.5)；优选地，所述纳米碳分装后与纯化水的体积比为1：5，纳米碳分装后与0.05-0.2M的MES偶联液的体积比为1：5，纳米碳分装后与0.05-0.15M的MES偶联液的体积比为1：4。

S2中，所述MES偶联液的摩尔浓度为0.07-0.5M，EDC溶液的终浓度为0.5-1.5mg/mL，NHS溶液的终浓度为0.5-1.7mg/mL；优选地，所述MES偶联液的摩尔浓度为0.1M，EDC溶液的终浓度为0.8mg/mL，NHS溶液的终浓度为0.8mg/mL。

S3中，所述EDC溶液与纳米碳的体积比为1：(3-5.5)，NHS溶液与纳米碳的体积比为1：(3.5-5)；优选地，所述EDC溶液与纳米碳的体积比为1：4，NHS溶液与纳米碳的体积比为1：4。

S4中，所述标记抗体S-RBD蛋白稀释后的浓度为0.3-0.5μg/μL，所述0.1M MES偶联液的加入体积为80～120μL；优选地，所述标记抗体S-RBD蛋白稀释后的浓度为0.4μg/μL，所述0.1M MES偶联液的加入体积为100μL。

S5中，所述封闭液A为47-55mM Tris-HCl水溶液，所述封闭液A中还含有1-3％的BSA，封闭液B为8～15％的Tween20；优选地，所述封闭液A为50mM Tris-HCl水溶液，所述封闭液A中还含有2％的BSA，封闭液B为10％的Tween20。

所述封闭液A与S3中纳米碳的体积比为(0.5-1)：1，所述封闭液B与S3中纳米碳的体积比为(0.1-0.4)：1；优选地，所述封闭液A与S3中纳米碳的体积比为0.75：1，所述封闭液B与S3中纳米碳的体积比为0.25：1。

S6中，所述纳米碳保存液为47-55mM Triss-HCl水溶液，所述纳米碳保存液还含有0.25-0.6％的BSA，纳米碳保存液与S3中纳米碳的体积比为(0.8-1.3)：1；优选地，所述纳米碳保存液为50mM Tris-HCl水溶液，所述纳米碳保存液还含有0.5％的BSA，纳米碳保存液与S3中纳米碳的体积比为1：1。

S7中，所述纳米碳保存液与S3中纳米碳的体积比为(0.3-0.6)：1；优选地，所述纳米碳保存液与S3中纳米碳的体积比为0.5：1。

在一些优选的实施方式中，所述鼠IgG抗体稀释后的浓度为0.3-0.5μg/μL，所述0.1M MES偶联液的加入体积为80～120μL；优选地，所述鼠IgG抗体稀释后的浓度为0.4μg/μL，所述0.1M MES偶联液的加入体积为100μL。

本专利采用了纳米碳标记方法抗体，与胶体金标记方法完全不同，其检测灵敏度高、稳定性好，且碳材料环保，纳米碳原材料比胶体金成本低，纳米碳与NC膜黑白颜色对比更易分辨。本申请人发现通过将纳米碳分散后取400μL，后加入0.3-0.5μg/μL标记抗体S-RBD蛋白、鼠IgG抗体，纳米碳的分散性好，能使抗体充分被纳米碳标记，充分对人体产生的总中和抗体进行检测，提交检测试剂盒的灵敏度，降低检出限。特别是当标记抗体的浓度为0.4μg/μL时，纳米碳与标记抗体的结合性好，标记稳定性增强，同时也改善了纳米碳的储存稳定性和检测试剂盒的分辨率。

在一些优选的实施方式中，所述NC膜为包被有相互平行的检测线T线和质控线C线，检测线T线和质控线C线的间隔距离为5mm，检测线T线靠近试剂垫，质控线C线靠近吸水纸。

在一些优选的实施方式中，所述NC膜的制备方法为：将NC膜粘粘于底板，然后将T线抗体、C线抗体分别包被在NC膜上，烘干过夜，加入干燥剂封存，即可；优选地，所述NC膜的制备方法为：将PVC底板中间处的保护纸撕掉，将NC膜沿上面保护纸的下边缘粘贴，然后采用喷金划膜仪将T线抗体、C线抗体分别包被在NC膜上，烘干过夜，加入干燥剂封存，即可。

在一些优选的实施方式中，所述PVC底板的尺寸为60mm×280mm。

在一些优选的实施方式中，所述NC膜为1UN14ER100020NT。

在一些优选的实施方式中，所述T线抗体为使用包被稀释液将包被抗体S-RBD蛋白稀释后的T线包被液。

在一些优选的实施方式中，所述C线抗体为使用包被稀释液将羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释后的C线包被液。

在一些优选的实施方式中，所述包被稀释液为含有pH为7.4的PBS缓冲溶液；优选地，所述包被稀释液为含有pH为7.4的含有蔗糖的PBS缓冲溶液；进一步优选地，所述包被稀释液为含有pH为7.4的含有10g/L蔗糖的10mM PBS缓冲溶液。

在一些优选的实施方式中，所述T线抗体的质量浓度为1-2mg/mL，C线抗体的质量浓度为1.5-2.5mg/mL；优选地，所述T线抗体的质量浓度为1.5mg/mL，C线抗体的质量浓度为2.0mg/mL。

在一些优选的实施方式中，所述喷金划膜仪的划液量为0.5～1.7μL/cm，划膜速度为50～75mm/s；优选地，所述喷金划膜仪的划液量为1μL/cm，划膜速度为60mm/s。

在一些优选的实施方式中，所述试剂条由样品垫、试剂垫、NC膜、吸水纸粘贴于底板上组成；优选地，所述试剂条的具体制备操作为：将NC膜包被后的底板贴17mm吸水纸，然后依次粘贴宽度为5mm试剂垫(鼠IgG标记抗体)一个、宽度为5mm试剂垫(S-RBD标记抗体)一个、宽度为20mm样品垫一个。

在一些优选的实施方式中，所述检测板的制备方法为将试剂条切割为3-4mm宽，安装到塑料件的底板上，加上上盖，装上吸液棒，压紧盖子，即得。

本发明第二方面提供了一种简单快捷的唾液新冠中和抗体的检测试剂盒在唾液新冠检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本申请所得试剂盒采用纳米碳免疫层析技术，双抗原夹心法检测唾液中新冠中和抗体的含量。试剂条采用NC膜作为基质，试剂垫采用纳米碳标记的S-RBD和鼠IgG，S-RBD蛋白和羊抗鼠IgG作为检测线T和质控线C。检测时唾液样本会在毛细作用下向前层析，试剂垫上的纳米碳标记物会溶解，然后和样本一起向前移动。样本到达检测区后，纳米碳标记的S-RBD、样本中的中和抗体与检测线上包被的S-RBD形成复合物，表现为检测线显灰黑色，样本中的抗体含量与检测线显色强度成正相关。反应结束后，直接肉眼观察显色情况进行测试，通过检测线上纳米碳显色强弱，可判断中和抗体的含量，检测方法简便。

(2)本申请所得检测试剂盒灵敏度高，结果直观，感染风险低、安全无创，是一种简单、准确而又经济的现场快速检测方法。

(3)本申请所得检测试剂盒分辨率高、容易判断，而且样本为唾液，样本采集患者自行收集易接受，且无需考虑保存、运输、处理等不当引起结果误判。

(4)本发明中采用了夹心法检测新冠总中和抗体，选用高特异性的新冠病毒S蛋白的S-RBD，能对人体产生的总中和抗体，包括IgA、IgM和IgG进行有效检测，解决了胶体金竞争法在中和抗体浓度较低时分辨率低，难以判读的问题。

附图说明

图1实施例1所得检测板的结构平面图。

图2实施例1所得检测板的结构剖面图。

图3实施例1所得检测试剂盒阴性样本检测结果。

图4实施例1所得检测试剂盒质控品梯度检测结果。

图5实施例2所得检测试剂盒控品梯度检测结果。

图6实施例2所得检测试剂盒控品梯度检测结果。

附图标记说明：1为吸液棒；2为样品垫；3为试剂垫；4为NC(硝酸纤维素)膜；5为吸水纸；6为底板

具体实施方式

实施例1

1、一种简单快捷的唾液新冠中和抗体的检测试剂盒，包括检测板和干燥剂。

所述检测试剂盒的制备方法为：将检测板和干燥剂于密封袋内密封，即得。

所述检测板包括：试剂条、吸液棒和塑料件。

所述试剂条包括：样品垫、试剂垫、NC膜、吸水纸、底板。

所述吸液棒为PBS缓冲液处理后的吸液棒；所述处理方法为将吸液棒浸没于PBS缓冲液中至吸液棒完全浸透，37℃烘干过夜。

所述PBS缓冲液的用量300mL/1000个吸液棒。

所述PBS缓冲液的摩尔浓度为50mM PBS。

所述PBS缓冲液中含有0.2968mg/mL的二水合磷酸二氢钠、2.98mg/mL的十二水合磷酸氢二钠、0.85％(w/v)氯化钠。

所述吸液棒购买于博滤克斯特种纤维(宁波)有限公司。

所述样品垫为处理液处理后的玻璃纤维。

所述玻璃纤维的尺寸为254mm×300mm(玻璃纤维8964，购买于上海韩以生物科技有限公司)。

所述处理液处理具体为每张玻璃纤维用40mL的样品垫处理液浸润至表面无气泡，37℃烘干过夜，随后裁切为20mm宽，干燥封存。

所述处理液为四硼酸钠缓冲水溶液。

所述四硼酸钠缓冲水溶液为0.1M。

所述处理液中含有0.5％(w/v)CaseinNa、1％(w/v)EDTA、0.3％(w/v)胆酸钠(购买于sigma公司的C1254)、1％(w/v)BSA、4％(w/v)表面活性剂。

所述表面活性剂为Tetronic 1307、S17(表面活性剂S17 RHODASURF ON-870)、CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)、Tritonx-100。

所述Tetronic 1307、S17、CHAPS、Tritonx-100的质量比为1：1：1：1。

所述处理液的用量为40mL/每张玻璃纤维。

所述试剂垫的具体制备过程为：将S-RBD标记抗体用40％(v/v)的稀释液稀释15倍后，得到标记稀释液，随后用于处理玻璃纤维，37℃烘干过夜，裁切为5mm宽，干燥封存，即得。

所述40％(v/v)的稀释液为用水将稀释液进行稀释后得到。

所述稀释液含有1％(w/v)BSA、10％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.4％(w/v)TritonX100的70mM Tris缓冲液。

所述70mM Tris缓冲液为70mM Tris-HCl缓冲液。

所述玻璃纤维的尺寸为200mm×300mm(玻璃纤维KB50，购自上海韩以生物科技有限公司)。

所述标记稀释液的用量为12mL/每张玻璃纤维。

所述S-RBD标记抗体和鼠IgG标记抗体为纳米碳标记的S-RBD标记抗体和纳米碳标记的鼠IgG抗体。

所述纳米碳标记的S-RBD标记抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1.将纳米碳分散处理后超声均匀；

S2.用MES偶联液分别配制EDC溶液、NHS溶液；

S3.取S1得到的400μL纳米碳于1.5mL离心管中，加入S2中配制得到的EDC溶液、NHS溶液，混匀，静置室温活化30min；

S4.于S3中加入0.1M MES偶联液稀释后的标记抗体S-RBD蛋白，室温偶联30min；

S5.于S4中依次加入封闭液A和封闭液B，混匀室温封闭30min，随后在13000rpm下离心15min，并去除上清液；

S6.于S5所得物质中加入纳米碳保存液，超声均匀，随后在13000rpm下离心15min，并去除上清液；

S7.与S6所得物质中继续加入纳米碳保存液，超声均匀，4℃保存，即可。

S1中，所述纳米碳分散处理的具体操作包括如下步骤：

(1)将纳米碳加入到破碎杯中，加入纯水和10％(w/v)的PVP的水溶液组成的混合溶剂，在冰水浴中超声16h；

(2)将(1)得到的纳米碳分装后，分别加入纯化水，在600rpm下离心10min，然后取其上清液，在9800rpm下离心1h并去除上清液，加入0.1M的MES偶联液重悬，在9800rpm下离心1h并去除上清液，加入0.1M的MES偶联液重悬、超声完成清洗；

(3)将(2)得到的纳米碳用0.1M MES偶联液进行调试至A400为0.105±0.005，即可，保存备用。

所述纳米碳购买于北京德科岛金科技有限公司，型号为CNT302。

所述(1)中纳米碳的浓度为9.6mg/mL。

所述混合溶剂中纯水和10％(w/v)的PVP的体积比为24：1。

所述纳米碳分装后与纯化水的体积比为1：5，纳米碳分装后与0.05-0.2M的MES偶联液的体积比为1：5，纳米碳分装后与0.05-0.15M的MES偶联液的体积比为1：4。

S2中，所述MES偶联液的摩尔浓度为0.1M，EDC溶液的终浓度为0.8mg/mL，NHS溶液的终浓度为0.8mg/mL。

S3中，所述EDC溶液与纳米碳的体积比为1：4，NHS溶液与纳米碳的体积比为1：4。

S4中，所述标记抗体S-RBD蛋白稀释后的浓度为0.4μg/μL，所述0.1M MES偶联液的加入体积为100μL。

S5中，所述封闭液A为50mM Tris-HCl水溶液，所述封闭液A中还含有2％的BSA，封闭液B为10％的Tween20(购自VWR的货号0777)。

所述封闭液A与S3中纳米碳的体积比为0.75：1，所述封闭液B与S3中纳米碳的体积比为0.25：1。

S6中，所述纳米碳保存液为50mM Tris-HCl水溶液，所述纳米碳保存液中还含有0.5％的BSA，纳米碳保存液与S3中纳米碳的体积比为1：1。

S7中，所述纳米碳保存液与S3中纳米碳的体积比为0.5：1。

所述纳米碳标记的鼠IgG标记抗体的制备方法具体实施方式同纳米碳标记的S-RBD标记抗体的制备方法。

所述鼠IgG标记抗体稀释后的浓度为0.4μg/μL，所述0.1M MES偶联液的加入体积为100μL。

所述NC膜为包被有相互平行的检测线T线和质控线C线，检测线T线和质控线C线的间隔距离为5mm，检测线T线靠近试剂垫，质控线C线靠近吸水纸。

所述NC膜的制备方法为：将PVC底板中间处的保护纸撕掉，将NC膜沿上面保护纸的下边缘粘贴，然后采用喷金划膜仪将T线抗体、C线抗体分别包被在NC膜上，37℃烘干过夜，加入干燥剂封存，即可。

所述PVC底板的尺寸为60mm×280mm(购自衢州迈科新材料有限公司的MT101200507)。

所述NC膜为1UN14ER100020NT(赛多利斯)。

所述T线抗体为使用包被稀释液将包被抗体S-RBD蛋白稀释后的T线包被液。

所述C线抗体为使用包被稀释液将羊抗鼠IgG稀释后的C线包被液。

所述包被稀释液为含有pH为7.4的含有10g/L蔗糖的10mM PBS缓冲溶液。

所述T线抗体的质量浓度为1.5mg/mL，C线抗体的质量浓度为2.0mg/mL。

所述喷金划膜仪的划液量为1μL/cm，划膜速度为60mm/s。

所述吸水纸购自上药医疗器械(上海)有限公司的21050901产品。

所述试剂条由样品垫、试剂垫、NC膜、吸水纸粘贴于底板上组成；所述试剂条的具体制备操作为：将NC膜包被后的底板贴17mm吸水纸，然后依次粘贴试剂垫、宽度为20mm的样品垫一个。

所述试剂垫为一个宽度为5mm的鼠IgG标记抗体试剂垫和一个宽度为5mm的S-RBD标记抗体试剂垫，两个试剂垫横向并排设置，靠近样品垫的为S-RBD试剂垫，靠近NC膜的为鼠IgG试剂垫。

所述样品垫和试剂垫的长度与PVC底板的长度相同。

所述检测板的制备方法为将试剂条切割为3-4mm宽，安装到塑料件的底板上，加上上盖，装上吸液棒，压紧盖子，即得(如图1、图2所示)。

2、一种简单快捷的唾液新冠中和抗体的检测试剂盒在唾液新冠检测中的应用。

实施例2

1、一种简单快捷的唾液新冠中和抗体的检测试剂盒，与实施例1的不同之处在于：

所述处理液中含有：1.0％(w/v)CaseinNa、1％(w/v)EDTA、0.5％(w/v)胆酸钠、1％(w/v)BSA、4％(w/v)表面活性剂。

2、一种简单快捷的唾液新冠中和抗体的检测试剂盒在唾液新冠检测中的应用。

实施例3

1、一种简单快捷的唾液新冠中和抗体的检测试剂盒，与实施例1的不同之处在于：

所述纳米碳标记的S-RBD标记抗体的制备方法中，

S3.取S1得到的200μL纳米碳于1.5mL离心管中，加入S2中配制得到的EDC溶液、NHS溶液，混匀，静置室温活化30min。

2、一种简单快捷的唾液新冠中和抗体的检测试剂盒在唾液新冠检测中的应用。

性能测试

将实施例及对比例所得检测试剂盒用于真实样本检测。

(1)阴性样本：选择未接种疫苗的人唾液作为阴性样本；

按照试剂盒说明书操作：将吸液棒分别置于舌上、口腔上下颚和口腔内壁刮拭5次，然后置于舌上口含，待观察窗口出现液体时到达T位置即可结束取样取出，盖上盖子，平放桌面，开始计时。15min判读结果。测试结果如图3所示。

测试结果均为阴性，说明阴性样本测试质控线正常。

(2)质控品梯度检测

用一次性尿杯收集未接种疫苗的人的唾液作为稀释液，稀释中和抗体质控品到不同浓度2.5μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL。

用移液器吸取唾液稀释的样本450μL直接加到实施例1-3所得检测板吸液棒上，待观察窗口出现液体时到达T位置，开始计时15min判读结果。下面的数值代表我们的检测结果，(根据色度卡判别)：C3.5代表弱阳，C5代表中阳，C7代表强阳。

实施例1所得检测试剂盒的检测结果如图4所示：在0.1μg/mL时检测结果有C3.5(弱阳)，再小0.05μg/mL检测结果C3及以下为阴性，说明我们的灵敏度达0.1μg/mL，对质控品0.5μg/mL进行重复性检测，结果显色一致，实验结果稳定。

实施例2所得检测试剂盒的检测结果如图5所示：灵敏度仅能检测到0.5μg/mL，弱阳C3.5。

实施例3所得检测试剂盒的检测结果如图6所示：灵敏度仅能检测到0.5μg/mL，弱阳C4。

(3)真实样本检测：利用实施例1所得检测试剂盒进行测定。

按照试剂盒说明书操作：通过检测54个疫苗接种者临床样本：31个接种辉瑞疫苗，18个接种莫德纳疫苗，5个接种强生疫苗。

检测结果45个样本显示阳性；检测64个未接种新冠疫苗者唾液样本，结果显示全部阴性。初步确定试剂盒的敏感性>83％，说明该检测方式可行。

从实施例1-3所得试剂盒检测卡的数据说明，本专利提供的一种夹心法检测唾液中新型冠状病毒中和抗体的检测方法和试剂盒，操作简单，灵敏度高，结果直观，感染风险低、安全无创是一种简单、准确而又经济的现场快速检测方法。