试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及试剂盒和方法。

背景技术

胆固醇为细胞的主要构成成分之一。过量的胆固醇在血管的内皮细胞下被巨噬细胞摄入而形成泡沫细胞、由此而呈现出动脉硬化的早期病变，因此是临床上的重要成分。胆固醇以脂蛋白的形态被转运到血液中。脂蛋白中存在具有不同功能的VLDL(Very LowDensity Lipoprotein，极低密度脂蛋白)、HDL(High Density Lipoprotein，高密度脂蛋白)、LDL(Low Density Lipoprotein，低密度脂蛋白)等。另外，各种脂蛋白可进一步分为亚组分。作为脂蛋白亚组分，HDL可分为颗粒尺寸小、密度相对高的HDL3和颗粒尺寸大、密度低的HDL2。另外，HDL可以根据载脂蛋白E(apoE)含有率的不同而分为含有apoE的HDL(apoEcontaining HDL)和缺乏apoE的HDL(apoE deficient HDL)。VLDL中，存在相对于常规尺寸而言因被脂蛋白脂肪酶分解而小型化的脂蛋白残粒。

包含这些亚组分的脂蛋白中的胆固醇可以使用通用的自动分析装置进行测定。

具体而言，作为脂蛋白中的胆固醇的测定技术，有专利文献1～5中记载的技术。这些技术在对脂蛋白中的胆固醇进行定量时，使用波长600～700nm左右的长波长侧的吸光度测定。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第98/026090号

专利文献2:日本特开平10-038888号公报

专利文献3:国际公开第2012/011554号

专利文献4:日本特开2012-100581号公报

专利文献5:日本特开2013-215169号公报

发明内容

本发明人们对前述的脂蛋白中的胆固醇的定量技术进行了研究，结果明确了在稳定地得到高水准的测定精度方面仍存在改善的余地。

本发明提供高精度且稳定地对脂蛋白中的胆固醇(脂蛋白C)进行定量的技术。

为了对更微量的试样也获得高测定精度，本发明人等对使用波长600～700nm左右的区域中的吸光度测定的脂蛋白C的定量进行了研究。结果发现存在作为新课题的下述情况：在保存用于定量的试剂时试剂劣化，在比定量脂蛋白C的波长区域短的短波长侧出现具有峰的吸收，上述吸收的影响有时在高波长侧也可观测到。此外，明确了：若出现这样的吸收，则对定量脂蛋白C时的吸光度产生影响，因此有时测定精度降低。另外还发现：短波长侧的吸收峰的出现方式可能根据例如测定中使用的试剂的成分、保存条件、保存天数而改变。

因此，为了尽量消除在短波长区域发生的吸收的影响而进行了进一步研究，结果新发现：对于用于识别脂蛋白C的试剂组合物，通过在脂蛋白C的测定波长区域外的特定的波长中将加速试验后的吸光度的比设为特定的范围，从而能够有效地抑制吸收对长波长侧的影响、以高精度进行脂蛋白C的定量，从而完成了本发明。

根据本发明，可提供以下的试剂盒和方法。

[1]一种试剂盒，其为用于识别试样中的除小而密低密度脂蛋白(small denseLDL)以外的脂蛋白中的胆固醇(脂蛋白C)的试剂盒，前述试剂盒包含第1试剂组合物和第2试剂组合物，

前述第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性组成的组中的至少1种活性，

前述第2试剂组合物用于对测定对象的前述脂蛋白C进行定量，

将前述第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且3.50以下，

将前述第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且9.00以下。

[2]根据[1]所述的试剂盒，其中，将前述第1试剂组合物在37℃下保存2周后的前述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且3.00以下。

[3]根据[1]或[2]所述的试剂盒，其中，前述第1试剂组合物具有选自由过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性组成的组中的至少1种活性。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的试剂盒，其中，前述第1试剂组合物包含作用于除测定对象的前述脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的试剂盒，其中，将前述第2试剂组合物在37℃下保存2周后的前述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的试剂盒，其中，前述第2试剂组合物包含作用于测定对象的前述脂蛋白的表面活性剂。

[7]根据[1]至[6]中任一项所述的试剂盒，其中，前述第1试剂组合物满足以下的条件1～3中的1个或2个条件、且

前述第2试剂组合物不满足前述条件1～3中的前述1个或2个条件，满足此外的所有条件。

条件1：包含耦合剂

条件2：包含铁配合物

条件3：具有过氧化物酶活性

[8]根据[1]至[7]中任一项所述的试剂盒，其中，测定对象的前述脂蛋白C为LDL胆固醇、HDL胆固醇、HDL3胆固醇、脂蛋白残粒胆固醇或含有apoE的HDL胆固醇。

[9]一种对试样中的除小而密低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇(脂蛋白C)进行定量的方法，其包括下述工序：

使第1试剂组合物作用于前述试样的工序，前述第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性组成的组中的至少1种活性；和

在使第1试剂组合物作用于前述试样的前述工序之后，使用于对测定对象的前述脂蛋白C进行定量的第2试剂组合物进行作用，由此对残留的脂蛋白中的胆固醇进行定量的工序，

将前述第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且3.50以下，

将前述第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且9.00以下。

[10]根据[9]所述的方法，其中，将前述第1试剂组合物在37℃下保存2周后的前述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且3.00以下。

[11]根据[9]或[10]所述的方法，其中，前述第1试剂组合物还具有选自由过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性组成的组中的至少1种活性。

[12]根据[9]至[11]中任一项所述的方法，其中，前述第1试剂组合物包含作用于除测定对象的前述脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂。

[13]根据[9]至[12]中任一项所述的方法，其中，将前述第2试剂组合物在37℃下保存2周后的前述吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，由ABS360/ABS400表示的比R2为0.90以上且2.50以下。

[14]根据[9]至[13]中任一项所述的方法，其中，前述第2试剂组合物包含作用于测定对象的前述脂蛋白的表面活性剂。

[15]根据[9]至[14]中任一项所述的方法，其中，前述第1试剂组合物满足以下的条件1～3中的1个或2个条件、且

前述第2试剂组合物不满足前述条件1～3中的前述1个或2个条件，满足此外的所有条件。

条件1：包含耦合剂

条件2：包含铁配合物

条件3：具有过氧化物酶活性

[16]根据[9]至[15]中任一项所述的方法，其中，测定对象的前述脂蛋白C为LDL胆固醇、HDL胆固醇、HDL3胆固醇、脂蛋白残粒胆固醇或含有apoE的HDL胆固醇。

根据本发明，可以提供高精度且稳定地对脂蛋白中的胆固醇进行定量的技术。

附图说明

图1为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图2为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图3为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图4为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图5为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图6为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图7为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图8为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图9为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图10为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

图11为示出第1和第2试剂组合物的吸光度测定结果的图。

具体实施方式

以下对实施方式进行说明。本实施方式中，测定试剂等组合物可以单独包含各成分或将各成分组合包含2种以上。另外，本说明书中，数值范围的“x～y”表示“x以上且y以下”，均包括下限值x和上限值y。

首先对脂蛋白和脂蛋白C进行说明。

脂蛋白大致分为乳糜微粒(CM)、VLDL、LDL和HDL，各脂蛋白可进一步分为亚组分。这些组分和亚组分中的一些可以通过颗粒尺寸或比重来区分。其颗粒尺寸的直径根据报告者而不同，VLDL为30nm～80nm(30nm～75nm)，包括IDL(intermediate densitylipoprotein，中间密度脂蛋白)在内的LDL为22nm～28nm(19nm～30nm)，HDL的直径为7～12nm，作为HDL亚组分的HDL3的直径为7～8.5nm，HDL2的直径为8.5～10nm。关于比重，VLDL为1.006以下，IDL为1.006～1.019，LDL为1.019～1.063，HDL为1.063～1.21，HDL2为1.063～1.125，HDL3为1.125-1.210。颗粒直径例如可以通过梯度凝胶电泳(GGE)(JAMA,260,p.1917-21,1988)、NMR(HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、Nader Rifai等编写、AACC PRESS：The Fats of Life Summer 2002、LVDD 15YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16)来测定，比重例如可以基于利用超速离心分离的分析(Atherosclerosis,106,p.241-253,1994:Atherosclerosis,83,p.59,1990)来确定。

HDL胆固醇(HDL-C)和LDL胆固醇(LDL-C)例如可以利用自动分析装置来测定。

另外，HDL可以根据ApoE含量比率的差异而分为含有apoE的HDL和缺乏apoE的HDL这样的亚组分。通常，含有apoE的HDL表示在HDL中含有ApoE，缺乏apoE的HDL表示不含ApoE的HDL。有时将存在ApoE或ApoE含量多的HDL称为富含apoE的HDL(apoE rich HDL)，其也包含在含有ApoE的HDL中。存在于HDL内部的ApoE含量的分布是连续的，因此不能根据脂蛋白中的ApoE含有比明确地分为含有apoE的HDL和缺乏apoE的HDL，但是，例如可以由能够测定包含含有apoE的HDL-C在内的总HDL-C的13％PEG法(J Lipid Research 38,1204-16:1997)，减去不测定含有apoE的HDL-C而仅能测定缺乏apoE的HDL-C的磷钨酸-硫酸葡聚糖-镁沉淀法(PT-DS-Mg法)(BIOCHEMICAL MEDICINE AND METABOLIC BIOLOGY 46,329-343(1991))，从而对含有apoE的HDL-C进行定量。另外，可以利用基于表面活性剂浓度的反应性差异通过自动分析装置测定含有apoE的HDL-C(Ann Clin Biochem 56,123-132(2019))。

脂蛋白残粒是由于代谢综合征等而使脂质代谢停滞时产生的特殊脂蛋白，是CM、VLDL在脂蛋白脂肪酶作用下分解而成的代谢产物。脂蛋白残粒无法用特定的尺寸、比重来定义，可以使用针对脂蛋白中的构成载脂蛋白的抗体的固定化凝胶、磷脂水解酶或表面活性剂等来定量。另外，可以利用胆固醇酯酶因分子量不同而反应性不同这一点，通过自动分析装置测定脂蛋白残粒-胆固醇(脂蛋白残粒-C)(J Applied Laboratory Medicine 3,26-36,(2018))。

本实施方式具体涉及除小而密低密度脂蛋白(sdLDL-C)以外的脂蛋白中的胆固醇(脂蛋白C)的识别或测定。sdLDL通常是指LDL组分中的直径为约22.0～约25.5nm的亚组分或比重为1.040～1.063的亚组分。根据报告人的不同，sdLDL的比重采用何种范围也有一些差异，另外有报告中分级为1.044～1.060(Atherosclerosis:106 241-253 1994)。

本说明书中，称为sdLDL时具体是指：LDL中的比重大、且与除此以外的LDL相比临床上更容易引发动脉硬化。另外，sdLDL优选是指属于LDL的比重范围内高于中间值的比重范围的LDL、更优选是指属于比重1.044～1.063的范围的LDL。

另外，称为除sdLDL以外的脂蛋白时，具体是指乳糜微粒、VLDL、IDL、比重在1.044～1.063的范围外的LDL、HDL、和这些的亚组分。

本实施方式中，测定对象的脂蛋白C例如为LDL胆固醇(LDL-C)、HDL胆固醇(HDL-C)、HDL3胆固醇(HDL3-C)、脂蛋白残粒胆固醇(脂蛋白残粒-C)或含有apoE的HDL胆固醇(apoE containing HDL-C)。

(试剂盒)

本实施方式中，试剂盒用于识别试样中的除小而密低密度脂蛋白(sdLDL-C)以外的脂蛋白中的胆固醇(脂蛋白C)，包含以下的第1试剂组合物和第2试剂组合物。

(第1试剂组合物)

第1试剂组合物为具有选自由胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性组成的组中的至少1种活性的试剂组合物。将第1试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.9以上且3.50以下。

(第2试剂组合物)

第2试剂组合物为用于定量测定对象的脂蛋白C的试剂组合物。将第2试剂组合物在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，由ABS400/ABS450表示的比R1为0.90以上且9.00以下。

本发明人等新发现：在脂蛋白C的测定波长区域外的特定的波长中，通过将第1和第2试剂组合物的加速试验后的吸光度的比设为特定的范围，从而能以高精度对脂蛋白C进行定量。具体而言，发现：作为短波长侧的吸收存在的有无、程度的指标，ABS400/ABS450的比R1是适合的。通过将R1设为上限值以下，从而能够有效地抑制在比脂蛋白C的测定波长区域、例如波长600～700nm的区域低的低波长侧具有峰的吸收对波长600～700nm的区域的干扰，因此能够以高精度进行脂蛋白C的定量。

在此，在脂蛋白C的测定波长区域本身内难以判定干扰的有无，但通过使用观测区域外的400nm和450nm的吸光度、且将第1和第2试剂组合物的加速试验后的吸光度比作为指标，从而能够把握在低波长侧具有峰的吸收的存在、干扰的影响。此外，通过使用R1处于特定的范围的试剂组合物，从而能够改善测定精度。

对于第1试剂组合物，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，从改善脂蛋白C的测定精度的观点出发，由ABS400/ABS450表示的比R1为3.50以下，优选为3.25以下、更优选为3.00以下、进一步优选为2.80以下、进一步更优选为2.60以下、更加优选为2.50以下。

另外，从稳定地对脂蛋白C进行定量的观点出发，第1试剂组合物的R1为0.90以上，另外，也可以为例如0.95以上、或1.00以上。

另外，对于第2试剂组合物，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长400nm处的吸光度设为ABS400、将450nm处的吸光度设为ABS450时，从改善脂蛋白C的测定精度的观点出发，由ABS400/ABS450表示的比R1为9.00以下，优选为8.00以下、更优选为6.00以下、进一步优选为4.00以下、进一步更优选为3.00以下、更加优选为2.50以下、进一步还优选为2.00以下。

另外，从稳定地对脂蛋白C进行定量的观点出发，第2试剂组合物的R1为0.90以上，另外可以为例如0.95以上或1.00以上。

本实施方式中，试剂盒中包含的第1和第2试剂组合物的R1均满足上述条件，因此能够精度良好地测定脂蛋白C。

对于第1试剂组合物，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，从更稳定地改善脂蛋白C的测定精度的观点出发，由ABS360/ABS400表示的比R2例如为3.00以下，优选为2.50以下、更优选为2.20以下、进一步优选为2.00以下、进一步更优选为1.68以下、更加优选为1.60以下。

另外，从进一步稳定地对脂蛋白C进行定量的观点出发，第1试剂组合物的R2例如可以为0.90以上，另外例如可以为0.95以上或1.00以上。

另外，对于第2试剂组合物，在37℃下保存2周后的吸收光谱中，将波长360nm处的吸光度设为ABS360时，从更稳定地改善脂蛋白C的测定精度的观点出发，由ABS360/ABS400表示的比R2例如为3.00以下，优选为2.50以下、更优选为2.00以下、进一步优选为1.70以下、进一步更优选为1.50以下。

另外，从进一步稳定地对脂蛋白C进行定量的观点出发，第2试剂组合物的R2例如可以为0.90以上，另外例如可以为0.95以上或1.00以上。

从进一步改善脂蛋白C的测定精度的观点出发、更优选第1和第2试剂组合物均满足关于R2的上述条件。

本实施方式中，试剂盒用于脂蛋白C的识别或定量，优选用于脂蛋白C的识别和定量。

另外，试剂盒具体用于包括2个以上工序的脂蛋白C的定量方法。此时，第1和第2试剂组合物分别用于不同的工序，优选以第1试剂组合物和第2试剂组合物的顺序使用。

以下对各试剂组合物的构成进行进一步具体地说明。

(第1试剂组合物)

第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性组成的组中的至少1种活性，优选具有胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性。

第1试剂组合物是具有上述1种或2种以上活性的组合物，因此向试样中添加第1试剂组合物时，例如，能够去除试样中的除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白。另外，能够将除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇导出至反应体系外。

在此，“表面活性剂进行作用(反应)”是指：表面活性剂分解脂蛋白、使脂蛋白中的胆固醇游离。例如，称为“作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂(与除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂进行反应)”时，不要求表面活性剂对测定对象的脂蛋白完全不发挥作用，只要主要对除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白进行作用即可。“去除”是指：分解被检体试样中的物质，使得在之后的工序中不会检测出其分解物。即，“去除除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇”是指：分解被检体试样中的除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白，使得在之后的工序中不会检测出作为其分解产物的这些脂蛋白中的胆固醇。

“导出至反应体系外”是指：将测定对象外的脂蛋白中包含的胆固醇去除、使其凝集或对其进行抑制而使其在后续的工序中不反应，从而避免测定对象外的脂蛋白中包含的胆固醇对测定对象的脂蛋白C的定量造成影响。

另外，“具有胆固醇酯酶活性”具体是指：存在胆固醇酯酶且可能发生由胆固醇酯酶催化的反应。对于胆固醇氧化酶活性、鞘磷脂酶活性、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性等其它酶活性也是同样。

接着，对第1试剂组合物中包含的成分进行进一步具体地说明。

作为第1试剂组合物中包含的成分的具体例，可列举例如酶、不具有酶作用的蛋白、表面活性剂、缓冲液、盐、氢供体、耦合剂、铁配合物。

(酶)

第1试剂组合物例如为包含具有选自由胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性组成的组中的至少1种活性的1种或2种以上的酶的组合物，优选包含具有胆固醇酯酶活性的酶和具有胆固醇氧化酶活性的酶。

另外，第1试剂组合物例如为包含选自由胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶组成的组中的至少1种酶的组合物，优选包含胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶。

作为胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，例如可以使用源自细菌、菌类的酶。

对于第1试剂组合物的胆固醇酯酶活性，从将除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇稳定地导出到反应体系外的观点出发，优选为10U/L以上、更优选为300U/L以上、进一步优选为600U/L以上，另外优选为10000U/L以下、更优选为2500U/mL以下、进一步优选为2000U/L以下。

从同样的观点出发，第1试剂组合物的胆固醇氧化酶活性优选为100U/L以上、更优选为200U/L以上、进一步优选为300U/m以上，另外优选为3500U/L以下、更优选为3000U/L以下、进一步优选为2500U/L以下。

第1试剂组合物可以具有上述活性以外的活性，从将试样中的除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇更稳定地导出到反应体系外的观点出发，例如具有选自由过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的至少1种活性，优选为具有选自由过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性组成的组中的至少1种活性。

更具体地，第1试剂组合物可以包含具有上述活性以外的活性的酶。例如，第1试剂组合物还包含具有上述活性以外的活性的酶，优选包含具有选自由过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性和鞘磷脂酶活性组成的组中的至少1种活性的酶，更优选包含具有选自由过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性组成的组中的至少1种活性的酶。

另外，第1试剂组合物例如包含选自由过氧化氢酶、过氧化物酶和鞘磷脂酶组成的组中的至少1种酶，优选包含过氧化氢酶和过氧化物酶中的至少1种。

对于第1试剂组合物的过氧化氢酶活性，从将试样中的除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇更稳定地导出到反应体系外的观点出发，优选为40U/mL以上、更优选为100U/mL以上，另外优选为2500U/mL以下、更优选为2000U/mL以下。

第1试剂组合物具有过氧化氢酶活性时，测定对象的脂蛋白C也优选为HDL-C、LDL-C、HDL3-C、脂蛋白残粒-C或含有apoE的HDL-C。

对于第1试剂组合物的过氧化物酶活性，从将试样中的除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇更稳定地导出到反应体系外的观点出发，优选为400U/L以上、更优选为600U/L以上，另外优选为3000U/L以下、更优选为2000U/L以下。

对于第1试剂组合物的鞘磷脂酶活性，从将试样中的除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇更稳定地导出到反应体系外的观点出发，优选为100U/L以上、更优选为200U/L以上，另外优选为100000U/L以下、更优选为20000U/L以下。

第1试剂组合物具有鞘磷脂酶活性时，测定对象的脂蛋白C还优选为HDL3-C或脂蛋白残粒-C。

另一方面，测定对象的脂蛋白为除sdLDL以外的LDL时，第1试剂组合物优选不具有鞘磷脂酶活性。

作为鞘磷脂酶的具体例，可列举SPC(旭化成公司制)、来自蜡样芽孢杆菌的鞘磷脂酶(Sphingomyelinase from bacillus cereus)、来自金黄色葡萄球菌的鞘磷脂酶(Sphingomyelinase from staphylococcus aureus)(SIGMA公司制)。

另外，从适宜地调节对各种脂蛋白的作用的观点出发，第1试剂组合物可以优选包含脂蛋白水解酶。

作为脂蛋白水解酶，可以使用例如脂蛋白脂肪酶。脂蛋白脂肪酶只要是具有能分解脂蛋白的能力的酶就没有限定，例如可以使用源自动物或微生物的脂蛋白脂肪酶。

第1试剂组合物包含脂蛋白脂肪酶时，从更好地调整对各种脂蛋白的作用的观点出发，第1试剂组合物的脂蛋白脂肪酶活性优选为100U/L以上，另外优选为10000U/L以下、更优选为5000U/L以下、进一步优选为1000U/L以下。

在此，对第1试剂组合物和后述的第2试剂组合物的酶活性的测定方法进行说明。

本实施方式中，试剂组合物的胆固醇酯酶活性、胆固醇氧化酶活性、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性、鞘磷脂酶活性、脂蛋白脂肪酶活性例如分别可以通过以下方法来测定。

胆固醇酯酶活性的测定中，使用底物(0.04％胆固醇亚麻酸酯、1％TritonX100、0.6％胆酸钠溶液)、300U/mL胆固醇氧化酶溶液、酶稀释液(20mM磷酸缓冲液、0.5mM EDTA·2Na、2mM MgCl

胆固醇氧化酶活性的测定中，作为底物液使用6mM胆固醇溶液(溶解于异丙醇中)。对于测定对象，以成为2～4U/mL的方式加入稀释液(0.1M磷酸缓冲液、TritonX100、pH7.0)，将稀释后的溶液3mL在37℃加热5分钟后加入底物液0.05mL。然后，将混合液在37℃下反应并测定波长240nm吸光度变化量。在37℃下反应后，测定从2分钟到7分钟为止的吸光度变化量，计算出胆固醇氧化酶活性。例如，吸光度变化量若为3U/L以上，则可以说测定对象具有胆固醇氧化酶活性，进而具体可以说包含胆固醇氧化酶。

过氧化氢酶活性的测定中，使用底物(0.06％过氧化氢、50mM磷酸缓冲液、pH7.0)。将底物溶液2.9mL在25℃下预加热后，与测定对象0.1mL混合，测定240nm处的吸光度变化量。25℃反应后，测定从0分钟到3分钟为止的吸光度变化量并计算出过氧化氢酶活性。例如，吸光度变化量若为100U/L以上，则可以说测定对象具有过氧化氢酶活性，进而具体可以说包含过氧化氢酶。

过氧化物酶活性的测定中，使用反应液1(1.5mM HDAOS、0.05％TritonX100、50mM磷酸缓冲液、pH7.0)、以及反应液2(5mM 4-氨基安替比林、0.05％ TritonX100、1％过氧化氢、50mM磷酸缓冲液、pH7.0)、稀释液(50mM磷酸缓冲液、pH7.0)。将0.3mL的反应液1和用稀释液稀释的测定对象0.08mL混合，在37℃下加热5分钟。之后加入0.1mL的反应液2，在37℃下进行反应，测定主波长600nm、副波长700nm的吸光度变化量。37℃反应后，测定2分钟到5分钟为止的吸光度变化量并计算出过氧化物酶活性。例如，吸光度变化量若为10U/L以上，则可以说测定对象具有过氧化物酶活性，进而具体可以说包含过氧化物酶。

鞘磷脂酶活性的测定中，使用反应液(0.008％鞘磷脂、0.05％ TritonX100溶液、10U/mL碱性磷酸酶、10U/mL胆固醇氧化酶、2U/mL过氧化物酶、0.02％4-氨基安替比林、0.02％ TODB混合液)、反应终止液(1％十二烷基硫酸钠溶液)、稀释液(10mM Tris缓冲液、0.1％ TritonX100、pH8.0)。将反应液0.08mL和用稀释液稀释的测定对象0.003mL混合并在37℃下加热5分钟后，加入反应终止液0.16mL。在反应终止后测定主波长546nm、副波长700nm的吸光度变化量，计算出鞘磷脂酶活性。例如，吸光度变化量若为2U/L以上，则可以说测定对象具有鞘磷脂酶活性，进而具体可以说包含鞘磷脂酶。

第1试剂组合物的脂蛋白脂肪酶活性例如利用以下方法来测定。即，脂蛋白脂肪酶活性的测定中，作为底物液，使用橄榄油乳液溶液(向橄榄油5g、乙醇2mL中加入5.0％TritonX100 5mL并进行20分钟超声波处理，然后加入4％BSA 25mL、0.1M磷酸缓冲液pH7.015mL，在室温下搅拌1～2小时而得者)。向37℃下预加热5分钟的底物液中以成为0.9～1.6U/mL的方式加入稀释液(20mM磷酸缓冲液、2mM MgCl

另外，第1和第2试剂组合物中的酶也可以利用以下的方法鉴定。即，首先，利用混合型质谱仪检测用胰蛋白酶降解包含目标酶的试样而得到的片段肽。通过对由质谱仪得到的肽的质量、和在质谱仪内与氩气碰撞而得到的碎片离子的谱图(MS/MS数据)进行数据库检索(例如，Mascot检索)而能够鉴定蛋白质。若源自试剂组合物中的氨基酸序列的片段肽的序列与作为唯一序列登记在数据库中的氨基酸序列一致，则可认为包含对象酶。

另外，第1和第2试剂组合物中的酶也可以通过例如以下的定量进行鉴定。即，选择用胰蛋白酶将目标酶分解而得到的片段肽中的目标酶特异性的、且在质谱解析中可以得到强信号的肽作为定量对象肽。对于定量对象肽，通过化学合成制作非标记的肽和作为内部标准的用稳定同位素标记的肽。通过胰蛋白酶使包含目标酶的试样完全消化，添加已知量的稳定同位素标记肽，通过与HPLC连接的三重四极杆型质谱仪(LC-MS/MS)以MRM模式(多反应监测模式)进行测定。同样地测定定量对象肽的非标记肽和已知量的稳定同位素标记肽的混合液，并制作内部标准的浓度比与峰面积比的标准曲线，通过计算试样中的定量对象肽的绝对量而能够对目标酶进行定量。

(不具有酶作用的蛋白)

作为不具有酶作用的蛋白的具体例，可列举BSA等白蛋白。

对于第1试剂组合物中的BSA浓度，从使第1试剂组合物中的酶稳定化的观点、和将除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇导出到反应体系外的观点出发，相对于第1试剂组合物的全部组成优选为1g/L以上、更优选为2g/L以上，另外优选为20g/L以下、更优选为10g/L以下。

第1试剂组合物含有BSA时，测定对象的脂蛋白C还优选为LDL-C、HDL3-C、脂蛋白残粒-C或含有apoE的HDL-C。

(表面活性剂)

第1试剂组合物中，从将试样中的除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇更稳定地导出到反应体系外的观点出发，优选包含表面活性剂。表面活性剂具体为选自由非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂组成的组中的1种或2种以上，优选非离子表面活性剂，更优选聚氧乙烯衍生物。

作为表面活性剂，可列举例如作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂，更优选列举作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白且不作用于测定对象的脂蛋白的表面活性剂。另外，从稳定地识别测定对象的脂蛋白的观点出发，第1试剂组合物优选包含作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂，更优选包含作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白且不作用于测定对象的脂蛋白的表面活性剂。

例如，测定对象的脂蛋白为HDL或HDL3时，第1试剂组合物中的表面活性剂具体可以为选自由以下物质组成的组中的1种或2种以上：聚氧乙烯失水山梨醇衍生物、聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯硬脂胺等非离子表面活性剂；酰胺醚硫酸盐、聚氧乙烯烷基醚硫酸钠等阴离子表面活性剂；椰油脂肪酸-酰胺丙基二甲基-氨基乙酸甜菜碱、烷基二甲基-氨基乙酸甜菜碱、月桂基甜菜碱等两性表面活性剂；以及月桂基三甲基氯化铵等阳离子表面活性剂。

测定对象的脂蛋白为HDL或HDL3时，作为第1试剂组合物中的表面活性剂的市售品的具体例，关于非离子表面活性剂，可列举作为聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯的NONIONOT-221(日油公司制)；作为聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物的Pluronic F68(ADEKA公司制)、Pluronic F88(ADEKA公司制)、Pluronic F127(ADEKA公司制)、Pluronic P103(ADEKA公司制)、Pluronic P123(ADEKA公司制)；作为聚氧乙烯硬脂胺的NYMEEN S210(日油公司制)、EMULGEN A500(花王公司制)；

作为阴离子表面活性剂的具体例，可列举作为酰胺醚硫酸盐的SUNAMIDE CF-10(日油公司制)、作为聚氧乙烯烷基醚硫酸钠的LEVENOL WX(花王公司制)；

作为两性表面活性剂的具体例，可列举作为椰油脂肪酸-酰胺丙基二甲基-氨基乙酸甜菜碱的NISSANANON(注册商标)BDF-SF(日油公司制)、作为烷基二甲基-氨基乙酸甜菜碱的NISSANANON(注册商标)BF(日油公司制)、作为月桂基甜菜碱的AMPHITOL 24B(花王公司制)；

作为阳离子表面活性剂的具体例，可列举作为月桂基三甲基氯化铵的QUARTAMIN24P(花王公司制)。

测定对象的脂蛋白为LDL或含有apoE的HDL时，作为作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂，可列举非离子表面活性剂，进一步具体而言可列举聚氧乙烯衍生物。作为聚氧乙烯衍生物的例子，可列举选自由聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯多环苯基醚组成的组中的1种或2种以上非离子表面活性剂。

其中，作为聚氧乙烯多环苯基醚的优选的例子，可列举聚氧乙烯苄基苯基衍生物、聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物、特定的酚乙氧基化物。作为聚氧乙烯多环苯基醚的具体例，可列举EMULGEN A-60、EMULGEN A-500、EMULGEN B-66、EMULGEN A-90(以上、花王公司制)、Newcol 703、Newcol704、Newcol 706、Newcol 707、Newcol 708、Newcol 709、Newcol710、Newcol711、Newcol 712、Newcol 714、Newcol 719、Newcol 723、Newcol 729、Newcol733、Newcol 740、Newcol 747、Newcol 780、Newcol 610、Newcol 2604、Newcol2607、Newcol 2609、Newcol 2614(以上、日本乳化剂公司制)、NOIGEN EA-87、NOIGEN EA-137、NOIGEN EA-157、NOIGEN EA-167、NOIGEN EA-177、NOIGEN EA-197D、NOIGEN EA-207D(以上、第一工业制药公司制)、BLAUNON DSP-9、BLAUNON DSP-12.5、BLAUNON TSP-7.5、BLAUNON TSP-16、BLAUNON TSP-50(以上、青木油脂公司制)等。

另外，测定对象的脂蛋白为脂蛋白残粒时，作为作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂，可列举HLB值为11以上且13以下的聚氧乙烯衍生物，进一步具体而言，可列举选自由聚氧乙烯烷基醚、聚环氧烷烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯多环苯基醚组成的组中的表面活性剂中具有期望的HLB值的表面活性剂。作为所述表面活性剂的市售品的例子，可列举EMULGEN A-60、EMULGEN 707、EMULGEN 709、EMULGEN 909(以上为花王公司制)、BLAUNON DSP-9、BLAUNON DSP-12.5(以上为青木油脂公司制)。

对于第1试剂组合物中的表面活性剂的浓度，相对于第1试剂组合物的全部组成，从稳定地作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的观点出发，例如可以为0.02％(w/v)以上，优选为0.2％(w/v)以上、更优选为0.3％(w/v)以上、进一步优选为0.5％(w/v)以上，另外优选为5％(w/v)以下、更优选为3％(w/v)以下。

另外，测定对象的脂蛋白为含有apoE的HDL时，从同样的观点出发，第1试剂组合物中的表面活性剂的浓度相对于第1试剂组合物的全部组成优选为0.03％(w/v)以上、更优选为0.05％(w/v)以上，另外优选为1.2％(w/v)以下、更优选为1.0％(w/v)以下。

需要说明的是，第1和第2试剂组合物中包含的表面活性剂可以通过组合IR、NMR、LC-MS等进行解析的方法来鉴定。作为对表面活性剂的离子型(非离子型、阴离子型、阳离子型)进行确认的方法，可列举在酸性或碱性条件下基于有机溶剂的提取法、固相提取法。作为确定表面活性剂的结构的方法，可列举使用LC-MSMS、NMR进行解析的方法。

(缓冲液、盐)

缓冲液的种类可以根据例如第1试剂组合物中包含的酶的种类进行适宜选择。作为缓冲液的具体例，可列举磷酸缓冲液、Tris缓冲液、PIPES(哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸))缓冲液、BES(N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸)缓冲液。

对于第1试剂组合物中的缓冲液的浓度，从组合物中的酶保持活性的观点、和改善试剂的保存稳定性的观点出发，优选为1mM以上、更优选为5mM以上、进一步优选为10mM以上，另外优选为300mM以下，优选为200mM以下、进一步优选为150mM以下、进一步更优选为100mM以下。

盐具体而言作为pH调节剂、或离子强度调节剂而配合。作为盐的具体例，可列举氢氧化钠、硫酸钠等钠盐；氢氧化钾等钾盐；硫酸铵、氯化铵等铵盐等碱性物质。另外，通过使第1试剂组合物包含1价的阳离子和2价的阳离子中的至少一种或它们的盐，除sdLDL以外的LDL的测定中，LDL的识别、例如sdLDL和L LDL的识别将变得更加容易。

对于第1试剂组合物中的盐浓度，从作为pH调节剂、或离子强度调节剂更稳定地起作用的观点出发，相对于第1试剂组合物的全部组成优选为0.2g/L以上、更优选为0.5g/L以上，另外优选为5g/L以下、更优选为3g/L以下。

另外，第1试剂组合物具有鞘磷脂酶活性时，第1工序中，为了调节鞘磷脂酶对测定对象脂蛋白和其以外的脂蛋白的催化活性，也可以添加聚阴离子。

作为添加的聚阴离子，可适宜地使用肝素、磷钨酸、硫酸葡聚糖等。

对于第1试剂组合物中的聚阴离子的浓度，在肝素的情况下优选为10～250U/mL，在磷钨酸的情况下优选为0.02～1.25％(w/v)，在硫酸葡聚糖的情况下优选为0.02～1.25％(w/v)。

对于第1试剂组合物的pH，从组合物中的酶保持活性的观点、和改善试剂的保存稳定性的观点出发，优选为6以上、更优选为6.5以上，另外优选为8以下、更优选为7.5以下。

(氢供体、耦合剂)

第1试剂组合物优选包含氢供体和耦合剂中的任一者。氢供体和耦合剂例如以在过氧化物酶活性存在下进行偶联反应的组合来使用。另外，氢供体和耦合剂中的任一者用于在第1工序中将除测定对象以外的脂蛋白C导出到反应体系外。进一步具体而言，为了使胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶作用于除测定对象以外的脂蛋白C而产生的过氧化氢在过氧化物酶活性存在下转化为无色醌而使用氢供体或耦合剂中的任一者。

作为氢供体的具体例，可列举N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-(3-磺丙基)苯胺(HALPS)、N-(3-磺丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-4-氟-3,5-二甲氧基苯胺(FDAOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰基乙二胺(EMSE)等苯胺衍生物。

对于第1试剂组合物中的氢供体的浓度，从将除测定对象以外的脂蛋白C导出到反应体系外的观点出发，优选为1mmol/L以上、更优选为1.5mmol/L以上，另外优选为5mmol/L以下、更优选为3mmol/L以下。

另外，氢供体包含于后述的第2试剂组合物时，优选在第1试剂组合物中包含用于偶联反应的耦合剂。

耦合剂具体而言为选自由4-氨基安替比林、氨基安替比林衍生物、香兰素二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙和磺化甲基苯并噻唑啉酮腙组成的组中的至少1种。

对于第1试剂组合物中的耦合剂的浓度，从将除测定对象以外的脂蛋白C导出到反应体系外的观点出发，优选为0.5mM以上、更优选为1.0mM以上，另外优选为4mM以下、更优选为3mM以下。

(铁配合物)

作为铁配合物，可列举例如关于第2试剂组合物而在后文说明的铁配合物。作为铁配合物的浓度，优选为0.001～0.05mmol/L。

第1试剂组合物例如可以构成为：包含胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等分解胆固醇的酶、氢供体或耦合剂中任一者；以及去除过氧化氢的过氧化氢酶等。

(第2试剂组合物)

第2试剂组合物是用于对测定对象的脂蛋白C进行定量的试剂。第2试剂组合物的成分根据第1试剂组合物的构成而不同，但只要是能对测定对象的脂蛋白C进行定量的配方组成即可，可以使用公知的物质。

作为第2试剂组合物的成分，可列举例如酶、表面活性剂、不具有酶作用的蛋白、缓冲液、盐、耦合剂、氢供体、铁配合物、过氧化氢酶抑制剂。

(酶)

第2试剂组合物例如具有过氧化物酶活性。另外，第2试剂组合物例如包含具有过氧化物酶活性的酶，进而具体包含过氧化物酶。

对于第2试剂组合物的过氧化物酶活性，从准确地测定测定对象的脂蛋白C的观点出发，优选为500U/L以上、更优选为1000U/L以上，另外优选为20000U/L以下、更优选为10000U/L以下。

其中，第1试剂组成具有过氧化物酶活性时，过氧化物酶活性也会被带入测定对象的脂蛋白C的测定工序(后述的第2工序，因此第2试剂中的浓度可以减少或不含。

(表面活性剂)

表面活性剂可以根据测定对象的脂蛋白来适宜选择。

作为表面活性剂，可列举例如作用于测定对象的脂蛋白的表面活性剂。另外，从稳定地对脂蛋白C进行定量的观点出发，第2试剂组合物优选包含作用于测定对象的脂蛋白的表面活性剂。

作用于测定对象的脂蛋白的表面活性剂可以是仅作用于测定对象的脂蛋白的表面活性剂等选择性地作用于测定对象的脂蛋白的表面活性剂，也可以是还作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂或作用于所有脂蛋白的表面活性剂。

测定对象的脂蛋白C的测定工序中残存有除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白时，第2试剂组合物优选包含选择性作用于测定对象的脂蛋白的表面活性剂。

例如测定对象的脂蛋白为HDL或含有apoE的HDL时，表面活性剂例如为选自由聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯高级醇(碳数4～35)醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯多环苯基醚组成的组中的1种或2种以上。

测定对象的脂蛋白为LDL或脂蛋白残粒时，表面活性剂例如包含聚氧乙烯衍生物，另外可以使用市售的总胆固醇测定用试剂等中使用的表面活性剂。作为所述表面活性剂，例如为选自由聚氧乙烯烷基苯基醚(例如EMULGEN909(花王公司制)、TritonX100)、聚氧乙烯烷基醚(例如EMULGEN 707、EMULGEN 709(以上为花王公司制))、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物(例如Pluronic 17R-4、Pluronic L-64、Pluronic PE3100、Pluronic P-85、Pluronic F-88、Pluronic P-103、Pluronic F-127等Pluronic(注册商标)系表面活性剂(BASF公司、ADEKA公司))、聚氧乙烯多环苯基醚(例如EMULGEN B66、EMULGEN A90、EMULGENA60(以上为花王公司制))组成的组中的1种或2种以上。

测定对象的脂蛋白为HDL3时，表面活性剂优选为相对于HDL2而言选择性地作用于HDL3的表面活性剂，例如聚氧乙烯多环苯基醚(例如Newcol 610、Newcol 710(日本乳化剂公司制)、ADEKA TOL PC-10、BLAUNON DSP-12.5、BLAUNON TSP-16(青木油脂公司制)、NOIGEN EA-137(第一工业制药公司制))。

对于第2试剂组合物中的表面活性剂的浓度，相对于第2试剂组合物的全部组成，从稳定地作用于测定对象的脂蛋白C的观点出发，优选为0.05％以上、更优选为0.1％(w/v)以上、进一步优选为0.5％(w/v)以上，另外优选为8.0％(w/v)以下、更优选为5.0％(w/v)以下。

(不具有酶作用的蛋白、缓冲液、盐)

不具有酶作用的蛋白、缓冲液和盐的种类例如可根据第2试剂组合物中包含的酶的种类来适宜选择。作为这些的具体构成，可列举例如前文关于第1试剂组合物而记载的构成。

(耦合剂、氢供体)

作为耦合剂和氢供体的具体构成，可列举例如前文关于第1试剂组合物而记载的构成。

对于第2试剂组合物中的氢供体的浓度，从更稳定地进行脂蛋白C的测定的观点出发，优选为1mmol/L以上、更优选为1.5mmol/L以上，另外优选为10mmol/L以下、更优选为8mmol/L以下。

对于第2试剂组合物中的耦合剂的浓度，从更稳定地进行脂蛋白C的测定的观点出发，优选为1mM以上、更优选为2mM以上，另外优选为8mM以下、更优选为5mM以下。

(铁配合物)

作为铁配合物，例如可列举亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、卟啉铁配合物、EDTA-铁配合物。

对于第2试剂组合物中的铁配合物的浓度，相对于第2试剂组合物的全部组成，优选为0.0015mmol/L以上，另外，优选为0.3mmol/L以下，另外，也可以为例如0.05mmol/L以下。

(过氧化氢酶抑制剂)

第1试剂组合物具有过氧化氢酶活性时，从更稳定地进行脂蛋白C的测定的观点出发，第2试剂组合物优选包含过氧化氢酶抑制剂。作为过氧化氢酶抑制剂的具体例，可列举叠氮化钠。

对于第2试剂组合物中的叠氮化钠的浓度，从更稳定地进行脂蛋白C的测定的观点出发，优选为0.01％(w/v)以上、更优选为0.02％(w/v)以上，另外优选为0.2％(w/v)以下、更优选为0.1％(w/v)以下。

然后，进一步列举试剂盒的优选构成的例子。

试剂盒中，从进一步稳定地进行脂蛋白C的定量的观点出发，优选第1试剂组合物包含氢供体和耦合剂中的一者且不含另一者、第2试剂组合物不含氢供体和耦合剂中的上述一者且包含另一者。即，优选耦合剂和氢供体分别分开存在于不同的试剂组合物中。

另外，试剂盒中，优选不使耦合剂和氢供体在第1或第2试剂组合物中共存。

另外，试剂盒中，第1试剂组合物满足以下的条件1～3中的1个或2个条件、且第2试剂组合物不满足以下的条件1～3中第1试剂组合物所满足的1个或2个条件、满足此外的所有条件。

条件1：包含耦合剂

条件2：包含铁配合物

条件3：具有过氧化物酶活性

脂蛋白C的定量中，例如在过氧化物酶活性的存在下使氢供体和耦合剂发生偶联反应，通过产生的色素来测定特定波长的吸光度。此时，作为反应促进剂，可以使用铁配合物，但在同一试剂中存在耦合剂、过氧化物酶活性和铁配合物时，试剂会逐渐自然显色，有时对脂蛋白C的定量产生影响。在这点上，通过将第1和第2试剂组合物设为上述的构成，从而能够防止耦合剂、过氧化物酶活性和铁配合物在第1或第2试剂组合物中共存，因此能够抑制试剂组合物的自然显色。因此，能够进一步稳定地进行脂蛋白C的定量。

从更稳定地对脂蛋白C进行定量的观点出发，更优选：第1试剂组合物满足条件1和条件3、且第2试剂组合物满足条件2。

(方法)

本实施方式中的方法是使用前述的第1和第2试剂组合物对试样中的脂蛋白C进行定量的方法，具体而言为对除sdLDL以外的脂蛋白C进行定量的方法。本实施方式中的定量方法包括以下的第1工序和第2工序。

(第1工序)使前述第1试剂组合物作用于试样的工序

(第2工序)在第1工序之后，使前述的第2试剂组合物进行作用，由此对残留的脂蛋白中的胆固醇进行定量的工序

第1和第2试剂组合物的构成如上所述。

上述方法中，通过使用吸光度的比R1满足前述的条件的第1和第2试剂组合物，从而能够高精度且稳定地对测定对象的脂蛋白C进行定量。

另外，脂蛋白C的定量方法例如可以通过如下方式进行：向试样(被检体试样)中添加第1试剂组合物使其反应，接着添加第2试剂组合物使其反应，测定吸光度，从而进行。

被检体试样例如为血清或血浆等血液来源试样，优选为血清。

第1和第2工序通常在自动分析装置内进行。

作为自动分析装置，可列举例如TBA-120FR、TBA-200FR(以上为东芝公司制)、JCA-BM1250、JCA-BM1650、JCA-BM2250(以上为日本电子公司制)、HITACHI7180、HITACHI7170(以上为日立公司制)、AU2700、AU5800、AU680(以上为OLYMPUS公司制)、cobas c501、cobasc701(以上为Roche公司制)。

试样的量、各试剂组合物的量例如可以考虑各试剂组合物中的试剂浓度等进行适宜确定，在能用于自动分析装置的范围内进行。例如可以使用被检体试样1～10μL、第1试剂50～300μL、第2试剂25～200μL。

本实施方式中，对于各工序中的反应温度，优选在2℃～45℃下进行，更优选在25℃～40℃下进行。

对于反应时间，各工序均优选以1～10分钟进行，进一步优选以3～7分钟进行。

以下对各工序进一步进行具体说明。

(第1工序)

第1工序中，使第1试剂组合物作用于试样。由此，去除除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白，使除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇游离并导出至反应体系外。

更具体而言，第1工序中，优选：在选自由胆固醇酯酶活性组成的组中的至少1种活性的存在下，使作用于除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的表面活性剂作用于试样。然后，使从脂蛋白中游离而产生的胆固醇与例如胆固醇氧化酶等与胆固醇反应的酶发生反应并导出至反应体系外。第1工序中，例如可以使用如下技术：去除除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇并导出至反应体系外，使除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的胆固醇凝集、或进行抑制而使其在之后的工序不反应等公知的技术。

第1工序中，去除由除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白产生的胆固醇并导出至反应体系外的工序可以优选利用以下任意的方法进行。

(1)通过胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性，在除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中由胆固醇产生过氧化氢，在过氧化氢酶活性的存在下将过氧化氢分解为水和氧气的方法

(2)在通过胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性而产生的过氧化氢、以及耦合剂或氢供体的存在下形成无色醌的方法

(3)在过氧化氢酶活性的存在下使过氧化氢分解、且同时在耦合剂或氢供体的存在下形成无色醌的方法

上述(1)或(2)的方法中，使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作用于胆固醇而产生过氧化氢，产生的过氧化氢被去除。

上述的方法中，第1试剂组合物具有选自由胆固醇酯酶活性和胆固醇氧化酶活性组成的组中的至少1种活性、且例如成为以下的构成。

采用上述(1)的方法的情况下，第1试剂组合物还具有过氧化氢酶活性。

采用上述(2)的方法的情况下，第1试剂组合物至少包含耦合剂和氢供体中的一者、且第1试剂组合物还具有过氧化物酶活性。

采用上述(3)的方法的情况下，第1试剂组合物具有过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性、且第1试剂组合物包含耦合剂或氢供体。

第1工序中，通过将除测定对象外的脂蛋白中的胆固醇导出到反应体系外，从而在之后的工序中，反应液中可以优选选择性地残存测定对象的脂蛋白来作为脂蛋白、更优选仅残存测定对象的脂蛋白。将如此地除去除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白并导出到反应体系外、使之后的工序中不会检测出除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白的胆固醇的步骤，有时被称为“使测定对象和其以外的脂蛋白差别化”。

另外，第1工序中，除测定对象的脂蛋白以外的脂蛋白中的胆固醇也可以未被完全去除，在该情况下，优选在第2工序中使用可选择性地测定测定对象的脂蛋白C的表面活性剂。

(第2工序)

第2工序中，对经过第1工序而残留的脂蛋白C进行定量。第2工序中，可以根据脂蛋白的种类而使用一直以来使用的脂蛋白C的定量方法。

例如有如下方法：利用比浊测定对添加凝集剂而形成的特异性凝集物的含量进行定量的方法、使用基于特异性抗体的抗原抗体反应的方法、使用酶对分解产物进行定量的方法等。这些当中，优选使用酶对分解产物进行定量的方法。

使用酶对分解产物进行定量的方法中，例如向第1工序后的反应液中加入包含1种或2种以上的选自由胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶和过氧化物酶组成的组中的胆固醇测定用酶的第2试剂组合物而使脂蛋白C游离、分解，对其反应产物进行定量。

另外，第2工序中，也优选使用包含表面活性剂的第2试剂组合物。

脂蛋白C的定量例如通过测定580～720nm的波长区域、优选600～700nm的波长区域的吸光度来进行。

以上对本发明的实施方式进行了说明，但这些是本发明的示例，也可以采用除上述以外的各种构成。

实施例

以下的各例中，吸收光谱的测定中使用了HITACHI公司制造的U-3900。

首先，对试剂组合物中使用的成分进行说明。

以下的例子中，根据测定对象的脂蛋白C的种类，将各试剂组合物的基本配方设为以下配方。

(HDL-C)

第1试剂组合物

第2试剂组合物

BES缓冲液，pH7.0 100mM

聚氧乙烯多环苯基醚 1.0％

(LDL-C)

第1试剂组合物

第2试剂组合物

PIPES缓冲液，pH7.0 50mM

聚氧乙烯烷基醚 1.0％(w/v)

(HDL3-C)

第1试剂组合物

第2试剂组合物

BES缓冲液，pH7.0 100mM

聚氧乙烯多环苯基醚 2.0％(w/v)

(脂蛋白残粒-C)

第1试剂组合物

第2试剂组合物

PIPES缓冲液，pH6.8 50mM

胆固醇酯酶(低分子) 4000U/L

聚氧乙烯烷基醚 0.1％(w/v)

(含有apoE的HDL-C)

第1试剂组合物

第2试剂组合物

BES缓冲液，pH7.0 100mM

聚氧乙烯多环苯基醚 1.0％(w/v)

(制备例1a～11a)

对于各例，在上述记载的成分的基础上，制备包含以下成分的第1试剂组合物。即，对于各例，制备LDL-C、HDL-C、HDL3-C、脂蛋白残粒-C或含有apoE的HDL-C的总计5种第1试剂组合物。

(制备例1a)

过氧化氢酶(B-Cat) 1200U/mL

4-氨基安替比林(4-AA) 1.3mM

(制备例2a)

过氧化物酶(POD) 1.7U/mL

4-氨基安替比林 1.3mM

(制备例3a)

4-氨基安替比林 1.3mM

亚铁氰化钾(FeK) 0.036mM

过氧化氢酶 1200U/mL

(制备例4a)

过氧化物酶1.7U/mL

氢供体

(HDAOS：HDL-C、含有apoE的HDL-C) 0.7mM

(TOOS：LDL-C、HDL3-C、脂蛋白残粒-C) 2.0mM

(制备例5a)

氢供体

(制备例6a)

氢供体

(制备例7a)

4-氨基安替比林 1.3mM

过氧化物酶 1.7U/mL

过氧化氢酶 1200U/mL

(制备例8a)

氢供体

(制备例9a)

氢供体

(制备例10a)

耦合剂(4-氨基安替比林) 1.3mM

过氧化物酶 1.7U/mL

亚铁氰化钾 0.036mM

(制备例11a)

氢供体

(HDAOS：HDL-C、含有apoE的HDL-C) 0.7mM

(TOOS：LDL-C、HDL3-C、脂蛋白残粒-C) 2.0mM

过氧化氢酶 1200U/mL

将得到的第1试剂组合物在37℃下加速保存1周或2周，对于保存过程中的自然显色，测定了波长320nm～480nm的吸收光谱。表1示出各例中得到的试剂组合物的保存后的吸光度和吸光度比。

另外，图1～图11中的各分图(a)分别是示出实验例1a～11a中得到的第1试剂组合物在37℃下加速保存2周后的吸收光谱的图。

[表1]

(制备例1b～11b)

对于各例，在上述记载的成分的基础上，制备包含以下成分的第2试剂组合物。即，对于各例，制备LDL-C、HDL-C、HDL3-C、脂蛋白残粒-C或含有apoE的HDL-C的总计5种第2试剂组合物。

(制备例1b)

氢供体

(制备例2b)

氢供体

(HDAOS：HDL-C、含有apoE的HDL-C) 2.2mM

(TOOS：LDL-C、HDL3-C、脂蛋白残粒-C) 6.0mM

亚铁氰化钾 0.109mM

(制备例3b)

氢供体

(制备例4b)

4-氨基安替比林 4.0mM

亚铁氰化钾 0.109mM

(制备例5b)

4-氨基安替比林 4.0mM

过氧化物酶 5.0U/mL

叠氮化钠 0.05％(w/v)

(制备例6b)

4-氨基安替比林 4.0mmol/L

(制备例7b)

氢供体

(制备例8b)

4-氨基安替比林 4.0mM

亚铁氰化钾 0.109mM

叠氮化钠 0.05％(w/v)

(制备例9b)

4-氨基安替比林 4.0mM

叠氮化钠 0.05％(w/v)

(制备例10b)

氢供体

(HDAOS：HDL-C、含有apoE的HDL-C) 2.3mM

(TOOS：LDL-C、HDL3-C、脂蛋白残粒-C) 6.0mM

(制备例11b)

将得到的第2试剂组合物在37℃下加速保存1周或2周，对于保存过程中的自然显色，测定了波长320nm～480nm的吸收光谱。表2示出各例中得到的试剂组合物的保存后的吸光度和吸光度比。

另外，图1～图11中的各分图(b)是分别示出实验例1b～11b中得到的第2试剂组合物在37℃下加速保存2周后的吸收光谱的图。

[表2]

(实施例3-1～3-7、比较例3-1～3-4)

将LDL-C作为代表项目，将各例中的第1和第2试剂组合物在37℃条件下保存2周，进行加速试验。以表3所示的组合使用保存后的第1和第2试剂组合物，评价脂蛋白C的测定精度。将评价结果一并示于表3。

在各测定体系中，使用LDL-C浓度已知的标准物质和不存在LDL-C的作为空白物质的生理盐水制作标准曲线。然后进行低值被检体的测定，测定最低检测限。

具体而言，对于表3中记载的各例，通过以下步骤进行LDL-C浓度的评价。

(LDL-C浓度的测定和评价方法)

1.对于上述标准物质和生理盐水的试样2.0μL，加入各例的第1试剂组合物150μL，在37℃下作用5分钟。

2.加入各例的第2试剂组合物50μL，在37℃下作用5分钟。

3.在即将加入第2试剂组合物之前和添加第2试剂组合物5分钟之后测定波长600nm(主波长)和700nm(副波长)处的吸光度，由(添加第2试剂组合物5分钟后的600nm吸光度-700nm吸光度)-(即将添加第2试剂组合物之前的600nm吸光度-700nm吸光度)计算校准吸光度，从而制作标准曲线。

4.接着，将LDL-C值已知的低浓度(4.0mg/dL)试样用生理盐水稀释，制作10级稀释系列试样，将生理盐水和各稀释系列用上述各试剂分别重复测定5次。

5.将生理盐水的平均值+2.6SD＜稀释试样的平均值-2.6SD的最低浓度作为检测限，检测限为2.0mg/dL以下时评价为“○”，为高于2.0mg/dL的浓度时评价为“×”，由此评价各例的测定精度。

[表3]

第1和第2试剂组合物的R1、R2均处于特定范围的实施例中，能够准确地检测LDL-C。

该申请基于2020年6月2日提出的日本申请特愿2020-096095号而要求优先权，其公开的全部内容整合于此。