一种用于检测基因多态性的荧光淬灭PCR方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测基因多态性的荧光淬灭PCR方法及其应用。

背景技术

实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR DetectingSystem)是在普通PCR体系中加入荧光化学物质对每次热循环后产物的总量进行测定，其结果可以较快取得且数据较为稳定。通过实时检测样品的荧光强度，可以精确的反推出待测样品中的特定DNA序列的初始浓度。

Taqman探针是一种常用的荧光定量PCR探针，通常探针的5’端标记荧光基团(FAM、VIC、ROX、Cy5等)，3’标记淬灭基团(BHQ1、BHQ2、Dabcyl、MGB等)。在PCR中，探针结合到模板上，Taq DNA聚合酶具有5’→3’外切酶活性，将探针切开，使荧光基团与淬灭基团分离，使得反应体系的荧光值增加，从而检测目标基因。

但在常规的荧光定量PCR中，一个荧光通道只能检测一种基因多态性，本发明结合常规荧光定量PCR与荧光淬灭PCR，可用一个荧光通道检测一种基因两种基因多态性。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种用于检测基因多态性的基于荧光能量共振转移的荧光淬灭PCR方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种用于检测基因多态性的荧光淬灭PCR方法，其采用两组针对不同等位基因的探针：荧光激发组和荧光淬灭组；反应体系中含有具有5’→3’外切酶活性的DNA聚合酶和DNA连接酶；

其中，荧光激发组探针为一条5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团的探针T

荧光淬灭组包括两条探针：5’端荧光基团标记的探针T

探针T

该PCR方法采用的扩增程序在扩增完成后，还包括一个高温过程，以使荧光淬灭组探针从模板上分离，使模板继续延伸。

进一步地，上述扩增程序包括：95℃，5min；95℃15s，60℃1min，78℃30s，45个循环。

进一步地，该荧光淬灭PCR方法采用的反应体系包括上游引物、下游引物、探针T

进一步地，该反应体系包括0.5μL各引物(10μM)、0.5μL各探针(10μM)、2.0μL扩增缓冲液(10×)、1.0μL dNTP(2.5mM)、0.4μL荧光参比染料、0.4μL复合酶、1μL模板(10～50ng/μL)，加水至20μL；其中，复合酶由DNA聚合酶和DNA连接酶组成，二者的浓度比优选为1：5～10，更优选为1：8。

进一步地，上述扩增缓冲液(10×)包括100mM Tris-HCl(pH 8.8,25℃)、500mMKCl、25mM MgCl

进一步地，DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶，DNA连接酶为Taq DNA连接酶。

进一步地，荧光基团选自FAM、VIC、ROX、Cy5中的一种或多种。

进一步地，淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、Dabcyl、MGB中的一种或多种。

进一步地，荧光参比染料为ROX。

本发明的第二方面是提供上述PCR方法在检测MTHFR基因677位点基因型中的应用，采用的探针序列如下：

C型探针TG2(5'-3')：FAM-5’-GAG

T型探针TA1(5'-3')：FAM-G

T型探针TA0(5'-3')：P-TTTTCTTTGAGGCTGA-MGB；

其中，

进一步地，采用的引物序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.2。

本发明还提供一种检测MTHFR基因677位点基因型的试剂盒，其包括如下序列的探针：

C型探针TG2(5'-3')：FAM-5’-GAG

T型探针TA1(5'-3')：FAM-G

T型探针TA0(5'-3')：P-TTTTCTTTGAGGCTGA-MGB；

其中，

进一步地，上述试剂盒还包括序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.2的引物。

进一步地，上述试剂盒还包括扩增缓冲液、dNTP、荧光参比染料、复合酶和去离子水；其中，复合酶由DNA聚合酶和DNA连接酶组成，二者的浓度比优选为1:5～10，更优选为1:8。

进一步地，上述扩增缓冲液(10×)包括100mM Tris-HCl(pH 8.8,25℃)、500mMKCl、25mM MgCl

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的荧光淬灭PCR采用两组探针，Taq DNA聚合酶将TaqMan探针降解，使反应体系荧光强度增加；Taq DNA连接酶将荧光标记的探针与淬灭基团标记的探针连接，使反应体系荧光强度降低，从而能够仅采用一条荧光通道、使用荧光曲线的形态判定基因的多态性，操作简单，适合大规模推广。

附图说明

图1是Taqman探针荧光检测原理示意图；

图2是荧光淬灭PCR探针淬灭原理示意图；

图3显示了本发明一对比例中采用常规荧光定量PCR检测亚甲基四氢叶酸还原酶C/C型样本的结果；

图4显示了本发明一对比例中采用常规荧光定量PCR检测亚甲基四氢叶酸还原酶C/T型样本的结果；

图5显示了本发明一对比例中采用常规荧光定量PCR检测亚甲基四氢叶酸还原酶T/T型样本的结果；

图6显示了本发明一实施例中T型探针TA2扩增C/C型样本的结果图；

图7显示了本发明一实施例中T型探针TA2扩增C/T型样本的结果图；

图8显示了本发明一实施例中T型探针TA2扩增T/T型样本的结果图；

图9显示了本发明一实施例中T型探针TA2扩增C/C型样本、C/T型样本、T/T型样本和空白对照的复合图；

图10显示了本发明一实施例中T型探针TA1扩增C/C型样本的结果图；

图11显示了本发明一实施例中T型探针TA1扩增C/T型样本的结果图；

图12显示了本发明一实施例中T型探针TA1扩增T/T型样本的结果图；

图13显示了本发明一实施例中T型探针TA1扩增C/C型样本、C/T型样本、T/T型样本和空白对照的复合图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测基因多态性的荧光淬灭PCR方法。该荧光淬灭PCR方法采用两组针对不同等位基因的探针：荧光激发组和荧光淬灭组；反应体系中含有具有5’→3’外切酶活性的DNA聚合酶和DNA连接酶；

其中，荧光激发组探针为一条5’端标记荧光基团、3’端标记淬灭基团的探针T

荧光淬灭组包括两条探针：5’端荧光基团标记的探针T

探针T

该PCR方法采用的扩增程序在扩增完成后，还包括一个高温过程，以使荧光淬灭组探针从模板上分离，使模板继续延伸。

根据上述检测原理，该荧光淬灭PCR方法在一个荧光通道中至少可以检测2个等位基因的3种基因型。

在本发明一优选的实施例中，上述扩增程序包括：95℃，5min；95℃15s，60℃1min，78℃30s，45个循环；60℃时，探针切割或连接；78℃时，连接的探针从模板上解离，从而使得模板能够正常扩增。

在本发明一优选的实施例中，该荧光淬灭PCR方法采用的反应体系包括上游引物、下游引物、探针T

在本发明一优选的实施例中，该反应体系包括0.5μL各引物(10μM)、0.5μL各探针(10μM)、2.0μL扩增缓冲液(10×)、1.0μL dNTP(2.5mM)、0.4μL荧光参比染料、0.4μL复合酶、1μL模板(10～50ng/μL)，加水至20μL；其中，复合酶由DNA聚合酶和DNA连接酶组成，二者的浓度比优选为1:5～10，优选为1:8。

在本发明一优选的实施例中，上述扩增缓冲液(10×)包括100mM Tris-HCl(pH8.8,25℃)、500mM KCl、25mM MgCl

在本发明一优选的实施例中，DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶，DNA连接酶为Taq DNA连接酶。

在本发明一优选的实施例中，荧光基团选自FAM、VIC、ROX、Cy5中的一种或多种。

在本发明一优选的实施例中，淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、Dabcyl、MGB中的一种或多种。

在本发明一优选的实施例中，荧光参比染料为ROX。

本发明还提供了上述PCR方法在检测MTHFR基因677位点基因型中的应用，采用的探针序列如下：

C型探针TG2(5'-3')：FAM-5’-GAG

T型探针TA1(5'-3')：FAM-G

T型探针TA0(5'-3')：P-TTTTCTTTGAGGCTGA-MGB；

其中，

在本发明一优选的实施例中，采用的引物序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.2。

本发明还提供一种检测MTHFR基因677位点基因型的试剂盒，其包括如下序列的探针：

C型探针TG2(5'-3')：FAM-5’-GAG

T型探针TA1(5'-3')：FAM-G

T型探针TA0(5'-3')：P-TTTTCTTTGAGGCTGA-MGB；

其中，

在本发明一优选的实施例中，上述试剂盒还包括序列为SEQ ID No.5和SEQ IDNo.2的引物。

在本发明一优选的实施例中，上述试剂盒还包括扩增缓冲液、dNTP、荧光参比染料、复合酶和去离子水；其中，复合酶由DNA聚合酶和DNA连接酶组成，二者的浓度比优选为1:5～10，优选为1:8。

在本发明一优选的实施例中，上述扩增缓冲液(10×)包括100mM Tris-HCl(pH8.8,25℃)、500mM KCl、25mM MgCl

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

对比例1

采用常规的荧光定量PCR方法检测MTHFR基因677，其存在C/T多态性分布，常规的检测方法为设计两条探针，两个荧光通道进行检测。

(1)该检测方法采用的引物和探针序列如下：

上游引物S1(5'-3')：CCTCAAAGAAAAGCTGCGTGAT(SEQ ID No.1)；

下游引物X1(5'-3')：GACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAG(SEQ ID No.2)；

C型探针TG(5'-3')：FAM-ATGAAATC

T型探针TA(5'-3')：VIC-ATGAAATCG

G

(2)扩增反应：按照表1配制反应体系，并按照表2进行扩增。

表1反应体系

表2反应程序

C/C型、C/T型、T/T型样本的检测结果分别如图3～5所示。

实施例1

本实施例以亚甲基四氢叶酸还原酶(MTFHR)为例，验证本发明提供的荧光淬灭方法，具体的实验步骤和结果如下：

(1)引物和探针设计

上游引物S2(5'-3')：CCTCACCTGGATGGGAAAGA(SEQ ID No.5)；

下游引物X2(5'-3')：GACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAG(SEQ ID No.2)；

C型探针TG2(5'-3')：FAM-5’-GAG

T型探针TA1(5'-3')：FAM-G

T型探针TA2(5'-3')：FAM-G

T型探针TA0(5'-3')：P-TTTTCTTTGAGGCTGA-MGB(SEQ ID No.9)。

C

(2)配制反应体系：如下表3配制反应体系

表3反应体系

其中，引物探针浓度均为10μM；酶是Taq DNA聚合酶(翌圣：Hieff

(3)反应

采用如下表4的反应程序进行反应：

表4反应程序

其中，60℃时，探针切割或连接；78℃时，连接的探针从模板上解离，从而使得模板能够正常扩增。

T型探针TA2测试结果如图6、图7、图8、图9所示。由复合图结果可知，TA2探针T

T型探针TA1测试结果如图10、图11、图12、图13所示。由复合图结果可知，TA2探针T

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。