肾病变蛋白生物标记及其应用

相关申请

本申请主张根据美国专利法第119条(35U.S.C.§119)于2018年6月21日提出申请的美国临时申请USSN第62/688,142的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及生物标记、方法，以及分析试剂盒，是用于在有需要的个体中鉴定并筛选肾病变，特别是糖尿病性肾病变，或在糖尿病患者体内预测糖尿病性肾病变或早期进行性肾功能衰退(early progressive renal function decline，ERFD)。

背景技术

肾损伤，也称为肾病变，可由例如药物毒性、发炎反应、高血压，以及糖尿病所引起。肾脏疾病通常是一种进行性疾病，这表示肾脏的损害往往是永久性而无法回复的。因此，在损害发生前尽早发现肾脏疾病非常重要。如果在早期阶段发现肾脏疾病，可以很有效地进行治疗。慢性肾病变的治疗着重于减缓肾脏损害的进展，通常是通过控制潜在的原因。慢性肾病变可发展为末期肾衰竭，若没有人工过滤(透析)或肾移植的话就会致命。特定而言，糖尿病性肾病变(diabetic nephropathy，DN)为糖尿病患者中最常见的并发症之一。肾病变在大约20-40％的第二型糖尿病(type 2diabetic，T2D)患者中发展[1]。此外，糖尿病性肾病变(DN)为末期肾脏疾病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因。微量白蛋白尿(尿白蛋白排泄30-300mg/24小时)为肾功能不全的第一个迹象，因为它可以发展为大量白蛋白尿(>300mg/24小时)，随后发展为肾功能衰竭[2,3]。

典型地，通过分析蛋白尿含量(例如，尿白蛋白的含量)或通过检查肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)来诊断肾病变。其他相关参数包括例如收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)，空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、血红蛋白A1c(hemoglobin A1c，HbA1c)。然而，这些方法缺乏足够的灵敏度及/或选择性，尤其是在没有明显症状发生时检测早期肾病变。虽然肾病变也可通过肾活体组织切片来检测，但是这种侵入性手术并不是理想的方法，因为大多数患者不愿意这样做，因此可能导致晚期诊断，直到临床特征外显或已经发展疾病恶化。肾脏活体组织切片也可能导致严重出血并发症的风险。

需要开发一种用于检测肾病变的方法，特别是用于一般筛检、早期检测，以及非侵入性的方法。

发明内容

于本发明中，意外地发现，相较于未患有肾病变的对照个体，克氏细胞蛋白(CC16)在肾病变患者中特异性且高度表现。还发现CC16与糖尿病患者中糖尿病性肾病变或早期进行性肾功能衰退(ERFD)的发展高度相关。因此，克氏细胞蛋白(CC16)可作为诊断肾病变的特异性生物标记，尤其适用于早期检测；且还用于预测糖尿病患者的糖尿病性肾病变或ERFD。

于一方面，本发明提供一种用于检测在个体中的肾病变的方法，该方法包括：

(i)提供从该患者获得的生物样品；以及

(ii)检测该生物样品中的生物标记以获得检测含量，将该检测含量与该生物标记的参考含量进行比较以获得比较结果，并基于该比较结果评估该个体是否患有肾病变或有是否具有发展肾病变的风险，其中该生物标记包括CC16，且相较于该参考含量，该检测含量的增加表示该个体患有肾病变或具有发展肾病变的风险。

在部分具体实施例中，该个体为糖尿病患者。

在部分具体实施例中，该肾病变为糖尿病性肾病变。

在部分具体实施例中，如果确定该个体患有肾病变，则对该个体进行治疗肾病变的方法。

另一方面，本发明提供一种预测在糖尿病患者中的糖尿病性肾病变或早期进行性肾功能衰退(ERFD)的方法，该方法包括：

(i)提供从该糖尿病患者获得的生物样品；以及

(ii)检测该生物样品中的生物标记以获得检测含量，将该检测含量与该生物标记的参考含量进行比较以获得比较结果，并基于该比较结果评估该个体是否患有肾病变或是否具有发展肾病变或ERFD的风险，其中该生物标记包括CC16，且相较于该参考含量，该检测含量的增加表示发生糖尿病性肾病变或ERFD的风险较高。

在部分具体实施例中，若确定糖尿病患者具有较高的风险发生糖尿病性肾病变或ERFD，则对该个体进行预防糖尿病性肾病变或ERFD的方法。

在本发明的部分具体实施例中，通过质谱法进行该检测。

在本发明的部分具体实施例中，该生物样品为尿液样品。

在本发明的部分具体实施例中，可进一步检测一种或多种额外的生物标记或参数以提高该检测的准确性。在某些实例中，根据本发明的待检测的生物标记还包括β2-微球蛋白(β2-microglobulin，B2M)。

在本发明的部分具体实施例中，该肾病变为慢性肾病变(chronic kidneydisease，CKD)。

在本发明的部分具体实施例中，该慢性肾病变(CKD)为早期CKD，具体而言是第一阶段或第二阶段，或者该CKD为第三阶段或第四阶段慢性肾病变(CKD)。

于另一方面，本发明提供一种用于实施本文所述方法的试剂盒以及使用该试剂盒以检测如本文所述的生物标记的存在或含量的说明书。

还提供一种试剂的用途，该试剂特异性识别如本文所述的生物标记以用于在有需要的个体中诊断肾病变，或用于在糖尿病患者中预测糖尿病性肾病变或ERFD，或用于制备试剂盒或组合物，用于在有需要的个体内诊断肾病变，或用于在糖尿病患者中预测糖尿病性肾病变或ERFD。

于以下的描述中阐述了本发明的一个或多个具体实施例的细节。从以下几个具体实施例的详细描述以及所附申请专利范围，本发明的其他特征或优点将变得显而易见。

附图说明

为了说明本发明，以下说明具体实施例。然而，应该理解的是，本发明不限于所示的较佳具体实施例。

于附图中：

图1所示为来自健康个体以及患有WDM-NP、DM-WNP，以及DM-NP的患者的尿液样品的代表性MALDI-TOF质谱。

图2A-2B所示为来自39个健康的、44个WDM-NP、85个DM-WNP，以及51个DM-NP个体的尿液样品中(2A)11.7kDa以及(2B)15.8kDa蛋白质的排泄含量。相对强度表示为盒形图，表示为具有四分位数值的介质(25％，75％)。误差线表示最小值与最大值。*p<0.05，***p≤0.001。

图3所示为通过nanoLC-M/MS鉴定m/z 647.91峰的对应胜肽。

图4A-4B所示为来自39个健康的、44个WDM-NP、85个DM-WNP，以及51个DM-NP个体的尿液样品中(图4A)β2-微球蛋白(B2M)以及(图4B)克氏细胞蛋白(CC16)的排泄含量。相对强度表示为盒形图，表示为具有四分位数值的介质(25％，75％)。误差线表示最小值与最大值。*p<0.05，**p<0.01，***p≤0.001。

具体实施方式

为了提供对本发明的清楚并快速的理解，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了额外的定义。除非另有定义，否则本文所用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。

如本文所用，冠词“一”以及“一个”是指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一组件”表示一个组件或多于一个组件。

如本文所用，“约”或“近似”等词是指本领域普通技术人员将理解的可接受偏差程度，这可能会有所不同，具体取决于使用它的环境。通常，“约”或“近似”可表示在引用值附近具有±10％范围的数值。

如本文所用，“包含(动词)”或“包含(动名词)”等词通常以包括(动词)/包括(动名词)的含义使用，其代表允许存在一种或多种特征、成分或组成分。“包含(动词)”或“包含(动名词)”等词包括“由......组成(动词)”或“由......组成(动名词)”等词。

如本文所用，“受试者”、“个体”以及“患者”等词是指需要诊断、预后、治疗或医疗的任何哺乳动物个体，特别是人类。其他个体可包括牛、狗、猫、天竺鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。

如本文所用，本文使用的“诊断”一词通常包括确定个体是否可能受目标疾病、病症，或功能障碍的影响。本领域技术人员通常基于一种或多种诊断指针(即，标记)进行诊断，诊断该标记的存在、不存在，或其指示疾病、病症或功能障碍的存在或不存在的含量。本领域技术人员将理解，诊断并不表示以100％的准确度确定特定疾病的存在或不存在，而是在个体中存在某种疾病的可能性增加。

如本文所用，“抗体”一词是指能够结合抗原的免疫球蛋白。本文使用的抗体意指包括完整抗体以及能够结合抗原决定位、抗原，或目标抗原片段的任何抗体片段(例如，F(ab')

如本文所用，“治疗”一词是指将一种或多种活性剂应用或施用于个体，该个体受疾病、该疾病的症状或病症，或该疾病的进展的影响，目的在于治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善，促进，或影响该疾病、该疾病的症状或病症，由该疾病引起的残疾，或该疾病的进展。

如本文所用，“预防”一词是指针对疾病或疾病的症状或病症的预防或避免的措施，其包括，但不限于，将一种或多种活性剂应用或施用于一个体，该个体为尚未被诊断为患有该疾病或该疾病的症状或病症的患者，但可能受该疾病影响或容易罹患该疾病。预防措施的目的在于避免、预防，或推迟该疾病的发生或该疾病的症状或状况。

如本文所用，“正常个体”一词可用于指基本上处于健康状态而没有特定疾病(例如，肾病变)的个体，并且可以指单个正常/健康个体或一群正常/健康的个体。

如本文所用，“对照个体”一词可用于指未患有目标疾病(例如，肾病变)的个体，并且可以指单个对照个体或一群对照个体。在部分具体实施例中，对照个体可以指正常/健康个体。在部分具体实施例中，对照个体可以指未患有肾病变的个体(或糖尿病患者)。

如本文所用，“异常量”是指相较于未患有目标疾病(例如，肾病变)的个体或参考虑或对照量，增加的指示剂的量。特定而言，例如，异常量可以比参考虑高出5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或100％或更多。参考虑可指对照样品(例如，不含目标疾病的组织或细胞或任何生物学样品)中测量的量。于本领域中，通过使用常规检测以及统计方法分析来自正常个体群体的样品中标记的检测量，可以获得一范围的正常量值。

如本文所用，如本文所用的生物标记的“低表现”以及“高表现”是指相对于样品中发现的生物标记含量的相对术语。在部分具体实施例中，可通过比较对照组、未患病样品中的生物标记表现含量，以确定低表现及高表现，其中低表现可指相对于对照、未患病样品的表现含量为较低或相当的表现含量，而高表现可指对相对于对照、未患病样品中的表现含量为较高的表现含量。

如本文所用，生物学标记(生物标记)为客观测量并评价的特征(例如，蛋白质、氨基酸、代谢物、基因或遗传表现)，作为正常或异常生物过程、疾病、致病过程，或对治疗或治疗干预的反应的指标。生物标记可包括存在或不存在指示特定生物过程的特征或模式或特征的集合。生物标记测量可增加或减少以指示某种生物事件或过程。标记主要用于诊断及预后目的。然而，其可用于本文所述的治疗、监测、药物筛选以及其他目的，包括评估治疗剂的有效性。

如本文所用，待通过本文所述的任何方法分析的生物样品可为从待诊断的个体获得的任何类型的样品。在部分具体实施例中，生物样品可为体液样品，例如，血液样品、尿液样品，或腹水样品。通常，生物样品为尿液样品。在其他具体实施例中，血液样品可为全血或其部分，例如血清或血浆，进行肝素化或EDTA处理，以避免血液凝固。或者，该生物样品可为组织样品或从肾取得的活体组织切片样品。

如本文所用，如本文所用的“生理参数”一词通常是指可被监测以确定与患者相关的一种或多种定量生理层面及/或活性的任何参数。生理参数的实例包括，但不限于，年龄、性别、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、空腹血糖(FBG)、血红蛋白A1c(HbA1c)、糖尿病持续时间、肌酸酐、预估的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、白蛋白尿、尿白蛋白与肌酸酐比(albumin to creatinine ratio，ACR)及其任何组合。在某些特定具体实施例中，该生理参数包括空腹血糖(FBG)及/或舒张压(DBP)。

如本文所用，“肾病变”一词是指其中发生肾损伤的生理状况，其特异性地破坏其适当调节血液与尿液中溶质浓度的能力。肾病变可通过一种或多种病理学变化来描述特征：肾小球大小、簇状纤维化、鲍氏囊纤维化、扩张、微血管变窄、基底膜增厚、细胞增多(肾小球环间膜或内皮)、白血球浸润、微血管血栓、肾小管萎缩、坏死、液泡及透明液滴变化、基底膜增厚、扩张、发炎细胞与管腔内的铸型、间质纤维化、水肿、急性与慢性白血球浸润、小动脉纤维化、血栓形成，透明变化及变窄。一般而言，在肾病变的早期阶段，肾脏仍能很好地过滤掉血液中的废弃物；在中期阶段，肾脏可能需要更加努力地摆脱废弃物；在晚期阶段，肾脏可能会停止工作。通常且常规地，可以通过尿蛋白浓度来评估肾病变。肾病变的早期临床特征可能为尿液中白蛋白浓度低但异常(白蛋白排泄率(albumin excretion rate，AER)：30-300mg/24小时；或白蛋白对肌酐比(albumin to creatinine ratio，ACR)：30-300mg/g)，称为微量白蛋白尿，该患者患有初始肾病变(初期肾病变)；若未经过适当的治疗，这样的患者会发展为持续的微量白蛋白尿并转变为严重的肾病变(明显的肾病变)，也称为大量白蛋白尿(白蛋白排泄率(AER)>300mg/24小时或白蛋白对肌酐比(ACR)>300mg/g)，最后进展为末期肾病变(end stage renal disease，ERSD)。预估的肾小球滤过率(eGFR)也可作为肾病变的指标。慢性肾病变(CKD)可以下列情况定义：在带有或没有蛋白尿的患者中具有预估的肾小球滤过率(eGFR)低于60ml/min超过3个月；或是尽管预估的肾小球滤过率(eGFR)含量低或高，但蛋白尿超过3个月。还可以基于例如血清肌酸酐浓度、尿蛋白浓度、尿蛋白与肌酸酐比，或通过使用追踪剂化合物如邻苯二甲酸酯来评估肾病变。

在部分具体实施例中，慢性肾病变(CKD)可被认为包括五(5)个肾损伤阶段，从阶段1中的非常轻微的损伤到阶段5中的完全肾衰竭。参见表A。

表A.慢性肾病变(CKD)的不同阶段。

特定而言，如本文所述的慢性肾病变(CKD)的早期阶段可包括如上所示的阶段1与阶段2，这些患者可具有相对较高(正常)的预估的肾小球滤过率(eGFR)但具有至少一个肾损伤迹象，例如微量白蛋白。

如本文所用，“糖尿病性肾病变”一词是指由糖尿病引起的肾病变。于某些具体实施例中，该糖尿病为第二型糖尿病。许多糖尿病患者在微量白蛋白尿发病前经历了早期进行性肾功能衰退(ERFD)，尽管他们仍可能具有正常的肾功能。一旦衰退过程开始，没有适当的治疗，它会进展并可能导致肾功能受损。特定而言，当预估的肾小球滤过率(eGFR)在每1.73m

本申请(至少部分地)基于将CC16鉴定为新的可靠的肾病变生物标记。如以下一些实施例所证明的，在患有肾病变的个体的尿液样品中发现CC16含量增加。因此，本文描述的肾病变检测方法可用于鉴定个体是否患有、怀疑患有，或具有发展肾病变的风险。本文描述的检测方法可应用于任何个体，尤其是作为初始、常规，以及经常性(或早期)筛选的方法，以鉴定患有肾病变或具有进展性肾病变风险的那些患者。如在以下其他实施例中进一步证明的，糖尿病患者中CC16的存在与早期进行性肾功能衰退(ERFD)的后期发展相关。因此，当应用于糖尿病患者时，本文所述的检测方法可用于预测发生ERFD或糖尿病性肾病变的风险。

在部分具体实施例中，进一步B2M以提高该检测的准确性。

如本文所用，克氏细胞蛋白(CC16)为15.8-kDa同型二元体蛋白，其由非纤毛细支气管克氏细胞在气道中大量分泌。已经显示CC16调节发炎反应的各种介质的产生及/或活性，包括PLA2、干扰素-γ以及肿瘤坏死因子-α(Clinical&Experimental Allergy 30(4):469-75，2000年5月)。β2-微球蛋白(B2M)为主要组织兼容性错合物(majorhistocompatibility complex，MHC)第I类分子的次单位。这些蛋白质生物标记的氨基酸序列为本领域熟知的，例如CC16：P11684，与B2M：P61769。

可通过常规技术确定生物样品中本文所述的生物标记的存在以及含量。在部分具体实施例中，如本文所述的生物标记的存在及/或含量可通过质谱分析确定，其允许以高灵敏度以及具有再现性直接测量分析物。有许多质谱分析方法可供选择。质谱分析的实例包括，但不限于，基质辅助激光脱附电离飞行时间质谱仪(matrix-assisted laserdesorption ionization/time of flight，MALDI-TOF)、表面增强激光解吸电离/飞行时间质谱仪(surface-enhanced laser desorption ionisation/time of flight，SELDI-TOF)、液相色层分析-质谱仪(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、液相色层分析串联质谱仪(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS-MS)，以及电喷雾电离质谱仪(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)。这种方法的一个实例为串联质谱仪(tandem mass spectrometry，MS/MS)，其涉及质量选择或分析的多个步骤，通常通过某种形式的碎片分开。

于其他具体实施例中，生物标记的存在及/或含量可通过免疫分析来确定。免疫分析的实例包括，但不限于，西方墨点分析法、酵素联结免疫吸附分析(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)、放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、放射免疫沉淀分析(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)、免疫荧光分析(immunofluorescenceassay，IFA)、酵素联结荧光免疫分析(enzyme-linked fluorescent immunoassay，ELFA)、电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)，以及毛细管凝胶电泳(capillary gelelectrophoresis，CGE)。于一些实例中，可使用特异性识别该生物标记的试剂来确定该生物标记的存在及/或含量，例如特异性结合该生物标记的抗体。

如本文所用的抗体可为多株抗体或单株抗体。通过以有效量的胜肽或抗原组分注射至适合的实验动物，从该动物收集血清，并通过任何已知的免疫吸附技术分离特定血清来制备针对特定蛋白质的多株抗体。可容易地用于产生本发明中使用的多株抗体的动物包括鸡、小鼠、兔、大鼠、山羊、马等。

为了进行本文所述的方法，于生物样品中检测或测量本文所述的生物标记的含量，该生物样品取自有此需要的个体(例如，没有任何肾病变症状的人类患者，或患有、怀疑患有肾病变或具有罹患肾病变风险的人类患者)通过本领域已知的任何方法进行，例如本文所述的那些方法，如质谱仪。通常，该生物样品为尿液样品。

在部分具体实施例中，可以将源自候选个体的样品中的生物标记的含量与标准值进行比较。如本文所述的更高量的生物标记可以指示阳性结果，亦即该个体患有肾病变或具有发展肾病变的风险，或者当该个体为糖尿病患者时，他/她具有发展糖尿病性肾病变或早期进行性肾功能衰退(ERFD)的更高风险。标准值表示在该对照样品中如本文所述的生物标记的含量。该对照样品可取自未患有肾病变的个体。另外，该对照样品可取自一群这样的个体的样品的混合物。或者，该对照个体在例如年龄、性别及/或种族背景中与候选个体匹配。较佳地，该对照样品与候选个体的生物样品为相同物种的样品。

于某些实例中，对照样品中标记的含量在对照样品中是无法被检测到的(亦即，参考值为0)，使用常规分析方法，例如，质谱法与免疫分析，以及使用相同分析法在来自个体的生物样品中检测到的标记(可检测标记)的存在则可以指示一阳性结果。

在部分具体实施例中，CC16被检测为根据本发明的第一生物标记。相较于该生物标记的(第一)对照含量，该第一生物标记的更高含量可指示第一阳性结果。于一些另外的具体实施例中，进一步检测B2M作为根据本发明的第二生物标记。相较于该生物标记的(第二)对照含量，该第二生物标记的更高含量可指示第二阳性结果，具有增加的准确性。于更进一步的具体实施例中，可以另外测量一个或多个生理参数。例如，这种生理参数可选自由预估的肾小球滤过率(eGFR)、白蛋白尿、尿白蛋白与肌酸酐比(ACR)，以及其任何组合所组成的群组。

当个体，例如人类患者，被诊断为患有、怀疑患有肾病变或具有罹患肾病变的风险时，该个体可进行进一步的测试(例如，常规物理测试，包括手术活体组织切片或成像方法，例如X-射线成像、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)或超音波)以确认疾病的发生及/或确定肾病变的阶段与类型。

在部分具体实施例中，本文所述的方法可进一步包括治疗该肾病变患者以至少缓解与该疾病相关的症状。可以通过给予肾病变的常规药物进行治疗。此类药物的实例包括，但不限于，(i)用于减少白蛋白尿的药物，例如磷酸二酯酶抑制剂，例如，双嘧达莫以及己酮可可碱；(ii)抗高血压药物，如血管紧缩素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制剂，例如，咪达普利，以及血管紧缩素受体阻断剂(angiotension receptor blocker，ARB)，例如，氯沙坦；(iii)磷酸盐结合剂，例如，司维拉姆碳酸盐、碳酸镧，以及Al(OH)

如本文所用，“有效量”是指可以单独或与一种或多种其他活性物质组合施用于该个体的每种活性物质的量，以赋予该个体治疗效果。可变动该有效量且必须由本领域技术人员确定，这取决于给药时的具体情况、病症的严重程度、患者的各个参数，包括性别、年龄、体重、身高、身体状况、治疗方案、平行治疗的性质(如果有的话)、特定的给药途径，以及由医务人员的知识和专业判断的其他可能因素。这些因素为本领域普通技术人员所熟知的，并且无需进一步的常规实验即可引入。

本发明还提供用于实施该方法的试剂盒或组合物，其包括特异性识别如本文所述的生物标记的试剂(例如，抗体或标记试剂)。该试剂盒可进一步包括使用该试剂盒检测本文所述的生物标记的存在或含量的说明书，进而在有此需要的个体中检测肾病变，或用于预测糖尿病患者中的糖尿病性肾病变或早期进行性肾功能衰退(ERFD)。包含如本文所述的检测试剂的组成分可以试剂盒的形式包装在一起。例如，检测试剂可以包装在单独的容器中，例如抗体(与固体基质结合或与用于将它们结合到基质的试剂分开包装)，对照试剂(阳性及/或阴性)及/或可检测的标记，用于进行分析的说明(例如，书写、磁带、VCR、CD-ROM等)也可包括在该试剂盒中。例如，该试剂盒的分析形式可为芯片或酵素联结免疫吸附分析(ELISA)。进一步提供了这种试剂用于实施本文所述方法的用途。这种试剂包括特异性识别生物标记的试剂。在部分具体实施例中，此类试剂包括(i)特异性识别CC16的分子，可选择地(ii)特异性识别B2M的分子，或(iii)(i)与(ii)的组合。该试剂可以与载体混合，例如医药上可接受的载体，以形成用于检测或诊断目的的组合物。这种载体的实例包括可注射盐水、可注射蒸馏水、可注射缓冲溶液及其类似物。

无需进一步详细说明，相信本领域技术人员将能够基于以上描述最大程度地应用本发明。因此，以下具体实施例的目的在于说明，而非以任何方式限制本发明的适用范围。本文引用的所有文献均通过引用并入本文。

实施例

在本研究中，使用C

缩写：DM(diabetes mellitus)＝糖尿病；DN(diabetic nephropathy)＝糖尿病性肾病变；WDM-NP(patients with micro-or macroalbuminuria due to nondiabeticdisease)＝由于非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿的患者；DM-WNP(patients withtype 2diabetes mellitus without micro-or macroalbuminuria)＝不具有微量或大量白蛋白尿的第二型糖尿病患者；DM-NP(patients with type 2 diabetes mellitus withmicroalbuminuria)＝具有微量白蛋白尿的第二型糖尿病患者；MALDI-TOF-MS＝基质辅助激光脱附/电离飞行时间质谱仪；SELDI-TOF-MS(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)＝表面增强激光解吸电离/飞行时间质谱仪；SA(Sinapic acid)＝芥子酸；CC16＝克氏细胞蛋白；B2M＝β2-微球蛋白。

1.材料与方法

1.1化学品

聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)预聚物购自Dow Corning公司(Sylgard 184密德兰县，密执安州，美国)。乙腈(Acetonitrile，ACN)以及三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)购自J.T.Baker公司(菲利普斯堡，纽泽西州，美国)。二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)，以及甲酸(formic acid，FA)购自Sigma-Aldrich公司(圣刘易斯市，密苏里州，美国)。十八烷基涂覆的二氧化硅颗粒(C

1.2研究人口及样品

横切面研究设计用于通过C18盘/MALDI-TOF MS发现及验证蛋白质标记。研究方案，包括样品采集、制备，以及分析，由中国台湾台中市的中国医药大学的地方伦理委员会批准，并按照赫尔辛基宣言的原则进行。所有个体(n＝238)在研究之前已经提供了他们的知情同意书。根据临床病程以及尿白蛋白排泄含量定义以下4组：具有微量白蛋白尿的糖尿病患者(DM-NP；n＝53，30<白蛋白与肌酸酐比(ACR)<300mg/g)，不具有微量或大量白蛋白尿的糖尿病患者(DM-WNP；n＝87，白蛋白与肌酸酐比(ACR)<30mg/g)，非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者(WDM-NP；n＝48，30mg/g<白蛋白与肌酸酐比(ACR))，以及健康对照组(n＝50；白蛋白与肌酸酐比(ACR)<30mg/g)。该4组的临床特征如表1所示。

表1.健康、WDM-NP、DM-WNP，以及DM-NP个体的临床与生化参数。

数值表示为平均值±标准偏差。WDM-NP组，由非糖尿病引起的微量或大量白蛋白尿患者；DM-WNP组，不具有微量或大量白蛋白尿的糖尿病(DM)患者；DM-NP，具有微量白蛋白尿的糖尿病患者；BMI，身体质量指数；eGFR，预估的肾小球滤过率；ACR，白蛋白与肌酸酐比。

1.3研究人群进行后续核查

共有125名第二型糖尿病(T2D)个体，其中56名患有早期进行性肾功能衰退(ERFD)(病例)，69名没有早期进行性肾功能衰退(ERFD)(对照)被纳入该巢式病例对照研究。所有患者在入组时肾功能正常(预估的肾小球滤过率[eGFR]>60mL/分钟/1.73m

1.4用于蛋白质分析的尿液样品制备

将中段尿液收集在15mL离心管中用于蛋白质取样。为了降低蛋白质降解效果，将500μL蛋白酶抑制剂混合物溶液(1种蛋白酶抑制剂片剂溶解在10mL二次蒸馏水(ddH

1.5通过C

根据我们之前的研究[11]制造C

1.6蛋白质标记峰的纯化

使用配备有LC管柱(XBridge Protein BEH C

1.7溶液内消化

将m/z 15800处的纯化的蛋白质标记峰重新溶解在4M尿素中，并于37℃下以10mMDTT还原45分钟。然后，加入55mM IAA，将混合物于黑暗中于25℃作用60分钟。向蛋白质溶液中加入碳酸氢铵缓冲液(10mM)以将尿素浓度降至1M以下。然后将胰蛋白酶以1:25(w/w)的酶-基质比率在37℃下加入蛋白质溶液中作用16小时。将胜肽溶液以C

1.8 NanoLC-MS/MS分析

NanoLC-MS/MS使用纳米流超高效液相色层分析系统(UltiMate 3000 RSLCnano系统；Dionex公司)与混合四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪(maXis Impact；Bruker公司)偶联进行。样品上样后，将胜肽从捕获管柱中流洗到分析管柱(Acclaim PepMap C

1.9蛋白质数据库检索

使用DataAnalysis(版本4.1；Bruker公司)将nanoLC-MS/MS获得的光谱转换为xml档案，并使用MASCOT(版本2.2.07)针对Swissprot(版本51.0)数据库进行搜索。前体离子以及碎片离子耐受性的MASCOT搜索参数分别为80ppm以及0.07Da。选择了以下搜索参数：分类学(Taxonomy)、人类(Human)；错过的分裂(missed cleavages)，1；酵素(enzyme)、胰蛋白酶(trypsin)；固定修饰(fixed modifications)，胺基甲酰基甲基(carbamidomethyl)(C)；以及可变修饰(variable modifications)，氧化(oxidation)(M)以及去酰胺(deamidation)(NQ)。如果胜肽的个体MASCOT离子评分高于25(p<0.01)，则被认为胜肽是“受到鉴别的”。

1.10 B2M以及克氏细胞蛋白的ELISA测量

根据制造商的说明书，使用商业试剂盒(Cloud-Clone公司)通过酵素联结免疫吸附分析(ELISA)测量尿液β2-微球蛋白(B2M)以及克氏细胞蛋白(CC16)浓度。所有样品均使用相同的设备以及同一实验室技术人员处理，他们对所有临床数据不知情。Mann-Whitney检验用于比较中间值的差异，其表示为具有四分位数值的中间值(25％，75％)。

1.11统计分析

连续数据表示为平均值以及标准偏差或中位数以及四分位数范围，分类数据表示为比例。两个独立的样本T检验用于比较连续变量的均值，卡方检验用于比较组间分类变量的频率。使用逻辑回归模型估算潜在的尿生物标记以及早期进行性肾功能衰退(ERFD)之间的关联，并计算优势率(OR)以及95％信赖区间(confidence intervals，CIs)。构筑接受者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线以确定潜在生物标记的灵敏度与特异性。使用SigmaPlot 11.1(Systat软件公司，加州，美国)以及SPSS统计软件22.0(IBM公司，纽约州，美国)进行统计学分析。p值小于0.05(双侧)被认为是显著的。

2.结果

2.1以C

尿液中的高盐含量会干扰MALDI结晶并导致较差的质谱仪信号。为了评估盐对尿蛋白质分析的影响，将20μL尿液直接应用于MALDI-TOF MS分析而不去盐。为了避免盐干扰效应，我们使用疏水性C

为了评估在该研究中获得蛋白质谱所需的最小蛋白质量，测试了不同的尿蛋白量。当施用0.6-2.38μg量时获得相似的蛋白质谱。在健康、WDM-NP、DM-WNP，以及DM-NP组别的尿液样品中通过Bradford蛋白质分析法测量的蛋白质浓度(表示为具有四分位数值的中间值(25％，75％))分别为0.06μg/μL(0.03–0.09μg/μL)、0.34μg/μL(0.13–1.11μg/μL)、0.05μg/μL(0.03–0.08μg/μL)，以及0.13μg/μL(0.10–0.19μg/μL)。因此，在该研究中，20μL尿液样品中的蛋白质量足以提供信息蛋白质谱。

2.2正常以及病理性尿液中的蛋白质排泄模式

通过MALDI-TOF MS分析来自87个DM-WNP患者、53个DM-NP患者、48个WDM-NP患者，以及50个健康对照的去盐尿蛋白样品。来自健康以及WDM-NP个体的代表性MALDI-TOF质谱显示在图1中。发现m/z 11732±2(或氧化形式m/z11748±2)以及m/z 15840±3(或氧化形式m/z～15856±3)的显著峰在WDM-NP以及DM-NP个体内高度表现；还进行了它们的代表性假凝胶以及光谱分析(数据未显示)。使用9.7kDa的峰(鞘脂苷B)作为内部标准品，以评估11.7kDa以及15.8kDa的两个蛋白质标记峰的诊断值。如图2A所示，WDM-NP以及DM-NP的峰值比率为11.7/9.7kDa，显著高于健康组(p<0.001)。在WDM-NP以及DM-NP的峰值比率为15.8/9.7kDa，这显著高于健康组(p<0.001)以及DM-WNP组(p<0.001)(图2B)。

为了区分WDM-NP患者以及健康个体，研究了接受者操作特征(ROC)图的曲线下面积(area under the curve，AUC)。对于11.7kDa峰，曲线下面积(AUC)为0.75，对于15.8kDa峰，曲线下面积(AUC)为0.74。因为这两个峰可以在单个MALDI-TOF质谱中同时检测，所以两者都可以作为诊断标记。这2个峰的敏感性及特异性分别为77.3％以及91.8％，改善的曲线下面积(AUC)为0.8，因此可作为区分WDM-NP(肾病变)以及健康个体的标记。对于DM-NP(糖尿病性肾病变)与DM-WNP患者的区分，对于11.7kDa峰，曲线下面积(AUC)为0.6，对于15.8kDa峰，曲线下面积(AUC)为0.67。在这种情况下，这两个峰的组合标记具有66％以及73％的灵敏度以及特异性，曲线下面积(AUC)为0.62。

2.3差异表现蛋白的纯化与鉴定

据报导，11.7kDa峰值为β2-微球蛋白(B2M)[14]，且在我们之前的研究[15]中也有鉴定。为了确认15.8kDa峰的特性，尿液样品通过C

2.4 B2M以及CC16的ELISA评估

由于酵素联结免疫吸附分析(ELISA)通常用于临床实验室以量化蛋白质标记丰度以用于诊断，所以对11.7kDa B2M以及15.8kDa CC16进行ELIS)以评估尿液中两种标记的相对丰度。(图4)WDM-NP、DM-NP，以及DM-WNP组的B2M表现显著高于健康对照组(p<0.001)。然而，DM-NP组的CC16的表现只有相对于DM-WNP组(p<0.05)以及健康对照组(p<0.001)显著较高。为了区分WDM-NP患者以及健康个体，评估接受者操作特征(ROC)图的曲线下面积(AUC)，发现B2M为0.87，CC16为0.67，B2M以及CC16的组合的曲线下面积(AUC)为0.74。在区分DM-NP与DM-WNP的情况下，B2M的曲线下面积(AUC)为0.59，CC16的曲线下面积(AUC)为0.60，组合的曲线下面积(AUC)为0.60。

2.5验证已发展为ERFD的T2D患者的蛋白质标记

巢式病例对照研究设计用于研究B2M以及CC1)在第二型糖尿病(T2D)患者肾病变发展中的预测能力。作为主要终点的具有(n＝56)以及不具有(n＝69)早期进行性肾功能衰退(ERFD)的第二型糖尿病(T2D)个体在基线检查时具有相似的人口统计学(年龄与性别)、糖尿病持续时间、BMI、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、HbA1c、肌酸酐以及白蛋白与肌酸酐比(ACR)。ERFD患者的预估的肾小球滤过率(eGFR)高于不具有ERFD的患者(平均±标准偏差：114.13±25.86对98.86±23.36[p值＝0.001])。白蛋白与肌酸酐比(ACR)不是预测ERF)的基线的重要标记(卡方检验的p值为0.196(表2))。对于两个潜在的尿标记，56例具有ERFD的第二型糖尿病(T2D)患者中的16例(28.6％)以及69例不具有ERFD的第二型糖尿病(T2D)患者中的9例(13.0％)在基线时具有可检测的CC1)标记(克氏细胞蛋白(CC16)/SAP比>0)(卡方检验的p值为0.031(表2))。两组之间没有观察到B2M存在的显著差异(ERFD以及非ERFD组为39.3％对上31.9％，p＝0.389)。数据显示克CC16在基线时的存在与ERFD的后期发展有关。

表2.以预估的肾小球滤过率(eGFR)下降/年≧3.3％分层(ERFD)的人口统计学以及临床特征

缩写：ACR，白蛋白与肌酸酐比；SBP，收缩压；DBP，舒张压；eGFR，预估的肾小球滤过率；

BMI，身体质量指数；ERFD，早期肾功能下降；DM，糖尿病。

第1组：B2M/SAP_MALDI比率＝0，且CC16/SAP MALDI比率＝0

第2组：B2M/SAP_MALDI比率＝0，且CC16/SAP MALDI比率>0，

B2M/SAP_MALDI比率>0，且CC16/SAP MALDI比率＝0

第3组：B2M/SAP_MALDI比率>0，且CC16/SAP MALDI比率>0

逻辑回归用于进一步检查潜在生物标记B2M以及CC1的独立或组合对ERFD的影响(表3)。当比较具有标记的个体以及不具有标记的个体时，对于β2-微球蛋白(B2M)标记以及克氏细胞蛋白(CC16)标记，在调整追踪时间后，ERFD的优势率(OR)分别为2.01(95％CI：0.90-4.52)以及4.87(95％CI：1.77-13.44)。此外，CC16以及B2M组合应用可增加ERFD风险的显著累加效果(交互项的p值＝0.003)。当比较具有两种标记的个体以及没有任何标记的个体时，ERFD的优势率(OR)为7.59(95％CI：1.97-29.24)。

表3.逻辑回归模型

第1组：B2M/SAP_MALDI比率＝0，且CC16/SAP MALDI比率＝0

第2组：B2M/SAP_MALDI比率＝0，且CC16/SAP MALDI比率>0，

B2M/SAP_MALDI比率>0，且CC16/SAP MALDI比率＝0

第3组：B2M/SAP_MALDI比>0，且CC16/SAP MALDI比率>0

3.讨论与结论

最近，MALDI-TOF MS已成功被核准作为医院常规细菌鉴定的体外诊断设备[16]。因此，通过MALDI-TOF MS检测的疾病标记对于临床使用变得实用。由于尿液中的盐会干扰MALDI-TOF质谱信号，因此在本研究中，使用C

β2-微球蛋白(B2M)是一种低分子量蛋白质，被肾小球过滤并在近端小管中退化[17]。一些研究表示，B2M在肾小管损伤中增加，表示B2M为肾小管损伤的早期诊断标记[18,19]。在第二型糖尿病中，尿的B2M排泄与大血管疾病[20]以及肾病变[1,21,22]有关。

15.8-kDa克氏细胞蛋白(CC16)(也称为CC10、子宫珠蛋白，或尿蛋白1)通过肾小球滤过迅速消除，并在肾近端小管细胞中重新吸收并分解代谢。近端小管细胞的功能障碍可导致CC16的再吸收减少及其尿液中的含量增加。据报导，CC16为成人[23]以及儿童[24]患者近端肾小管功能障碍的标记。这种蛋白质标记对近端肾小管功能障碍中非常微小的缺陷很敏感，这些缺陷可能无法通过检测经典的尿液低分子量蛋白质来检测[25]。据我们所知，我们的研究是第一个在肾病变和糖尿病性肾病变(DN)患者尿液中发现CC16表现的研究。

通过长期追踪研究，发现B2M以及CC16发生早期进行性肾功能衰退(ERFD)的优势率(OR)为7.59)是在基线中尚未表现出明显肾脏疾病的第二型糖尿病(T2D)患者中ERFD的独立预测因子，并表示B2M以及CC16的蛋白质峰值通过C18盘/MALDI-TOF检测可以提高尿白蛋白出现前预测肾病变的敏感性。

通过大样本量的分析，我们发现并验证了2个蛋白质峰，B2M(11.7kDa)以及CC16(15.8kDa)，作为与肾病变相关的生物标记，并验证了包括糖尿病以及非糖尿病患者在内的238个人的辨别能力。用于发展ERFD的组合的B2M以及CC16标记的优势率(OR)为7.59(95％CI：1.97-29.24)。这是CC16作为肾病变以及糖尿病性肾病变(DN)的尿标记的第一份报导。因此，我们通过C

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