一种细菌生物膜囊泡（BBV）作为疫苗载体的构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种细菌生物膜囊泡(BBV)作为疫苗载体的构建方法和应用。

背景技术

SARS-CoV-2是一种新型的冠状病毒，其表面具有明显的刺突结构，突刺蛋白上的RBD可以和受体细胞的ACE2结合，从而介导病毒的入侵。虽然在实验动物模型中已经发现一些药物可以治疗COVID-19，但相比治疗药物而言，SARS-CoV-2疫苗的研发寄托了更多的期望。目前灭活疫苗、mRNA疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗等SARS-CoV-2疫苗都已经进入临床实验。但是目前的疫苗形式存在生产成本较高、产量低、运输困难等多种限制性问题。

RBD被认为是有效的疫苗靶点，针对RBD的疫苗在真核表达系统中表达后已经被证明能诱导抗病毒中和抗体。从SARS-CoV-2的结构出发，RBD的三聚体结构有着重要的功能，已经证明了RBD聚合结构的疫苗形式可以提高疫苗诱导的中和作用。通过原核细胞表达系统可以以较低的成本，实现外源蛋白的高效表达并极大的提高疫苗产量，但原核表达系统难以实现对目标蛋白的正确折叠及组装，因此严重的限制了原核表达系统在病毒性疫苗领域的发展，若能在原核系统中实现RBD的正确暴露及组装，将有利于发展SARS-CoV-2廉价疫苗。

通常在大肠杆菌中实现外源蛋白正确折叠的能力很差，外源蛋白经常以错误折叠的包涵体形式存在，利用细菌外膜囊泡来展示外源蛋白可以提高外源蛋白的折叠能力，并借助OMV被DC细胞的高效摄取的特点来提高免疫应答能力。虽然已经很有多研究证明OMV可以成为有效的疫苗载体，包括细菌性疫苗、病毒性疫苗、以及肿瘤疫苗，但是非常不幸，OMV呈递外源蛋白的能力非常有限，且由于OMV靠细菌天然分泌而难以进行人为控制，因此其产量极低。更严重的是，OMV作为细菌分泌的通讯介质，富含很多胞内蛋白以及核酸成分，这带来了蛋白毒性和耐药基因传递的危害，综上所述，产量、基因工程改造能力、安全性等问题都极大的限制了OMV作为疫苗载体的应用。

细胞膜的自组装技术已经在哺乳动物细胞中被广泛报道，包括红细胞膜、中性粒细胞膜、巨噬细胞膜等。但细菌生物膜含有更多的外膜蛋白、多糖、肽聚糖等，给膜组装技术带来困难，目前细菌生物膜的组装技术仍停留在利用细菌本身释放的OMV基础上，例如利用OMV与肿瘤细胞融合，利用OMV包括金颗粒，利用OMV携带药物等，但OMV的产量及修饰效率低，严重限制了细菌膜载体技术的发展。若能直接利用细菌细胞本身实现生物膜组装将大大提高囊泡产量及外源修饰蛋白的荷载效率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于克服OMV的不足，提供一种细菌生物膜囊泡(BBV)作为疫苗载体的构建方法和应用，直接利用细菌细胞本身实现生物膜组装，提高囊泡产量及外源修饰蛋白的荷载效率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种细菌生物膜囊泡(BBV)作为疫苗载体的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，利用基因工程技术将外源基因连接到编码外膜锚定蛋白的基因3’端，并将一个或多个表达单元克隆进入大肠杆菌质粒中得到重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌中，并在培养基中培养，当菌液OD600达到0.4～0.6时，加诱导剂来诱导重组蛋白表达；

步骤2，当OD600达到1.0时，将培养基离心，去除上清，细菌沉淀经洗涤后重悬，得到细菌悬浮液；

步骤3，高压处理：对得到的细菌悬浮液进行高压均质处理，得到的悬浮液经离心，收获上清液，上清液再经超速离心，去除上清取细菌沉淀，经重悬得到基因工程修饰的囊泡悬浮液；

步骤4，利用柱层析纯化或密度梯度离心纯化所述基因工程修饰的囊泡悬浮液，获得纯化后的基因工程修饰的BBV；

所述密度梯度离心使用的离心介质包括碘克沙醇、氯化铯和蔗糖。

进一步的，步骤1中所述锚定蛋白为具有膜靶向作用的蛋白或非膜靶向作用的牵引蛋白。所述具有膜靶向作用的蛋白包括但不限于ClyA蛋白、OmpA、 OmpW、Hbp，所述非膜靶向作用的牵引蛋白包括但不限于TAT、Flag、Trx、His 进一步的，步骤1中所述外源基因包括编码各类病毒性抗原、细菌性抗原、自身抗原、肿瘤抗原的基因。

进一步的，步骤2中在进行离心前，将C

进一步的，步骤3中所述高压均质处理的压力范围在200bar～2000bar。

本发明的另一方面：

一种疫苗，所述疫苗由上述构建方法得到的基因工程修饰的BBV为活性成分制备得到。

进一步的，所述疫苗的应用方式包括皮下注射、肌肉注射、吸入及口服。

本发明的另一方面：

所述疫苗作为其他疫苗载体的用途，所述其他疫苗包括肽疫苗、亚单位疫苗、 DNA疫苗、RNA疫苗；

所述疫苗作为药物递送载体的用途，所述药物包括抗肿瘤药物、抗菌药物、示踪药物；

所述免疫刺激包括固有免疫激活、肿瘤免疫调控、疫苗佐剂。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、利用ClyA模拟了SARS-CoV-2的S2蛋白支撑S1的结构，通过本发明所述的构建方法，将RBD高效的呈现在自组装的细菌生物膜囊泡(BBV)上，由于高效的ClyA-RBD，因此在囊泡上呈现出spike-like的纳米结构，使RBD-BBV 更接近天然SARS-CoV-2，这种创新是前所未有的；

2、本发明利用高压驱动技术首次实现了在细菌生物膜纳米尺度上的基因修饰，相比OMV的基因修饰技术，本发明的BBV技术提高了107倍基因修饰的囊泡产量；

3、本发明所述的细菌生物膜囊泡(BBV)具有与OMV一样的纳米结构及表面的PAMPs成分，因此有利于促进DC细胞的摄取和成熟；

4、本发明所述的细菌生物膜囊泡(BBV)上展示的全长RBD蛋白量相比 OMV的呈递水平提高了至少28.16倍，针对RBD全蛋白的呈递技术可以提供多重抗体保护，避免了病毒突变带来的问题；

5、通过本发明所述构建方法得到的基因工程修饰的BBV具有诱导中和抗体，细胞免疫，以及免疫记忆的三重功能；

6、本发明所述构建方法得到的基因工程修饰的BBV，借助细菌生物膜的生物相容性特点，帮助RBD实现了溶酶体逃逸，从而提高了细胞免疫应答水平

7、相比OMV，本发明所述的基因工程修饰的BBV释放了胞内的无效蛋白和细菌核酸，提高了安全性；

8、本发明所述的基因工程修饰的BBV的产生是人为可控的过程，提高了囊泡的可质控性，并且其制备工艺可以以“连续流”的方式完成，有利于将来规模化放大制备工艺。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

图1为本发明实施例1所述荷载RBD的细菌突刺样生物膜囊泡(RBD-BBV) 的设计及作用机制图；

图2为SDS-PAGE后银染分析天然的E.coli BL21全细胞菌体(WT-WC)，表达了RBD的全细胞菌体(RBD-WC)，荷载了RBD的BBV(RBD-BBV)，以及荷载了RBD的OMV(RBD-OMV)；

图3为经Image Lab软件图像分析RBD蛋白在总蛋白中的荷载含量结果图；

图4为RBD修饰的OMV和BBV的产量对比图；

图5为SDS-PAGE银染分析未进行基因工程修饰的天然BBV和RBD-BBV 样品，以及全菌体在IPTG诱导前后的蛋白表达水平；

图6为用抗SARS-COV-2的S1抗体以Western blot实验分析RBD蛋白的存在；

图7为ClyA-RBD融合蛋白的生物信息学结构模拟图及其在细菌外膜上组装的示意图；

图8为RBD-BBV的透射电镜图片；

图9为RBD-BBV与ACE2的亲和力分析示意图；

图10为利用共聚焦高内涵分析BMDC细胞的免疫荧光染色，BBV或 RBD-BBV0.05mg/ml加入细胞4h后观察BMDC摄取的效率；

图11为CD11c+CD80+，及CD11c+CD86+的比例的统计结果图；

图12为ELISA分析0.05mg/ml BBV或RBD-BBV刺激BMDC 24h上清中的细胞因子水平；

图13为RBD-BBV的免疫程序及采血时间示意图；

图14为用ELISA分析血清50倍稀释后抗SARS-CoV-2突刺蛋白的IgG含量；

图15为RBD-BBV诱导的抗体阻断S1-Fc蛋白与ACE2结合的实验实验图；

图16为抗血清64倍稀释后阻断SARS-CoV-2活病毒入侵Vero细胞的结果图；

图17为根据抗体的中和实验结果计算的SARS-CoV-2EC50滴度结果图；

图18为0.5μg和5μg剂量RBD-BBV免疫三次后7天主要器官的病理检测结果图。

具体实施方式

实施例1

本实施例以细菌生物膜囊泡(BBV)作为疫苗载体构建新型冠状病疫苗，具体方法为：

编码重组蛋白包含SARS-CoV-2RBD结构域Asn331-Val524 (YP_009724390)和ClyA蛋白(AAL55667)的DNA序列直接合成获得，利用基因工程技术将RBD基因连接到ClyA基因的3’端并克隆进入pThioHisA质粒中，随后通过限制性核酸内切酶分析和测序确认阳性质粒。将重组质粒转化到 E.coli BL21中，并在LB培养基中培养，当菌液OD600达到0.4-0.6，加入1mmol/L 异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，Solarbio)，在30℃条件下过夜诱导重组蛋白ClyA-RBD的表达；次日加入2mM EDTA·2Na，继续培养2h后；以 10000rpm在4℃下将培养液离心30min，收集菌体。将过表达重组蛋白 Clya-RBD的E.coli BL21以及野生型的细胞重悬于HBSS缓冲液(Servicebio) 中，以高压均质机(APV-2000，德国SPX)驱动细菌通过夹缝(条件：1200pa、 3次、4℃)，通过的样品以6000g 4℃离心30min，去除菌体，收集上清；将上清在4℃、100000g条件下超速离心30min；沉淀用HBSS重悬，利用碘克沙醇OptiPrep

如图1所示，所述RBD-BBV的作用机制为：

在大肠杆菌中表达ClyA-RBD融合蛋白单体后借助ClyA的外膜靶向组装特性实现ClyA-RBD在细菌外膜上的高效组装。细菌经超高压强的驱动并通过裂缝后形成了携带ClyA-RBD聚合物的膜成分，这些细菌膜高效自组装形成了荷载 RBD的细菌突刺样生物膜囊泡(RBD-BBV)。RBD-BBV作为疫苗能介导DC细胞的高效摄取并实现溶酶体逃逸，从而诱导机体产生抗SARS-COV-2特异性的中和抗体及T细胞应答。

对比例1

本对比例以外膜囊泡(OMV)作为疫苗载体构建新型冠状病疫苗，具体方法为：

依据实施例1所述的诱导表达方法，将诱导表达后的培养上清通过0.45μm 膜(Millipore)过滤，滤液用500kDa柱(Millipore)超滤浓缩，将浓缩物在200000g、 4℃条件下，超速离心2h，然后将囊泡沉淀物重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中，并用PBS洗涤两次，再次用0.45μm膜过滤，滤液根据实施例1所述的密度梯度离心方法进行纯化，制得纯化后RBD-OMV样品。

实施例2——RBD-BBV的结构及荷载量

本实施例对比了实施例1与对比例1分别基于BBV与OMV的基因修饰技术，样品被以快速银染试剂盒(Beyotime)进行染色，以Image Lab分析RBD-BBV (碘克沙醇密度梯度离心纯化前)、RBD-OMV中的RBD荷载量；使用Bradford 试剂盒(Sangon Biotech)分析BBV产量；如图2所示的结果证明BBV上RBD 的荷载量显著高于OMV，图中箭头标记了RBD蛋白的位置，且RBD的荷载量 BBV比OMV高约28.16倍(图3)，另外，RBD-BBV的产量比RBD-OMV的产量高出约107倍(图4)。更重要的是，RBD-BBV中没有检测到细菌的核酸成分，这大大的提高了疫苗的安全性。

总之，本发明开发的BBV的基因工程修饰技术突破了OMV工程修饰的技术瓶颈，因此在本发明中实现了RBD在BBV上的高效呈现。

实施例1所述RBD-BBV进行碘克沙醇密度梯度离心来分离被组装的 RBD-BBV，由图5所示的SDS-PAGE电泳分析证明RBD被高效的荷载在BBV 上，进一步用特异性识别SARS-COV-2的S1抗体进行western blot分析证明基因工程所呈递在BBV上的蛋白确实是RBD(图6)。本实施例利用生物信息学分析ClyA-RBD融合蛋白的氨基酸结构证明这种设计下的ClyA与RBD之间没有蛋白的相互作用，他们可以分别独立的折叠为正确的蛋白结构，并暴露在细菌外膜(图7)，在透射电镜下我们也观察到了ClyA-RBD在囊泡表面组装成的突刺样结构(图8)。另外，本实施例利用天然RBD与ACE2特异性结合的特点，设计了一种RBD-BBV与ACE2的亲和实验(图9)，我们证明了RBD-BBV与真核细胞表达的S1-Fc蛋白具有几乎相同的ACE2结合能力。由于蛋白酶K(PK) 可以去除囊泡表面的蛋白，将RBD-BBV经PK处理后大部分蛋白消失，证明 RBD-BBV的蛋白组成主要以RBD和膜蛋白为主，并没有多余的胞内蛋白，且 RBD被全部暴露在BBV的表面，用特异性识别SARS-COV-2的S1抗体确认了 RBD完全被暴露在表面。DLS粒径分析证明RBD-BBV与未修饰的BBV一样具有完整的结构，粒径未见显著变化。

综上所述，本发明构建的RBD-BBV高效的暴露了正确折叠的RBD在囊泡表面并展示出突刺样的囊泡结构。

实施例3——RBD-BBV作为疫苗的评价

1、RBD-BBV促进DC细胞摄取及成熟，也介导了RBD的溶酶体逃逸

抗原被DC细胞的高效摄取是疫苗成功的关键，经实验发现RBD-BBV和 BBV都可以被DC细胞高效摄取(图10)，我们也看到RBD-BBV与BBV都能有效的刺激DC细胞成熟，如图11所示，具体表现为DC细胞上CD11c+CD80+ 及CD11c+CD86+的高表达。如图12，RBD-BBV和BBV也都能刺激DC细胞炎症因子IL-6及IL-1β的分泌。总之，我们观察到RBD-BBV与BBV在DC细胞摄取和刺激成熟方面具有相同的特点，说明了这些效应来源于BBV的纳米结构，以及BBV上PAMPs对DC细胞的刺激及靶向性，因此体现出BBV作为RBD的疫苗载体是至关重要的。

另外，我们还观察到RBD-BBV具有高效的溶酶体逃逸现象，这种溶酶体逃逸效应是RBD逃逸与BBV逃逸同步发生的，无论RBD-BBV或BBV空载体都能介导溶酶体逃逸现象，因此RBD-BBV上荷载的RBD也能随BBV一起实现高效的溶酶体逃逸。因此，我们认为RBD-BBV上荷载的RBD蛋白借助BBV本身的特性完成了溶酶体逃逸，溶酶体逃逸特性对于诱导T细胞应答是至关重要的。

2、RBD-BBV能诱导抗SARS-CoV-2特异性的中和抗体

如图13所示，本实施例用RBD-BBV免疫小鼠以评价其激发的B细胞应答， 5μg及0.5μg剂量的RBD-BBV免疫小鼠三次都能诱导SARS-CoV-2突刺蛋白特异性的IgG应答，其中5μg剂量的RBD-BBV能在两次免疫后就产生IgG抗体应答(图14)，IgG亚型IgG1和IgG2a应答都被显著的诱导出现，一致的结果也在IgM的检测中被观察到。倍比稀释抗血清来分析RBD-BBV诱导产生的抗体结合SARS-CoV-2突刺蛋白的抗体滴度，结果显示5μg及0.5μg剂量免疫后诱导的抗体滴度分别为1600和300。如图15所示，本实施例检测了RBD-BBV 诱导的抗体阻断S1与ACE2结合的能力，观察到5μg RBD-BBV诱导的抗体可以阻断S1与ACE2的结合。更重要的是，我们考察了RBD-BBV诱导的抗体阻断活的SARS-CoV-2入侵Vero细胞的能力，如图16所示的结果证明RBD-BBV 诱导的抗血清能够抑制SARS-CoV-2入侵Vero细胞，体现为抗体阻止了Vero细胞的病变。如图17所示，经计算5μg及0.5μg RBD-BBV三次免疫后产生的抗体都能阻断SARS-CoV-2入侵细胞，5μg及0.5μg RBD-BBV的EC50滴度分别是102.4和64。综上所述，RBD-BBV能够诱导潜在的抗SARS-CoV-2特异性的中和抗体。

3、RBD-BBV能诱导SARS-CoV-2特异性的细胞免疫反应

细胞免疫应答在抗击SARS-CoV-2的角色显得越来越重要，因此本实施例评价了在小鼠脾脏和肺部，RBD-BBV诱导SARS-CoV-2特异性细胞免疫的能力。发现RBD-BBV免疫后能在小鼠的脾脏中诱导SARS-CoV-2突刺特异性的CD4+T 及CD8+T的细胞免疫应答。RBD-BBV不仅能诱导系统性的T细胞应答，也能在肺部诱导SARS-CoV-2突刺特异性的CD4+T及CD8+T的细胞免疫应答。另外，我们也评价了RBD-BBV诱导CD4+IFNγ+的Th1细胞及CD8+IFNγ+的CTL细胞的能力，我们看到RBD-BBV能在脾脏及肺部诱导SARS-CoV-2特异性的Th1 应答，同样的，RBD-BBV也能在脾脏及肺部诱导SARS-CoV-2特异性的CTL 应答。我们也检测到了RBD-BBV免疫后的小鼠的脾细胞在受到SARS-CoV-2的 S1-Fc蛋白刺激后显著的分泌功能性分子GzmB及IFN-γ，以及促T细胞增殖的 IL-2。我们用Elispot实验来考察RBD-BBV诱导分泌IFN-γ的功能性细胞的斑点，结果证明RBD-BBV免疫后的小鼠能在系统性(脾脏)和局部(肺部)产生SARS-CoV-2突刺特异性的细胞免疫应答。综上所述，RBD-BBV能够在系统和肺部诱导潜在的SARS-CoV-2特异性的细胞免疫反应来抵抗SARS-CoV-2。

4、RBD-BBV在体内增强了抗原的局部稳定性，并能诱导免疫性T细胞产生

疫苗的体内局部稳定性有利于提高抗原免疫应答的强度及持续时间，我们观察到5ug RBD-BBV和RBD蛋白相比，RBD-BBV在体内的稳定时间比RBD蛋白至少可以提高3倍。

疫苗诱导T细胞免疫记忆的能力反应了其潜在的保护力持续水平，这对于 SARS-CoV-2疫苗可能非常重要。本实施例利用流式细胞术评价了系统性(脾脏) 及局部(肺部)的SARS-CoV-2特异性的记忆性T细胞水平。我们观察到 RBD-BBV免疫后能在脾脏中诱导CD4和CD8的中央型记忆T细胞(T

实施例4——RBD-BBV的生物相容性

本实施例初步评价了RBD-BBV在体内的安全性，在5μg RBD-BBV疫苗的免疫流程中我们没有观察到明显的动物体温波动，也没有发现动物体重显著下降。如图18，0.5μg或5μg剂量的RBD-BBV完成了整个免疫程序后在主要的器官中没有看到明显的组织病变。我们检测了分别以5μg和0.5μg RBD-BBV 免疫小鼠一次后2h及24h后血清中的炎症因子情况，我们没有在血清中观察到 RBD-BBV引起显著的IFN-γ水平升高。血清中IL-6的水平在注射5μg和0.5 μg RBD-BBV的2h都升高，但24h后恢复正常。TNF-α仅在注射5μg RBD-BBV 后的2h升高，但24h后恢复正常，0.5μg剂量下未见显著的TNF-α水平升高。由于RBD-BBV携带的PAMPs成分，不可避免的会引起微弱的炎症应答，但24h 后炎症应答就会消失。

因此，我们认为RBD-BBV具有良好的生物相容性。