2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮的新的应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体而言，涉及2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮的新的应用。

背景技术

肺癌是全世界最为常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均占恶性肿瘤首位。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要类型，占总数的70％-85％。NSCLC中存在多个肿瘤性驱动突变，其中属于受体酪氨酸激酶(Tyrosine kinase,TK)家族的EGFR在高达40％-80％的NSCLC病人中过度表达，且活性突变发生频繁，是最常见的驱动基因，也是目前抗NSCLC的靶向药物研发最为重要的靶点。针对EGFR的抗NSCLC靶向药物EGFR-TKIs(Tyrosine kinaseinhibitors,TKIs)目前已研发至第三代。三代替尼类药物使无数患者受益，日益成为NSCLC临床治疗的主流。然而与其他的化疗药物、靶向药物类似，患者应用后数月内均不可避免地出现耐药。EGFR-TKIs耐药已经成为肺癌治疗的关键瓶颈。

奥希替尼(Osimertinib、AZD9291)是第三代EGFR-TKIs的代表。FDA授予AZD9291“突破性疗法”，其首个适应症为“T790M突变的非小细胞肺癌”。随后又被FDA批准为EGFR突变的转移性NSCLC患者的一线治疗药物。AZD9291对既往接受过一代或二代EGFR-TKIs治疗进展的EGFR T790M突变型的NSCLC患者具有明显的抗肿瘤活性。这给对一代、二代EGFR-TKIs耐药的患者带来了福音。然而令人遗憾的是，患者对AZD9291的耐药很快出现，也愈发常见，而克服其耐药的第四代EGFR-TKIs尚未研制成功。这使得AZD9291耐药患者面临无药可用的窘境，治疗AZD9291耐药NSCLC已成为目前肺癌治疗中亟待解决的关键问题之一。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮(CAS号：85122-21-0)的新的应用。本发明提供天然产物2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮的新的应用，其对耐肿瘤药物的肿瘤细胞具有杀伤作用，能显著抑制耐药肿瘤的生长，继而其可以用于肿瘤治疗，特别是耐药肿瘤的治疗。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮在制备抗耐药肿瘤的药物中的应用。

在可选的实施方式中，所述耐药肿瘤为对抗肿瘤药物产生耐药性的肺癌。

在可选的实施方式中，所述耐药肿瘤为对抗肿瘤药物产生耐药性的非小细胞肺癌。

在可选的实施方式中，使得所述肿瘤形成耐药性的药物为受体酪氨酸激酶抑制剂。

在可选的实施方式中，使得所述肿瘤形成耐药性的药物为选择性EGFR突变体抑制剂。

在可选的实施方式中，使得所述肿瘤形成耐药性的药物为奥希替尼、其同分异构体或者其药学上可接受的盐中的任意一种。

在可选的实施方式中，抗耐药肿瘤的所述药物为具有至少一种以下功能的药物：(1)降低细胞活力；(2)降低细胞内ATP含量；(3)提升LDH的释放；(4)抑制耐药肿瘤细胞增殖和生长；(5)诱导耐药肿瘤细胞死亡。

在可选的实施方式中，在细胞实验中，2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮的用量为1.25μM以上，优选为2.5μM-5μM。

本发明具有以下有益效果：本发明提供2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮的新的应用，其对耐药肿瘤细胞有良好的杀伤作用，能够抑制耐药肿瘤的生长，降低耐药肿瘤的体积，可以用于治疗耐药肿瘤，继而可以作为治疗耐药肿瘤的药物应用，进一步扩大了2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮的应用范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例2提供的检测结果图；

图2为本发明实验例3提供的检测结果图；

图3为本发明实验例4提供的检测结果图；

图4为本发明实验例5提供的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

奥希替尼(Osimertinib、AZD9291)是第三代EGFR-TKIs的代表，其对耐一代或二代EGFR-TKIs的耐药肿瘤有良好的治疗效果，但是随着其使用时间的增加，人体也逐渐对奥希替尼产生耐药性，继而降低其治疗效果，但是现有技术中并没有记载能够克服其耐药性的物质。而发明人研究发现，天然产物2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮(简称MAM)对于耐药肿瘤，例如耐药的非小细胞肺癌有良好的治疗效果，特别是对奥希替尼等选择性EGFR突变体抑制剂导致的耐药肿瘤有良好的治疗效果。因此，本发明实施例将其用于制备抗耐药肿瘤的药物。

需要说明的是，虽然本发明实施例或实验例仅列举了2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮对奥希替尼导致的耐药肿瘤有良好的治疗效果，但是其他的例如吉非替尼、盐酸厄洛替尼等受体酪氨酸激酶抑制剂导致的耐药肿瘤也在本发明实施例的保护范围内。

进一步地，抗耐药肿瘤的所述药物具有至少一种以下功能：(1)降低细胞活力；(2)降低细胞内ATP含量；(3)提升LDH的释放；(4)抑制耐药肿瘤细胞增殖和生长；(5)诱导耐药肿瘤细胞死亡。继而可以有效杀灭耐药肿瘤细胞，治疗耐药肿瘤。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实验例1

构建耐药细胞(H1975AR细胞)

采用剂量梯度递增的方法诱导NCI-H1975对AZD92921产生耐药性。将细胞密度调整至60％，用0.03μMAZD9291处理，72h后换液去除药物，待细胞重新生长至对数期后再次加入药物处理，再依次增加至1.5μM的AZD9291，连续培养6个月，MTT检测细胞活性，与亲本细胞相比，IC

实验例2

AZD9291对AZD9291耐药细胞的毒性

分别利用MTT与ATP检测方法检测AZD9291对于上述建立的AZD9291耐药NSCLC(H1975AR细胞)的细胞活力的影响。

(1)MTT法测试步骤：取对数生长期细胞按密度8×10

(2)ATP法测试步骤：取对数生长期细胞按密度8×10

检测结果参见图1，其中，图1中A为MTT法的检测结果图，图1中B为ATP检测结果图。

根据图1可知，AZD9291对已耐AZD9291的细胞的细胞活力没有显著降低效果，且对细胞内ATP的含量影响微弱，说明AZD9291对耐药非小细胞肺癌细胞没有抑制效果，不能进一步杀灭非小细胞肺癌细胞，说明上述耐药细胞成功制备，也说明AZD9291对于耐药非小细胞肺癌没有治疗效果。

实验例3

2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮杀伤AZD9291耐药肿瘤细胞

分别用MTT、ATP和LDH释放检测方法检测2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮对H1975AR细胞活力的影响。

其中，MTT检测法和ATP检测法的操作与实验例2提供的MTT检测法和ATP检测法的操作一致，区别在于：MTT与ATP检测时，采用的2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮的浓度为(0μM，1.25μM，2.5μM，5μM)，处理时间分别为12h和6h。

LDH释放检测方法的步骤为：取对数生长期细胞按密度8×10

检测结果参见图2，其中，图2中A为MTT法的检测结果图，图2中B为ATP检测结果图，图2中C为LDH释放检测结果图。

根据图2可知，2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮在耐药细胞中能显著降低细胞活力(图2中A)，降低细胞内ATP含量(图2中B)，增加LDH的释放(图2中C)，

实验例4

采用PI染色检测细胞死亡

步骤：取对数生长期细胞按密度8×10

采用平板克隆形成实验检测增殖抑制作用

步骤：将细胞种于6孔板(500个/孔)，使细胞在孔中均匀单个分布；贴壁后分别用DMSO(Ctrl组)与5μM 2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮(MAM组)处理8h；8h后更换1％血清培养基，继续培养7days进行单细胞克隆；7days后，吸弃培养基，PBS洗2-3次，加入1％多聚甲醛固定30min；吸弃多聚甲醛，加入结晶紫染色10min；吸弃结晶紫，PBS洗2-3次；拍照。

检测结果参见图3，其中，图3中A为PI染色检测结果图，图3中B为平板克隆形成实验结果图。

根据图3可知，MAM处理组能够显著增加PI染色阳性细胞，(图3中A)。参见图3中B，相比对照组，MAM处理组能够显著减少克隆形成。这些结果显示，2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮可有效地杀伤AZD9291耐药肿瘤细胞，抑制耐药肿瘤细胞的增殖和生长。

实验例5

动物实验

步骤：将荧光标记的H1975AR细胞接种到斑马鱼幼鱼的卵黄囊中(100个/只)，1天后开始分别使用2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮(0，50，200nM)或AZD9291(500nM)处理，定期观察肿瘤面积，用药2天后拍照，统计计算。

检测结果参见图4，根据图4可知，50nM与200nM的2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮均可显著地抑制肿瘤生长，而AZD9291处理组没有抑制肿瘤生长的作用，***p<0.001vs.Con group(MAM 0nM group)。

综上可知，2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮可以降低耐药肿瘤细胞的活力和ATP含量、提升耐药肿瘤细胞的LDH的释放、抑制耐药肿瘤细胞的增殖和生长，继而诱导耐药肿瘤细胞死亡，继而对耐药肿瘤细胞有良好的杀伤作用，能够抑制耐药肿瘤的生长，降低耐药肿瘤的体积，可以用于治疗耐药肿瘤，继而可以作为治疗耐药肿瘤的药物应用，进一步扩大了2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮的应用范围。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。