一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，具体是涉及一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用。

背景技术

表皮是人体最为活跃的部分，在健康的皮肤内，随时都有大约14％的基底层角质形成细胞处于细胞分裂中，它们会经历细胞分裂、分化，并向上移动，在这个的过程中，细胞成为角质层的一部分。尽管角质层是强大有效的物理屏障，但它不断受到波动的环境温度和湿度、紫外线、微生物、日常卫生(水、表面活性剂)、异物分子等因素的挑战。为了维持物理屏障这个至关重要的功能，表皮必须不断自我更新，这使它成为了人体中最活跃的部分。如果表皮更新过程能够成功进行，皮肤就会获得最佳的屏障功能、水合程度与美感。

皮肤上生活着多种微生物，许多皮肤常驻微生物会与皮肤相互作用。微生物产生的各种分子与皮肤细胞(例如分化中的角质形成细胞)相互作用，这些细胞做出反应，使皮肤受益，同时角质形成细胞产生对“健康”微生物有益的分子。例如，产生调节皮肤pH值的分子，以及能够杀死互利微生物竞争物种的抗微生物肽等。皮肤与有益互利微生物之间的作用是双向的，两方处于动态平衡的共生关系中。

每天都有数十亿个皮肤微生物被杀死、洗掉、擦掉或与死亡的皮肤细胞一起脱落。尽管如此，皮肤上仍然还有大量微生物，而且其组成惊人地稳定，原因是皮肤微生物群也会像表皮那样自我更新。在皮肤表面发生的任何损失均由微生物更新过程来弥补，表皮的状态与皮肤表面微生态环境息息相关，干燥的皮肤角质层较厚，不易脱落，因此不利于新陈代谢的进行，而湿润的皮肤环境有利于表皮正常新陈代谢的进行。因此，湿润的环境能够维持皮肤正常的新陈代谢，进而促进“新微生物组”相对快速到达皮肤表面。皮肤的pH值、湿度、温度、所需食物的供应情况等也能让环境变的对这些微生物更有利，健康平衡的皮肤微生物群能够与皮肤细胞(例如分化中的角质形成细胞)相互作用，最终使皮肤受益。然而，现有微生态友好护肤产品中，只针对某一种或某一类菌的提升或抑制，来达到微生态环境的平衡。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用。本发明的组合物更多关注到皮肤本身的新陈代谢过程，以及在这个过程中“新微生物组”的快速建立。并且通过改善微生物组生存的pH值、湿度等外部环境，帮助皮肤恢复稳态。

为达到本发明的目的，本发明具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物包含红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1-15：1-10。

优选地，在本发明的一些实施例中，所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1-10：1-3。

更优选地，在本发明的一些实施例中，所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为3-4：1。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述红曲发酵液的制备方法为：红曲霉菌株在斜面培养基上培养后用无菌水洗下孢子，过滤后振荡制成均一孢子悬液，将孢子悬液接种到液体培养基中，摇床培养得到液体种子液；将大米洗净，沥干并粉碎后，加水搅拌，糊化处理并冷却至室温后接种红曲霉菌液体种子液，在25～45℃温度下搅拌发酵，完成后进行喷雾干燥，得红曲霉发酵产物；所得红曲霉发酵产物加入去离子水，接种乳酸杆菌，搅拌发酵；发酵完成后，灭菌，离心，得上清液，即为红曲发酵液。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法为：取乳酸菌菌种在斜面培养基中划线恒温培养后，洗涤菌种，进行离心，得乳酸菌悬液；将乳酸菌悬液接种于液体培养基中，进行活化种子培养，得乳酸菌种子液，接种于发酵罐中，搅拌，通气，培养至发酵结束；过滤得到菌体后，进行破壁，即得乳酸菌发酵溶胞产物。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述组合物中还包含稳定剂。

优选地，在本发明的一些实施例中，所述稳定剂为甘油、乙基己基甘油、1,2-己二醇、己二醇、戊二醇中的一种或多种。

更优选地，在本发明的一些实施例中，所述红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物的质量与稳定剂的比为0.3-5：1。

另一方面，本发明还提供了一种前述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法，所述方法包含以下步骤：

1)种子液制备：红曲霉菌株在斜面培养基上培养后用无菌水洗下孢子，过滤后振荡制成均一孢子悬液，将孢子悬液以1-10％的接种量接种到液体培养基中，摇床培养1-3d，得到液体种子液；

2)将大米洗净，沥干并粉碎后，加水搅拌，控制水料比为8-12：1，糊化处理并冷却至室温后，以接种量4-10％接种红曲霉菌液体种子液；

3)在25-45℃温度下发酵2.5-3.5d，搅拌发酵，完成后进行喷雾干燥，得红曲霉发酵产物；

4)在所得红曲霉发酵产物中加入25-35倍的去离子水，接种8-12％的乳酸杆菌，搅拌发酵；

5)发酵完成后，灭菌，离心，得上清液，即为红曲发酵液；

6)取乳酸菌菌种在斜面培养基中划线培养，恒温培养后洗涤菌种，进行离心，得乳酸菌悬液；

7)将乳酸菌悬液接种于液体培养基中，进行活化种子培养；

8)将乳酸菌种子液接种于发酵罐中，搅拌，通气，培养至发酵结束；

9)过滤得到菌体后，进行破壁，即得乳酸菌发酵溶胞产物；

10)将所得乳酸菌发酵溶胞产物混入所得红曲发酵液中，搅拌混匀后，加入稳定剂及添加剂，混合后，过滤，即得。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤1)中孢子悬液浓度为1×10

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述步骤8)中搅拌速率为100-300r/min，通气量为0.3-0.6L/min。

优选地，在本发明的一些实施例中，所述稳定剂为甘油、乙基己基甘油、1,2-己二醇、己二醇、戊二醇中的一种或多种。

更优选地，在本发明的一些实施例中，所述红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物的质量与稳定剂的比为0.3-5：1。

再一方面，本发明还提供了一种前述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的应用，所述应用为将所述组合物添加到化妆品中。

进一步地，在本发明的一些实施例中，所述化妆品为水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜、粉底液，但本领域技术人员理应知晓这些仅为例举，本发明所述化妆品包括但不限于水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜、粉底液。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

(1)相对于传统提取方式，本发明双发酵的方法能够减弱红曲的颜色，提高红曲的稳定性，同时又能避免传统提取工艺对红曲中活性物质的损失，并且乳酸杆菌体超声裂解后释放出有利于有益菌生长的营养物质，超声及高压均质的破壁方式能够减少引入对皮肤有刺激的成分。

(2)本发明组合物中红曲霉菌联合乳酸杆菌的方式可以更多地释放小分子活性物质，便于皮肤吸收利用，提升保湿效果，更快的恢复皮肤稳态环境。

(3)本发明中乳酸菌与红曲发酵物组合可以协同增效，不仅能够平衡皮肤微生态，另外还营造了皮肤微生物组适宜的生存环境。

(4)本发明中乳酸菌与红曲发酵物组合物相较于一般微生态调节组合物，更多的促进皮肤新陈代谢，提升表皮分化、再生的功效，通过表皮的分化再生，促进皮肤本身“新微生物组”的快速建立，在保湿、恢复皮肤屏障功能、提亮方面表现优异。

附图说明

图1是使用本发明实施例6、9中组合物后微生物丰富度恢复情况(％)；

图2是使用本发明实施例6、9中组合物后微生物多样性恢复情况(％)；

图3是使用本发明实施例6、9中组合物后经表皮水分流失Tewl值减少率(％)图；

图4是使用本发明实施例6、9中组合物前后皮肤纹理图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。

此外，下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。而且，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

一种前述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法，所述方法包含以下步骤：

(1)将红曲霉菌株在斜面培养基上培养后，用无菌水洗下孢子，过滤后转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡制成均一孢子悬液，浓度为1×10

(2)将大米洗净，沥干并粉碎后加水搅拌，控制水料比为10：1，以10％接种量接种步骤(1)所得种子液；

(3)在步骤(2)完成后，30℃温度下搅拌发酵3d，完成后进行喷雾干燥，得红曲霉发酵产物；

(4)取步骤(3)所得红曲霉发酵产物加入30倍的去离子水，接种10％乳酸杆菌，搅拌发酵；

(5)发酵完成后，灭菌，离心，得上清液；

(6)取菌种在斜面培养基中划线恒温培养后，洗涤菌种，进行离心，得乳酸菌悬液，菌悬液浓度1×10

(7)将菌悬液接种于液体培养基中，进行活化种子培养24h；

(8)将乳酸菌种子液以10％接种量接种于发酵罐中，以100-300r/min的速率进行搅拌，通气0.5L/min，培养至发酵结束；

(9)过滤得到菌体后，进行破壁，即得乳酸菌发酵溶胞产物；

(10)将步骤(9)所得乳酸菌发酵溶胞产物按照比例混入步骤(5)所得上清液中，搅拌混匀后，加入稳定剂及添加剂，混合后，过滤，即得；

(11)其中步骤(4)中接种10％乳酸杆菌为对比例1-1，不接种10％乳酸杆菌为对比例1-2，其余制备方法如上步骤。

表1实施例1-10及对比例1-2中各组合物的组成比例(以质量计)

根据表1并采用上述方法制备各实施例及对比例的组合物，并对所得组合物进行功效测试。

细胞毒性测评试验：

MTT assay是通过对活细胞数进行测定，在检测细胞毒性或细胞增殖时广泛使用的实验方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使水溶性的黄色盐MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)还原为水不溶性的蓝色的甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。生成的结晶甲臜一般加入DMSO(二甲亚砜)，溶解后测定吸光度。具体的实验方法是在96多孔板中按照1X10

空白组不加入组合物进行试验。

表2实施例1-10和对比例1-1、1-2、2所得的组合物的细胞毒性结果

角质细胞基因表达试验：

丝聚蛋白Filaggrin(FLG)是角质细胞终末分化的重要条件，对表皮的分化形成有重要作用，可作为评价皮肤屏障功能以及表皮分化状态的指标。

采用实时荧光定量PCR法检测组合物对靶标基因表达量的调节，待测样品为：实施例1-10、对比例1-1、1-2、对比例2，浓度：1％。HaCaT细胞以3*10

计算公式：Fold change＝2

-ΔΔCT＝[(CT靶标基因–CT内参基因)treated sample-(CT靶标基因–CT内参基因)untreated sample]。此试验中，靶标基因1个，为FLG，内参基因1个，为GAPDH。

表3组合物对靶标基因表达量的调节检测结果

由上表可知：

1)实施例1-10所得组合物的FLG基因表达量均高于对比例，说明本发明所得红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物通过组合方式可获得更好的FLG基因表达效果，另外对比例1-1相对于对比例1-2，促进FLG基因表达有明显提升，说明红曲霉菌联合乳酸杆菌的发酵方式更具优势；

2)FLG基因的表达和本发明所得红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物均具有一定量效关系，质量份数增加到一定范围后，上升趋势减缓。经过对比实施例1、2、3、6、8、9发现，红曲发酵液质量份数为1、8、15的FLG基因表达差别不大，而在红曲发酵液质量份数为2、3、4时，FLG基因表达出现较大提升；由实施例6、7以及实施例9、10对比发现乳酸菌发酵溶胞产物质量份数为1、5的FLG基因表达差别不大；实施例6、9的FLG基因表达量最高。因此，优选实施例6(4:1)和实施例9(3:1).

综上所述，红曲发酵液质量份数为不同比例组合对应的促进FLG基因表达的能力不同，本发明所得红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1-10：1-3，更优选地，本发明所得红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为4：1和3：1。

安全性斑贴测试：

滴加20μl的待测液于斑试器中，对照孔为空白对照(纯水)；将加有受试物的斑试器贴到受试人员前臂屈侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24小时；分别于去除受试物斑试器后30min、24小时、48小时后按表4观察皮肤刺激性和致敏性，并记录观察结果。

表4皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准

实验结果：对实施例6、9进行人体皮肤斑贴测试。

表5实施例6、9人体皮肤斑贴

试验结果显示，30人中无皮肤不良反应。

微生物丰富度及多样性恢复情况试验：

占据人体的细菌保留了16S核醣体RNA(rRNA)基因，其特殊的基因区域可以用于系统分类。这使得16S rRNA基因成为一种分子标签，可以用来识别细菌群落的各个成员。采用无创拭子收集皮肤微生物。将微生物细胞溶解后，分离出微生物DNA。然后使用以16S rRNA基因为靶标的引物对DNA进行选择性PCR(聚合酶链式反应)扩增，对PCR产物进行测序，获得DNA序列后，使用生物信息工具进行基本序列处理、物种分类、多样性分析和群落比较。

选取志愿者15名，在第0天，对四个部位(A、B、C、D)进行胶带剥离，第五个部位(E)不进行剥离。然后用试验产品处理A、B、C部位，在随后的七天中让志愿者继续在选定部位使用试验产品两次(早上和晚上)。在胶带剥离操作之前、以及胶带剥离后第2天和第7天对微生物群落进行分析。其中A为安慰剂组、B为实施例6、C为实施例9、D为阴性对照组(未处理，受损)、E为阳性对照组(未处理，未受损)。将E部位的丰富度及多样性设为100％，观察微生物组的丰富度及多样性的恢复情况。

如图1-2，实施例6、9在微生物丰富度方面，在第二天即有较大程度的恢复，在第七天时恢复至几乎接近阳性对照组，而安慰剂恢复较慢，且恢复程度较差；在微生物多样性方面，实施例6、9相对于安慰剂组在第七天时有更高的恢复程度，更加接近阳性对照组。上述结果证明组合物在恢复皮肤微生物群的丰富度及多样性方面有积极作用，能够恢复皮肤微生物群的稳态。

皮肤屏障修复测试和纹理测试：

1)皮肤屏障修复测试：

选取25至45岁之间的女性志愿者30名，使用含1％(质量计)实施例6、实施例9和对比例1-2所得组合物的乳液和空白乳液，每天2次，连续使用28天，使用仪器测试各项指标，结果如图3所示。

2)皮肤纹理测试：

图4为使用不同组合物前后的皮肤纹理图。由图4可知，实施例6和实施例9所得组合物对皮肤纹理有明显的改善作用。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。