具有控释靶向性纳豆激酶-葛根素凝胶微球的制备方法

技术领域

本发明涉及食品加工领域，具体为一种具有控释靶向性纳豆激酶-葛根素凝胶微球的制备方法。

背景技术

纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，其主要由枯草纳豆芽胞杆菌在发酵纳豆过程中所产生。纳豆激酶的主要功能是治疗和预防血栓病。然而，纳豆激酶在胃酸环境下容易失活，直接口服纳豆激酶会大大降低其溶栓能力。因此，需要寻找合适的方法提高纳豆激酶在人体中的生物利用率。

黄酮类物质是日常饮食中摄入最为丰富的抗氧化剂，具有广泛的生理活性，但在加工、储藏过程及胃环境中的不稳定性、低溶解度，被动扩散和主动外排等因素都会降低黄酮的生物利用度，此外黄酮类化合物在胃肠道(酸碱度、酶的作用)中稳定性差，也是日常饮食中黄酮类化合物生物利用度不高的原因。

因此，制备可靠的运载体系，对纳豆激酶和黄酮等营养物质进行保护，降低其在口腔、胃液内引起的破坏，从而提高活性物质的生物利用度，具有很高的应用价值。

发明内容

本发明的目的是为了提升纳豆激酶、黄酮等营养物质在人体内的生物利用度，提供一种具有控释靶向性纳豆激酶-葛根素凝胶微球的生产方法，本发明所用的技术方案为：

一种具有控释靶向性纳豆激酶-葛根素凝胶微球的生产方法，生产方法具体如下：

S1.称取60-80g纳豆激酶，溶解于2-3L饮用水中后，一起置于直径45-50cm的平底容器内，采用低温-pH诱导法，迫使纳豆激酶的结构发生定向异化，得到料液A；

S2.保持步骤S1低温-pH诱导后的低温环境，将溶解好的葛根素均匀喷洒于料液A中，静置3-4分钟后，采用6-7Gy/min的X-射线进行处理，得到物料B；

S3.将质量浓度为10-12％的海藻酸钠溶液均匀喷洒于物料B中，得到料液C，然后采用孔径800-820纳米的微细管道，将料液C匀速滴入氯化钙溶液中，制得凝胶微球。

步骤S1所述的低温-pH诱导法，具体处理过程为：

采用逐步降温的方法，以2℃/min的速度将纳豆激酶溶液的温度逐步降至2-4℃，保持3-4min，然后采用酸碱缓冲液，以0.2/min的速度调节溶液pH值，迫使纳豆激酶的α-螺旋含量变为42.5-42.8％。

步骤S2所述的X-射线进行处理具体为：

采用X-射线处理20秒、停止15秒，继续使用X-射线处理16秒、停止20秒，接着使用X-射线处理12秒、停止25秒，然后使用X-射线处理8秒、停止30秒。

本发明的有益效果在于：

1、纳豆激酶经过低温-pH诱导后发生结构异化，置于低温环境下，采用X-射线处理(低强度、间歇性逐步减弱)可以在保持纳豆激酶活性位点结构基本不变的情况下，促进葛根素与纳豆激酶在特定肽段的氢键和共轭结合，从而强化纳豆激酶的刚性结构，形成纳豆激酶-葛根素共聚体；采用海藻酸钠和氯化钙进行二次包埋后，可制得结构稳定、功能特性好的凝胶微球。

2、本发明制备的凝胶微球产品控释性能好，可较好地抵御胃液酶的消化，而将纳豆激酶和葛根素运载至小肠释放；在小肠环境内，肠道中pH变化可触发纳豆激酶-葛根素共聚体的解聚，纳豆激酶释放出来后，结构基本复原为天然构象，活性可保留85％以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

一种具有控释靶向性纳豆激酶-葛根素凝胶微球的制备方法，生产方法具体如下：

S1.称取60-80g纳豆激酶，溶解于2-3L饮用水中后，一起置于直径45-50cm的平底容器内，采用低温-pH诱导法，迫使纳豆激酶的结构发生定向异化，得到料液A；

S2.在2-4℃环境下，将溶解好的葛根素均匀喷洒于料液A中，静置3-4分钟后，采用6-7Gy/min的X-射线进行处理，得到物料B；

S3.将质量浓度为10-12％的海藻酸钠溶液均匀喷洒于物料B中，得到料液C，然后采用孔径800-820纳米的微细管道，将料液C匀速滴入氯化钙溶液中，制得凝胶微球。

步骤S1所述的低温-pH诱导法，具体处理过程为：

采用逐步降温的方法，以2℃/min的速度将纳豆激酶溶液的温度逐步降至2-4℃，保持3-4min，然后采用酸碱缓冲液，以0.2/min的速度调节溶液pH值，迫使纳豆激酶的α-螺旋含量变为42.5-42.8％。

步骤S2所述的X-射线进行处理具体为：

采用X-射线处理20秒、停止15秒，继续使用X-射线处理16秒、停止20秒，接着使用X-射线处理12秒、停止25秒，然后使用X-射线处理8秒、停止30秒。

对比例1：

S1.称取70g纳豆激酶，溶解于3L饮用水中后，一起置于直径45cm的平底容器内，得到料液A；

S2.在3℃环境下，将溶解好的葛根素均匀喷洒于料液A中，静置4分钟后，得到物料B；

S3.将质量浓度为11％的海藻酸钠溶液均匀喷洒于物料B中，得到料液C，然后采用孔径800纳米的微细管道，将料液C匀速滴入氯化钙溶液中，制得凝胶微球。

对比例2：

S1.称取70g纳豆激酶，溶解于3L饮用水中后，一起置于直径45cm的平底容器内，得到料液A；

S2.在3℃环境下，将溶解好的葛根素均匀喷洒于料液A中，静置4分钟后，采用7Gy/min的X-射线处理20秒、停止15秒，继续使用X-射线处理16秒、停止20秒，接着使用X-射线处理12秒、停止25秒，然后使用X-射线处理8秒、停止30秒，得到物料B；

S3.将质量浓度为11％的海藻酸钠溶液均匀喷洒于物料B中，得到料液C，然后采用孔径800纳米的微细管道，将料液C匀速滴入氯化钙溶液中，制得凝胶微球。

对比例3：

S1.称取70g纳豆激酶，溶解于3L饮用水中后，一起置于直径45cm的平底容器内，采用逐步降温的方法，以2℃/min的速度将纳豆激酶溶液的温度逐步降至3℃，保持4min，然后采用酸碱缓冲液，以0.2/min的速度调节溶液pH值，迫使纳豆激酶的a-螺旋含量变为42.5％，得到料液A；

S2.在3℃环境下，将溶解好的葛根素均匀喷洒于料液A中，静置4分钟后，得到物料B；

S3.将质量浓度为11％的海藻酸钠溶液均匀喷洒于物料B中，得到料液C，然后采用孔径800纳米的微细管道，将料液C匀速滴入氯化钙溶液中，制得凝胶微球。

实施例1：

S1.称取60g纳豆激酶，溶解于2L饮用水中后，一起置于直径45cm的平底容器内，采用逐步降温的方法，以2℃/min的速度将纳豆激酶溶液的温度逐步降至2℃，保持3min，然后采用酸碱缓冲液，以0.2/min的速度调节溶液pH值，迫使纳豆激酶的α-螺旋含量变为42.5％，得到料液A；

S2.在2℃环境下，将溶解好的葛根素均匀喷洒于料液A中，静置3分钟后，采用6Gy/min的X-射线处理20秒、停止15秒，继续使用X-射线处理16秒、停止20秒，接着使用X-射线处理12秒、停止25秒，然后使用X-射线处理8秒、停止30秒，得到物料B；

S3.将质量浓度为10％的海藻酸钠溶液均匀喷洒于物料B中，得到料液C，然后采用孔径800纳米的微细管道，将料液C匀速滴入氯化钙溶液中，制得凝胶微球。

实施例2：

S1.称取70g纳豆激酶，溶解于2.5L饮用水中后，一起置于直径48cm的平底容器内，采用逐步降温的方法，以2℃/min的速度将纳豆激酶溶液的温度逐步降至3℃，保持3.5min，然后采用酸碱缓冲液，以0.2/min的速度调节溶液pH值，迫使纳豆激酶的α-螺旋含量变为42.6％，得到料液A；

S2.在3℃环境下，将溶解好的葛根素均匀喷洒于料液A中，静置3.5分钟后，采用6.5Gy/min的X-射线处理20秒、停止15秒，继续使用X-射线处理16秒、停止20秒，接着使用X-射线处理12秒、停止25秒，然后使用X-射线处理8秒、停止30秒，得到物料B；

S3.将质量浓度为11％的海藻酸钠溶液均匀喷洒于物料B中，得到料液C，然后采用孔径810纳米的微细管道，将料液C匀速滴入氯化钙溶液中，制得凝胶微球。

实施例3：

S1.称取80g纳豆激酶，溶解于3L饮用水中后，一起置于直径50cm的平底容器内，采用逐步降温的方法，以2℃/min的速度将纳豆激酶溶液的温度逐步降至4℃，保持4min，然后采用酸碱缓冲液，以0.2/min的速度调节溶液pH值，迫使纳豆激酶的α-螺旋含量变为42.8％，得到料液A；

S2.在4℃环境下，将溶解好的葛根素均匀喷洒于料液A中，静置4分钟后，采用7Gy/min的X-射线处理20秒、停止15秒，继续使用X-射线处理16秒、停止20秒，接着使用X-射线处理12秒、停止25秒，然后使用X-射线处理8秒、停止30秒，得到物料B；

S3.将质量浓度为12％的海藻酸钠溶液均匀喷洒于物料B中，得到料液C，然后采用孔径820纳米的微细管道，将料液C匀速滴入氯化钙溶液中，制得凝胶微球。

对比例1、2、3和实施例1、2、3的产品的体外消化和性质分析方法：

(1)体外消化：配制模拟唾液(SSF)、模拟胃液(SGF)和模拟肠道液(SIF)，在使用之前，将所有溶液提前预热至37℃，并在整个模拟胃肠道消化过程中将其保持在该温度下。口腔阶段：将5mLSSF和5g纳豆激酶/卵清蛋白-黄酮水凝胶样品预热至37℃，然后混合在一起，调pH至6.8，于水浴振荡器中100rpm孵育5min。胃阶段：在口腔混合液中加入10mL模拟胃液，它由SGF电解质溶液和胃蛋白酶溶液(最终混合物中达到2000U/mL)组成，然后使用5mol/LHCl调节pH至1.2，于水浴振荡器中100rpm，2h孵育。小肠阶段：向经胃消化阶段后的混合液中加入20mL模拟肠液(SIF)，它由SIF电解质溶液、胆汁提取液(最终混合物中有10mmol/L的胆盐)、添加胰蛋白酶(最终混合物中胰蛋白酶活性为100U/mL)组成，然后使用5mol/LNaOH调节pH至6.8，于水浴振荡器中100rpm，4h孵育。

(2)纳豆激酶的溶栓能力：将收集的新鲜的鸡血于37℃放置6h，待其形成稳定的血栓，4℃保存。将血栓切成约1cm×1cm×1cm的小块，称重，然后再将血栓浸泡在收集到的等量的体外消化液中，在一定的时间间隔内，对血块称重，观察并计算纳豆激酶的溶栓率(％)：

式中：W

(3)葛根素生物可吸收率：完成模拟体外消化后，将消化液离心(40000g，30min，4℃)。取上清液，用液相色谱分析葛根素含量。在消化液中可溶解的部分被认为是在胶束中能被吸收的部分。流动相由PH7.0、0.1％乙酸水溶液和0.1％乙酸乙腈溶液(90∶10，v/v)组成，流动相在运行柱之前脱气，保持温度为25℃。运行时间设置为20分钟，样品测试量为20μL，流速为1mL/min，葛根素峰值水平通过254nm紫外线检测进行检测，通过葛根素的标准曲线测算葛根素含量，进而与消化前葛根素原值对比，计算葛根素生物可吸收率。

结果分析：将对比例1、2、3和实施例1、2、3的产品进行模拟体外消化后分析，结果表明，与原始纳豆激酶的活性(定为100％)和葛根素全部到达肠道释放(生物可接受率定为100％)相比，对比例1产品在小肠的纳豆激酶活性保留率为72.6％、葛根素生物可吸收率为47.9％，对比例2品在小肠的纳豆激酶活性保留率为86.2％、葛根素生物可吸收率为83.3％，对比例3产品在小肠的纳豆激酶活性保留率为79.7％、葛根素生物可吸收率为56.3％，实施例1、2、3产品在小肠的纳豆激酶活性保留率分别为94.8％、95.3％和95.4％，葛根素生物可吸收率为88.3％、88.8％和88.4％。可见，与对比例1、2、3相比，实施例1、2、3产品中纳豆激酶和葛根素在小肠的释放率均更高。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。