一种细胞保存液及液态细胞质控品的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术与医学领域，具体涉及一种细胞保存液及液态细胞质控品的制备方法和应用。

背景技术

免疫组化、原位杂交等原位切片染色技术应用十分广泛，但在实际工作中必须设置阴性对照片与阳性对照片，其中阳性对照片一般为人体病变组织所制成的切片，在实验过程中使用和待测切片完全一致的操作流程与试剂，用以监控实验本身的可靠性。

目前，使用人体病变组织制成的切片作为阳性对照有三大缺陷：第一，这种人体病变组织个体存在差异性，且来源不稳定；第二，由于组织蜡块是来源于患者人体组织，其归属权归于患者，严格来说病理科使用患者的蜡块用于制作阳性对照片存在伦理以及法律归属权上的风险，更不可能将患者的蜡块用于商业化开发；第三，由于每片待测切片都需要一张阳性对照进行监控，大大增加了病理科的实验工作量和阅片工作量。

目前在免疫组化质控品的制作上普遍使用细胞蜡块的方法，常用的有细胞沉淀法和琼脂糖凝块石蜡包埋法。但是此两种方法首先对细胞的要求量比较大，其次是在样本切片前，需经过一系类长时间繁琐的样本预前处理过程，如乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡等，并且后续包埋和切片过程对设备和操作人员的技术要求都相对较高，且包埋时细胞的浓度很难控制，容易导致图片观察效果不理想。

CN112611614A提供了一种细胞半固态悬液的制备方法及其应用，能够在减少一半实验量的情况下，保证是实验的完全对照。但是该方法仍然过于复杂，依旧需要将细胞先进行石蜡包埋处理。

因此，本发明提供了一种细胞保存液及液态细胞质控品的制备方法和应用，在保证效果的情况下，简化了操作流程。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种细胞保存液及液态细胞质控品的制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种细胞保存液，所述细胞保存液包括氯化盐、磷酸盐、抗坏血酸钠、醇、乙二胺四乙酸和水。

本发明的细胞保存液，可以较好的固定细胞，保护细胞抗原，延长细胞用于制片的保存期。其中醇可以固定细胞、保持细胞形态；抗坏血酸钠作为抗氧化剂，可以提高染色的准确性和稳定性；乙二胺四乙酸可以降低金属离子对细胞核酸的影响。使用本发明的细胞保存液制成的液态细胞质控品，可以直接滴片制片，方法简单、高效，且制片时不会迅速风干，可以方便的储存和运输，具有良好的染色效果。

优选地，所述氯化盐包括氯化钠和氯化钾。

优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述醇包括丙三醇、乙醇、1,3-丙二醇和聚乙二醇。

本发明创造性地发现，丙三醇、乙醇和1,3-丙二醇在固定细胞、保持细胞形态上具有一定的协同作用。

优选地，所述聚乙二醇的分子量为2000-6000；例如2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述细胞保存液以质量百分含量计包括氯化钠0.1％-1％、氯化钾0.01％-0.1％、磷酸盐0.05％-0.5％、抗坏血酸钠0.01％-0.1％、丙三醇3％-10％、1,3-丙二醇3％-10％、乙醇10％-20％、乙二胺四乙酸0.01％-0.1％、聚乙二醇0.05％-0.5％和水；

所述氯化钠的质量百分含量可以选择0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等；所述氯化钾的质量百分含量可以选择0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等；所述磷酸盐的质量百分含量可以选择0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％等；所述抗坏血酸钠的质量百分含量可以选择0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％等；所述丙三醇的质量百分含量可以选择3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等；所述1,3-丙二醇的质量百分含量可以选择3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等；所述乙醇的质量百分含量可以选择11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％；所述乙二胺四乙酸的质量百分含量可以选择0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％等；所述聚乙二醇的质量百分含量可以选择0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

当氯化钠、氯化钾、磷酸盐、抗坏血酸钠、丙三醇、1,3-丙二醇、乙醇和聚乙二醇、乙二胺四乙酸以上述特定的浓度存在于细胞保存液时，可以更好的固定细胞，保护细胞抗原，延长细胞用于制片的保存期。

优选地，所述细胞保存液还包括冰醋酸。

本发明创造性地发现，抗坏血酸钠和冰醋酸之间可以相互正向影响，在抗氧化方面发挥更好的效果。

优选地，所述冰醋酸的质量百分含量为1％-5％；例如1％、2％、3％、4％、5％等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

冰醋酸的质量百分含量为上述浓度时，细胞保存液的抗氧化效果最佳。

优选地，所述细胞保存液通过将各制备原料进行物理混合得到。

第二方面，本发明提供一种液态细胞质控品，所述液态细胞质控品采用包括如下步骤的制备方法制得：收集细胞、将细胞与第一方面所述的细胞保存液混合。

本发明所述液态细胞质控品，制备方法不包含石蜡包埋切片等繁琐步骤，只需离心收集细胞，再将细胞在细胞保存液中重悬，方法简单、高效，在实验需要时可以直接滴片制片，节省了时间。所述液态细胞质控品可以直接进行储存和运输，储运方便。且液态细胞质控品滴加到玻片后不会迅速风干导致细胞上的表位被进一步破坏，具有良好的染色效果。

优选地，所述细胞保存液中细胞的密度为10

第三方面，本发明提供一种根据第二方面所述的液态细胞质控品在制备适用于组织细胞原位检测或分析方法中的对照品中的应用。

优选地，所述组织细胞原位检测或分析方法包括免疫组化、原位杂交或免疫细胞化学染色。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的细胞保存液，可以较好的固定细胞，保护细胞抗原，延长细胞用于制片的保存期。其中醇可以固定细胞、保持细胞形态；抗坏血酸钠作为抗氧化剂，可以提高染色的准确性和稳定性；乙二胺四乙酸可以降低金属离子对细胞核酸的影响。使用本发明的细胞保存液制成的液态细胞质控品，可以方便的储存和运输，并在需要时进行滴片制片，制片时不会迅速风干，染色效果好。

本发明所述液态细胞质控品，制备方法不包含石蜡包埋切片等繁琐步骤，只需离心收集细胞，再将细胞在细胞保存液中重悬，方法简单、高效，在实验需要时可以直接滴片制片，节省了时间。所述液态细胞质控品可以直接进行储存和运输，储运方便。且液态细胞质控品滴加到玻片后不会迅速风干导致细胞上的表位被进一步破坏，具有良好的染色效果。

附图说明

图1是本发明应用例1的镜检结果图；

图2是本发明应用例2的镜检结果图；

图3是本发明应用例3的镜检结果图；

图4是本发明应用例4的镜检结果图；

图5是本发明应用例5的镜检结果图；

图6是本发明应用例6的镜检结果图；

图7是本发明应用例7的镜检结果图；

图8是本发明对比应用例1的镜检结果图；

图9是本发明对比应用例2的镜检结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种细胞保存液，所述细胞保存液包括氯化钠0.55％、氯化钾0.05％、磷酸二氢钠0.2％、抗坏血酸钠0.05％、丙三醇6％、1,3-丙二醇6％、乙醇15％、乙二胺四乙酸0.05％、聚乙二醇4000 0.3％和水补足至100％。

制备方法：将氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、抗坏血酸钠、丙三醇、1,3-丙二醇、乙醇、乙二胺四乙酸、聚乙二醇4000和水进行物理混合。

实施例2

本实施例提供一种细胞保存液，所述细胞保存液包括氯化钠0.18％、氯化钾0.01％、磷酸二氢钠0.5％、抗坏血酸钠0.1％、丙三醇4％、1,3-丙二醇3％、乙醇20％、乙二胺四乙酸0.01％、聚乙二醇2000 0.4％和水补足至100％。

制备方法参照实施例1。

实施例3

本实施例提供一种细胞保存液，所述细胞保存液包括氯化钠0.8％、氯化钾0.1％、磷酸二氢钠0.14％、抗坏血酸钠0.01％、丙三醇9％、1,3-丙二醇8％、乙醇10％、乙二胺四乙酸0.1％、聚乙二醇6000 0.05％和水补足至100％。

制备方法参照实施例1。

实施例4

本实施例提供一种细胞保存液，所述细胞保存液包括氯化钠0.55％、氯化钾0.05％、磷酸二氢钠0.2％、抗坏血酸钠0.05％、丙三醇6％、1,3-丙二醇6％、乙醇15％、乙二胺四乙酸0.05％、聚乙二醇4000 0.3％、冰醋酸3％和水补足至100％。

制备方法参照实施例1。

实施例5

本实施例提供一种细胞保存液，其与实施例1的区别仅在于，不含有丙三醇，将丙三醇的质量百分含量按比例分配至1,3-丙二醇和乙醇的质量百分含量上，其他成分和含量保持不变。

制备方法参照实施例1。

实施例6

本实施例提供一种细胞保存液，其与实施例1的区别仅在于，不含有1,3-丙二醇，将1,3-丙二醇的质量百分含量按比例分配至丙三醇和乙醇的质量百分含量上，其他成分和含量保持不变。

制备方法参照实施例1。

实施例7

本实施例提供一种细胞保存液，其与实施例1的区别仅在于，不含有乙醇，将乙醇的质量百分含量按比例分配至丙三醇和1,3-丙二醇的质量百分含量上，其他成分和含量保持不变。

制备方法参照实施例1。

对比例1

本对比例提供一种细胞保存液，所述细胞保存液购于美国BD公司，商品名为细胞保存液。

应用例1

本应用例提供一种液态细胞质控品，所述液态细胞质控品的制备包括以下步骤：

(1)取P16蛋白表达阳性的贴壁Hela细胞消化，离心后取10

(2)使用1ml实施例1所述的细胞保存液重悬Hela细胞，制成细胞悬液，然后转移至10ml实施例1所述的细胞保存液中。

应用例2-7

本应用例提供六种液态细胞质控品，其与应用例1的区别仅在于，将实施例1所述的细胞保存液等量地替换为实施例2-7所述的细胞保存液，其他制备方法保持不变。

对比应用例1

本对比应用例提供一种液态细胞质控品，其与应用例1的区别仅在于，将实施例1所述的细胞保存液等量地替换为对比例1所述的细胞保存液，其他制备方法保持不变。

对比应用例2

本对比应用例提供一种P16蛋白表达阳性的宫颈癌组织蜡块，所述组织蜡块为广州安必平医药科技股份有限公司组织蜡块样本库保存。

测试例1

取15μl应用例1-7、对比应用例1所述的Hela细胞悬液滴加在玻片上。

取对比应用例2所述的组织蜡块切片，切片厚度为3μm，捞片和摊片后，烘箱中60℃烤片15min。

1、进行脱蜡和水化：

脱蜡前将样本横放在60℃恒温箱中烘烤2h。

(1)置于二甲苯中浸泡10min后，依次从脱蜡液I涮到脱蜡液Ⅲ，并在脱蜡液Ⅲ中浸泡10min；

(2)依次在无水乙醇I、Ⅱ和95％乙醇Ⅲ中各浸泡5min；

(3)蒸馏水冲洗。

2、进行高温高压热抗原修复：

取1mmol/L的EDTA(pH8.0)1000ml于高压锅中，将脱蜡水化后的样本玻片置于耐高温塑料切片架上，放入高压锅中大火加热至沸腾。从喷气开始，计时2min后停止加热。静置5min后，平移到水槽中，往锅盖上浇水强制冷却，直至自动锁芯落到原位后，取下限压阀，打开锅盖，取出玻片，自来水冲洗玻片。

3、进行过氧化物酶阻断：

(1)除去多余的液体，浸泡在阻断剂(3％过氧化氢)溶液中，室温下湿盒中孵育10min后，自来水冲洗。

(2)用免疫组化笔在细胞和组织边缘2mm处画疏水圈，放入自来水中洗3次。

4、滴加一抗：

(1)除去多余的液体，滴加相应的一抗工作液，室温下湿盒中孵育30min；

(2)PBS冲洗。

5、滴加二抗：

除去多余的液体，滴加一步法二抗(LBP-VBright I通用型二抗聚合物)，室温下湿盒中孵育20min后，PBS冲洗。

6、滴加DAB显色：

(1)DAB工作液：DAB色原:DAB缓冲液＝1:20；

(2)除去玻片上多余的液体；

(3)在样品上滴加DAB工作液，使其完全覆盖于样本上，孵育5min后，蒸馏水终止显色。

7、使用苏木素复染10s，返蓝液返蓝10s。

8、分别浸泡于95％乙醇、无水乙醇I、Ⅱ中各1min进行脱水。

9、风干封片、镜检。

应用例1-7的镜检结果如图1-7，对比应用例1-2的镜检结果如图8-9。可以得出：对比应用例2的结果可见宫颈癌组织表达P16，免疫组化染色效果明显；应用例1-3的结果可见Hela细胞表达P16，免疫组化染色效果明显，由此可以得出使用本发明所述细胞保存液制备液态细胞质控品方法简便，省去石蜡包埋、切片的步骤，可以快速、高效、稳定的制备液态细胞质控品。应用例4的染色效果较应用例1更为明显，说明抗坏血酸钠和冰醋酸在提高免疫组化染色效果上可以相互正向影响。应用例5-7的染色效果均次于应用例1，说明丙三醇、乙醇、1,3-丙二醇在提高免疫组化染色效果上存在协同作用。对比应用例2并无免疫组化染色，说明市面上常规的细胞保存液无保护细胞抗原表位的功能，免疫组化步骤中的风干导致细胞上的表位被进一步破坏，导致染色效果差。

测试例2

将应用例1-7、对比应用例1所述的液态细胞质控品在55℃的条件下保存15天。在第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天的时间节点，将上述保存条件下的细胞悬液进行P16抗体免疫组化染色，实验步骤参考测试例1，免疫组化染色效果评分标准如表1，P16抗体免疫组化染色效果如表2所示。

表1

表2

实验结果表明，应用例4所述的液态细胞质控品在55℃的条件下保存且维持细胞免疫组化染色+++效果的时间较应用例1更长，说明抗坏血酸钠和冰醋酸在提高细胞保存液的保存性能上可以相互正向影响。应用例5-7所述的液态细胞质控品在55℃的条件下保存，免疫组化染色效果次于应用例1，说明丙三醇、乙醇、1,3-丙二醇在提高免疫组化染色效果上存在协同作用。根据阿伦尼乌斯公式，55℃的条件下保存细胞14天相当于在室温条件下保存细胞1年，所以本发明所述的细胞保存液在室温条件下保存10-12个月，仍能保证细胞有较好的免疫组化染色效果。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的细胞保存液及液态细胞质控品的制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。