一种利用光谱调控小黄鱼卵巢成熟的方法

技术领域

本发明涉及小黄鱼养殖技术领域，尤其涉及一种利用光谱调控小黄鱼卵巢成熟和免疫水平的方法。

背景技术

硬骨鱼类卵巢的发育和成熟与环境因素如温度、盐度、光照周期和光照强度等密切相关。近些年来，关于光谱对繁殖行为和卵巢成熟的研究也有相关报道，如罗非鱼在蓝光下刺激下出现推动沙子开始建造巢穴等。在卵子成熟过程同时中伴随着亲鱼免疫水平的变化，亲鱼通过运输作用将免疫因子运至卵巢中，通过受精作用进入胚胎并发挥保护作用。研究发现不同光谱对鱼类繁殖行为及卵巢成熟影响迥异，如当用4种不同颜色的LED灯（红光、绿光、蓝光和全光）及自然光处理圆尾金翅雀鲷（

激素在卵巢成熟过程中发挥了重要的调控作用，褪黑素主要是通过影响下游激素的分泌来实现对卵巢成熟的调控作用，如能加速卡特拉鱼（

结合光谱对鱼类卵巢成熟的不同影响，为进一步提高小黄鱼亲鱼繁殖能力，优化繁育调控措施，本发明提出一种利用光谱调控小黄鱼卵巢成熟的方法，并且对同时期不同光谱下鱼体的免疫水平和生长表现进行了综合的评估分析。

发明内容

本发明提供了一种利用光谱调控小黄鱼卵巢成熟和免疫水平的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种利用光谱调控小黄鱼卵巢成熟和免疫水平的方法，包括以下步骤：S1，在养殖桶上方约80cm处悬挂LED灯，LED灯用于发射波段为660-670 nm的红光，并用遮光帘将灯和养殖桶遮盖，养殖桶外接循环水装置；

S2，每个养殖桶中随机放置相同数量当年孵化的小黄鱼亲鱼，进行养殖。

作为本技术方案的进一步改进方案：LED灯还可以发射波段为455-465 nm的蓝光、波段为515-525 nm的绿光、波段为400-780nm的白光。

作为本技术方案的进一步改进方案：进行养殖过程中需要利用光谱仪测量并调整LED灯的旋钮，使得每个养殖桶水面的光通量均为1.89±0.04 μmol·m

作为本技术方案的进一步改进方案：进行养殖时，养殖水温为9.3-16.2℃。

作为本技术方案的进一步改进方案：进行养殖时，养殖桶内水的pH值为8.03-8.35。

作为本技术方案的进一步改进方案：进行养殖时，养殖桶内水的溶解氧浓度为3.82-6.4 mg/L。

作为本技术方案的进一步改进方案：进行养殖时，养殖桶内水的盐度为25‰。

作为本技术方案的进一步改进方案：进行养殖时，LED灯对养殖桶的每日24小时的光照周期为前12小时照射后12小时关闭。

作为本技术方案的进一步改进方案：进行养殖时，小黄鱼亲鱼的投喂频率为每天1次，并添加沙蚕进行营养强化。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明设计合理，构思巧妙，通过将对小黄鱼照射660-670 nm波段的红光，可以对小黄鱼亲鱼的卵巢成熟和亲鱼免疫球蛋白水平有明显的促进作用，并且对该阶段鱼体的生长不存在一直作用，因此该光谱适用于小黄鱼亲鱼的繁育调控。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实验结束时各组小黄鱼卵巢外观示意图；

图2为各组别小黄鱼性腺指数（GSI）变化.不同字母表示相同取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图；

图3为各组别小黄鱼卵巢组织学分析示意图，其中a: 实验初始无光谱处理的卵巢切片；b 和 c: 实验结束时不同放大倍数下蓝光组卵巢切片 b: scale bar=200 μm; c:scale bar=500 μm. d-h: 4.9时黑暗组(d)、全光组 (e)、 自然光组 (f)、绿光组 (g) 和红光组 (h) 卵巢切片. Scale bar=500 μm. (1): Ⅱ期卵母细胞； (2): Ⅲ期卵母细胞(previtellogenic). (3) and (4): 早期和晚期Ⅳ期卵母细胞；(5):Ⅴ期卵母细胞. (6)和(7): 卵黄蛋白幼体自卵质外围逐渐向中心移动；

图4为实验结束时小黄鱼卵巢中卵黄蛋白水平比较.不同字母表示该取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图；

图5为各组别小黄鱼血清中褪黑素水平变化.不同字母表示相同取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图；

图6为各组别小黄鱼血清中雌二醇水平变化.不同字母表示相同取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图；

图7为各组别小黄鱼肝重指数（HSI）变化.不同字母表示相同取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图；

图8为各组别小黄鱼肝脏中卵黄蛋白原水平变化.不同字母表示相同取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图。

图9为各组别小黄鱼全长变化.不同字母表示相同取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图；

图10为各组别小黄鱼体重变化.不同字母表示相同取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图；

图11为各组别小黄鱼血清中生长激素水平变化.不同字母表示相同取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图；

图12为实验结束时小黄鱼卵巢中IgM 与C3水平比较.不同字母表示该取样时间下各组之间具有显著差异（P<0.05）示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在下列段落中参照附图以举例方式更具体地描述本发明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

实施例1

一种利用光谱调控小黄鱼卵巢成熟与免疫水平的方法，包括以下步骤：S1，在养殖桶上方约80cm处悬挂LED灯，LED灯用于发射波段为660-670 nm的红光，并用遮光帘将灯和养殖桶遮盖，养殖桶外接循环水装置；

S2，每个养殖桶中（h=d=1.5m）随机放置60尾当年孵化的小黄鱼亲鱼，进行养殖过程中需要利用光谱仪测量并调整LED灯的旋钮，使得每个养殖桶水面的光通量均为1.89±0.04 μmol·m

实施例2

对于实施例2与实施例1的不同之处在于：LED灯用于发射波段为455-465 nm的蓝光。

实施例3

对于实施例3与实施例1的不同之处在于：LED灯用于发射波段为515-525 nm的绿光。

实施例4

对于实施例4与实施例1的不同之处在于：LED灯用于发射波段为400-780 nm的白光。

对比例1

对于对比例1与实施例1的不同之处在于：将LED灯改为自然光照，在自然光照条件下进行养殖小黄鱼亲鱼。

对比例2

对于对比例2与实施例1的不同之处在于：关闭LED灯，在黑暗条件下进行养殖小黄鱼亲鱼。

对于上述实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1和对比例2分别对应设置为红光组、蓝光组、绿光组、白光组、全光组和黑暗组，对于以上每隔实验组的检测实验为：

根据往年小黄鱼亲鱼性腺成熟过程选取了以下时间点1.8，1.30，2.23，3.17 和4.9进行取样，时间间隔为3周。每次取样每个桶中随机取2尾雌鱼，经MS-222麻醉后，用吸水纸吸干体表水分，对全长、体重和体长进行测量和统计，之后将抽取的血液置于1.5ml无菌的离心管中于4℃下静置过夜。抽血完成后，对亲鱼进行解剖，取得肝脏和卵巢并分别对其进行称重，记录相关数据。并根据公式：GSI=100 ×性腺重/体重及HSI=100×肝脏重/体重对GSI和HSI进行计算。并在将肝脏和卵巢切成适当大小后，将后者分别用4%多聚甲醛和液氮固定，对于前者则只进行液氮固定。

血清中激素、卵黄蛋白原（VTG）、C3和IgM检测方法：血液静置过夜后，在4000 r/min 下离心15分钟，取上清，检测其中褪黑素和雌二醇及生长激素的水平。检测实验利用ELISA试剂盒完成（默沙克，武汉，中国）。从液氮中取出冻存的肝脏和卵巢组织，冰上融化后，按照ELISA的方法分别对其中的卵黄蛋白原、C3和IgM水平进行检测（默沙克，武汉，中国）。上述实验的具体操作均按照说明书进行。

卵巢组织学分析方法为：经过梯度酒精处理脱水、透明和石蜡包埋后(Paraplastplus; Sigma, St. Louis, MO)，按照 5 μm的厚度进行切片，并进行HE染色。利用光学显微镜 (NikonYS-100,Tokyo, Japan) 进行观察和拍照(Nikon Coolpix-4500, Tokyo,Japan)。

以上数据分析中GSI, HSI, 褪黑素、雌二醇、VTG 数据按照平均值± 标准偏差的形式. 按照“One way analysis of variance (ANOVA) ”和Tukey’s检测进行分析，以P<0.05为表明具有显著差异性。

检测实验结果为：

（1）各光谱对卵黄蛋白原合成与累积具有不同影响。

激素调控方面，通过对血清中褪黑素和雌二醇进行检测，发现随实验的进行，各组自身的褪黑素水平存在小幅度地先降低后升高的波动变化，同时各组间也存在差异。整体而言，各组褪黑素水平均在3.17时达到最低，之后再次升高。在整个波动变化中，自然光组变化最明显，并且其水平显著低于其他各组。其余5组至实验结束时，全光组和红光组褪黑素显著高于黑暗组和蓝光组，绿光组介于两者之间（图5）。与褪黑素不同，雌二醇在整个实验中呈现逐渐降低的趋势，但在各组中降低的快慢不一，从2.23开始降低的幅度加大，至4.9时黑暗组、自然光组和全光组的雌二醇水平显著低于红光组和绿光组，蓝光组介于其中（图 6）。

各组卵巢成熟状况及GSI和组织学分析结果见图1与2。从Fig 1可以明显看出红光组的卵巢个体最大，饱满度最好。蓝光组、黑暗组和全光组（白光组）的卵巢形态相似，而绿光组卵巢尽管饱满度较好，但个体最小。自然光组卵巢饱满度最低。性腺指数分析显示，各组GSI自2.23开始快速上升，从3.17开始组间差异趋于明显，至4.9时，红光组的GSI显著高于其他光谱组（图2）。

通过对4.9时各组卵巢进行组织学分析，发现实验初始时，卵巢中卵母细胞主要出于Ⅱ 和 Ⅲ期，只有少数处于Ⅳ期，并发现其中已有少量的卵黄蛋白（图3(a)）。至4.9时，各光谱组间卵巢成熟情况差异显著图3(b-h)：与蓝光组、绿光组和自然光组相比，其他光谱组红光组、黑暗组和全光组成熟程度更高，蓝光组中大部分卵母细胞处于Ⅲ和Ⅳ早期，自然光组和绿光组中出现了部分Ⅳ甚至Ⅴ期卵母细胞，但仍存在大量的Ⅲ期和Ⅳ早期卵母细胞（图3(f和g)）。黑暗组中成熟的卵母细胞明显增多，同时可见Ⅳ期卵母细胞(图3(d))。全光组和红光组中大部分卵母细胞已经处于Ⅴ期和Ⅳ期，但是后者卵母细胞外形更为均一，并且排列更加密集(图3(e and h))。通过对4.9时各组卵巢中的卵黄大白进行检测和分析，发现红光组中卵黄蛋白水平显著高于自然光组，其次是黑暗组、全光组和绿光组，蓝光组最低（图4）。

通过对不同光谱下肝重指数（HSI）及肝脏中卵黄蛋白原的水平进行检测，发现光谱对该蛋白原的合成具有调控作用，结果如图7和8所示。发现各组HSI在整个实验过程中先升高后降低，但每组的变化特点不完全一致。红光组、蓝光组和自然光组的肝重在1.30时已处于最大值，并且持续至3.17.全光组、黑暗组和绿光组的肝重则要在3.17达到最大值。至实验结束时各组的HSI均低于起始水平，自然光组、全光组和绿光组HSI最大，红光组和黑暗组次之，蓝光组最低（图 7）。各组肝脏中合成的卵黄蛋白水平自1.8开始下降，在1.30时可见明显的组间差异，并自该时期至实验结束各组基本保持在稳定的水平，但红光组和绿光组及全光组中该蛋白水平最高，黑暗组和自然光组次之，蓝光组最低（图8）。

（2）不同光谱下亲鱼生长表现不同。

不同组别小黄鱼全长、体重及生长激素变化如图1-3所示。全长方面， 各组亲鱼在实验期间持续增长，但是各组别之间没有显著差异（图9）。体重方面，各组均在前期保持上升趋势，其中红光组在整个实验阶段内保持上升趋势，而绿光组和全光组体重从3.17由原来的上升转为下降，黑暗组、蓝光组和自然光组的体重则从2.23开始下降。截止实验完成时，红光组体重显著高于其他组，其余依次为绿光组、全光组、黑暗组和蓝光组，自然光组最低（图10）。各组生长激素的变化与体重变化趋势基本一致，各组均呈现出先升后降的波动变化趋势，在该实验时期内，自1.8至3.17完成首次波动变化并在3.17达到最低水平，之后再次上升。但各组生长激素水平高低不同，比如在最高点（2.23）时，绿光组和全光组中生长水平显著高于红光组和蓝光组，其次高于黑暗组和自然光组。整个实验阶段中自然光组中的生长激素水平均显著低于其他光谱组（图11）。

（3）各光谱对亲鱼免疫水平具有不同影响

免疫水平方面，发现各组在非特异性免疫如C3方面没有显著差异性（图12b），但在特异性免疫如IgM方面，红光组和绿光组中该蛋白的水平显著高于其他四组（图12 b）。

综合上述分析，我们发现红光在小黄鱼雌鱼亲鱼卵巢成熟和免疫水平具有显著的促进作用，同时不会对个体生长产生抑制作用。具体体现在以下方面：

（1）光谱能显著影响血清中主要激素褪黑素及雌二醇的水平，尽管各组雌二醇水平在实验期间逐渐下降，但是不同光谱下该激素下降的幅度及快慢不同，如红光组自2.23至4.9水平基本稳定，而其他组别包括自然光组中该激素水平呈现快速下降，说明红光能延缓雌二醇的降低，使得该光谱处理下的小黄鱼体内雌二醇水平高于其他光谱组。

（2）光谱能显著影响肝重指数及肝脏细胞中卵黄蛋白原的合成。卵黄蛋白原的合成在雌二醇调控下进行，红光下小黄鱼雌鱼血清中雌二醇水平更高，该组肝脏中合成的卵黄蛋白原更多。说明红光促进了雌二醇及卵黄蛋白原的分泌合成及运输过程，经过了近3个月的光谱作用累积，到4.9时，红光组卵巢中VTG储备水平远高于其他组，这为后期胚胎孵化过程中提供了更多的能量储备。

（3）生长方面，繁殖期间同时存在个体生长活动，根据各组全长变化，发现各组在实验期间持续生长，尽管差异不显著，红光组、绿光组和全光组的生长仍快于黑暗组、蓝光组和自然光组。

（4）光谱能显著影响卵母细胞的特异性免疫水平。免疫水平升高，意味着受精后胚胎具备了更高的抵抗外界病菌的能力，也进一步提高了孵化率和存活率。

综合上述发现，光谱对小黄鱼卵巢的成熟及免疫球蛋白IgM水平具有显著影响，其中波段为660-670 nm的红光对上述过程具有明显的促进作用，对实际生产有一定的应用价值。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按说明书附图所示和以上所述而顺畅地实施本发明；但是,凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时,凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。