一种复合钙剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及血液凝固检测领域，尤其是涉及一种复合钙剂及其制备方法与应用。

背景技术

血液凝固活性是用于得到指标的重要项目，所述指标用于筛选外源性凝血因子不足或监测肝功能的异常和口服给药的抗凝血剂治疗。现阶段，凝血功能试验评估主要包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、D-二聚体检测(D-dimer)。当使用PT测定法和APTT测定进行检测时，将蛋白和凝固血液的钙离子大体上混合作为血浆中的凝固反应触发物，测定从混合开始到凝固完成的时间(凝固点)，并通过比较测得时间与标准血浆结果估测滞后时间。

这种测定内源性/外源性血液凝固途径的血液凝固活性的PT法目前在国际上已经标准化并且被广泛使用。例如电流法、磁珠法、光学法检测，其方法是将样品(标本)与活化剂一起引入，并通过电阻增大、黏度增强、浊度上升测定血液凝固时间。

然而这些试验主要反映内源、外源凝血途径中某些因子的缺乏或活性抑制，表现为凝血时间延长，并不能反映病理性促凝物质代谢失衡导致的凝血功能异常，他们主要用于诊断和鉴别出血性疾病、监测出血风险；但由于此类试验对凝血因子活性增强不敏感，凝血时间缩短现象大多没有明确的临床意义，与病理性高凝状态缺乏关联性，不能有效评估各种临床血栓风险。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定、多用途的复合钙剂。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述复合钙剂的制备方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述复合钙剂在血液凝固相关检测中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种复合钙剂，功效成分由CaCl

优选的，上述复合钙剂，各组份质量比为CaCl

上述复合钙剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)称取各组份备用；

(2)将各组份按照质量比CaCl

优选的，上述复合钙剂的制备方法，所述步骤(2)中CaCl

上述复合钙剂作为血液凝固检测试剂方面的应用。

优选的，上述复合钙剂的应用，通过震动、旋转、晶振谐振粘度法测定离体全血在添加所述复合钙剂后血液粘度改变的时间。

优选的，上述复合钙剂的应用，通过黏度改变检测法测定离体全血在添加所述复合钙剂后纤维蛋白形成显著变化的时间。

优选的，上述复合钙剂的应用，具体步骤如下：

a.向离体静脉血中加入抗凝剂后静置，备用；

b.针对步骤a中备用血液进行检测，首先前后颠倒取血管混匀，取部分全血缓慢加入到反应杯中，加入复合钙剂，37℃下混匀后通过凝血功能检测仪进行检测；

c.取步骤b中剩余全血，在高速离心管离心，制备无血小板血浆(ppp)；

d.取步骤c中离心后的无血小板血浆0.1-0.5ml，加入复合钙剂，在37℃度混匀上机检测，读取PPP的GCT值(总体凝固时间)；

e.剩余全血标本，继续离心，取富含血小板血浆0.1-0.5ml，加入复合钙剂，在37℃混匀上机检测。

优选的，上述复合钙剂的应用，与复合钙剂配合使用的抗凝剂(上述步骤a中抗凝剂)为3.8％枸橼酸钠/柠檬酸钠，抗凝剂与静脉血比例为1：9。

本发明的有益效果是：

上述复合钙剂克服了以往钙试剂品质易变的缺陷，可稳定保存。应用于血液凝固检测，可以使测试结果更加稳定，降低实验方差，稳定钙离子；同时复合钙剂的出现也丰富了血液凝固检测方法，所述复合钙剂在没有促凝物质的血浆中并不能激活凝血系统，而在全血或含有促凝物质的血浆中可诱发凝血系统激活，形成纤维蛋白，并导致全血或血浆粘度及电导率等物理性状的表观改变，这种改变可敏感反映血中促凝物质的促凝强度，以及凝血系统活化能力和程度；从凝血酶被活化到纤维蛋白形成的过程(血浆凝固)所用时间，可以反映人血中相关物质的促凝活性，凝固时间的长短与组织细胞急性损伤等病理状态下细胞、器官组织产生的碎片、细胞外微囊泡的水平与其促凝功能相关，进而反映人体在病理状态下高凝状态及严重程度，该方法重复性好、灵敏度高、操作简便，具有重要的临床应用价值。该方法具体优势在于：

1、采用复合钙剂的凝血功能检测方法与目前临床常规凝血功能检测方法不同，不需添加其他促凝物质，仅加入复合钙剂即可诱导凝血物质对凝血系统产生激活效应，因此能够更为客观地反映血液凝固功能的真实状态；

2、可在凝血功能紊乱发生的早期敏感地反映促凝物质蓄积(促凝物质含量超出了机体代谢能力和凝血系统的代偿能力)，可用于创伤、病理妊娠、自身免疫性疾病、肿瘤等多种临床疾病中凝血功能紊乱的早期诊断，弥补了以往临床常规凝血功能检测方法在高凝状态检测方面的不足；

3、此方法操作简便，受检测过程的干扰因素少，借助小型仪器可在床旁实现早期、实时快速的凝血功能监测，为临床凝血功能紊乱的早期诊断及治疗提供有力支撑。

附图说明

图1为不同种类CaCl

图2为不同血量在CaCl

图3为全血加入不同浓度CaCl

图4为PRP加入不同浓度CaCl

图5为PPP加入不同浓度CaCl

图6为GCT实验中CaCl

图7为复合钙试剂中不同比例的CaCl

图8为相同血样在不同时间点全血GCT检测图。

图9为不同人群全血、PPP、PRP检测GCT的对比图。

图10为不同钙剂APTT凝血时间对比图。

图11为不同钙剂在血栓弹力实验中的参数比较图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

氯化钙的选择

全血GCT(General Clotting Time，GCT，总体凝固时间)检测凝血过程中，不加入其他促凝物质，只观测血液在CaCl

CaCl

在Sigma-Aldrich的官方网站中有25种CaCl

实验步骤：1)用去离子水将5种CaCl

实验结果：由于抽取不同人的血液，GCT凝固时间不同，测量数据也仅仅在抽血后2～3小时内稳定，因此对比CaCl

结果显示多次对比试验中CaCl

实施例2

建立GCT检测体系

1、GCT检测血量的确定

实验步骤：1)用去离子水将CaCl

表1

实验结论：1)200ul、250ul、350ul全血在70mM及100mM CaCl

2、GCT检测全血时CaCl

实验步骤：1)用去离子水将CaCl

实验结论：全血在加入18、28、373mM溶液时未检测到GCT时间，在加入35、326mMCaCl

3、GCT检测富含血小板血浆(PRP)中CaCl

实验步骤：1)用去离子水将CaCl

实验结论：PRP在加入42、500mM溶液时未检测到GCT时间，在加入56、420mM CaCl

4、GCT检测无血小板血浆(PPP)中CaCl2溶液浓度的确定

实验步骤：1)用去离子水将CaCl

实验结论：PPP在加入56mM溶液时未检测到GCT时间，在加入70、420mM CaCl

通过实验发现350ul全血的GCT时间平台期的CaCl

实施例3

CaCl

在GCT实验过程中，CaCl

CaCl

1、初步探索CaCl

实验步骤：1)用去离子水将CaCl

表2不同pH值对GCT凝血检测功能的影响

结果显示：采用1M pH值6.8、7.0、7.4的Tris-HCl按照比例混合得pH 6.75-7.3的1M Tris-HCl溶液，再加入CaCl

2、CaCl

实验步骤：1)用去离子水配置1M CaCl

结果显示：当钙离子在溶液中浓度为100mM且CaCl2：Tris-HCl：山梨酸钾的质量比为1:1:1时GCT没有出现数值，取出检测杯观测，血液呈现半凝固状态，原因未知。随着Tris-HCl和山梨酸钾在试剂中质量的增加并未出现随着浓度升高而凝血时间延长的趋势，在CaCl

3、同时通过延长检测时间，检验CaCl

选用CaCl

实验步骤与前一实验相同，采用相同血样在不同时间点进行检测(图8)。加入稳定剂后GCT的检测数值随着时间的改变检测数值相较于不加入稳定剂的CaCl

实施例4

GCT-全血、和PPP-GCT、PRP-GCT在正常人及妊高症病人及癌症患者中的检测。

实验步骤：按照CaCl

其中纳入35例25-50岁来自健康体检中心的查体人员血样，通过问卷调查及以往体检资料，排除服用抗凝类药物且无心脏病、糖尿病等慢性疾病的健康人群。纳入35例妊娠高血压患者及35例癌症患者入院筛查的血样。依照前面建立的实验步骤进行检测：

1、常规穿刺静脉，抽取人静脉血(注意：抽血时避免过度挤压、反复穿刺等损伤，以免造成假性凝血系统激活)；

2、抗凝剂3.8％枸橼酸钠与全血1：9的比例获取抗凝全血(或应用临床商品化的枸橼酸抗凝管，抽取静脉血2ml)；

3、分别在测试杯中加入200ul全血、170ul复合钙试剂(CaCl

4、利用血液粘度或电导率测定仪连续多点(不少于每秒1次)检测血液粘度或电导率数值，采用计算机软件连续反复运算，当单位时间(2或3秒)内检测的粘度或电导率平均值显著高于以往各点的均值时(P<0.05)，或单位时间内(2或3秒)血液黏度值超过以往各点黏度均值4个厘泊单位时，记录样本开始检测后的总体时间(单位：秒)作为测定值。

结果发现：通过GCT凝血检测方法及复合CaCl

实施例5

CaCl

1、复合CaCl

HemosIL SynthAsil(美国沃芬公司)的活化的部分凝血活酶时间检验方法及原理：血浆样本与适量磷脂共同孵育，带有负电荷的接触激活剂与缓冲液共同作用启动内源性凝血途径。37度下孵育一定时间后，加入钙以触发凝血过程，测定血液凝固所需要的时间。其实验中所用到的CaCl

实验步骤：按照CaCl

2、复合CaCl

Thromblelastograph(美国Haemoneticse公司)即血栓弹力图实验(黏度测定法)用于体外检测人全血的凝聚时间(R)、血凝速率(Angle)、血块形成时间(K)、血块强度(MA)肌宁指数(CI)指标，用于评价人凝血及纤溶系统的功能。在样品测定杯中加入CaCl

实验步骤：按照CaCl

综上，本发明所述复合钙试剂通过钙离子的选择、实验血量检测体系的建立、溶液pH值的确定、以及添加复合钙试剂组份比例的确定等方面做了诸多探索，最终发现了符合GCT检测需要的复合钙试剂。该复合钙试剂不仅仅适用于GCT检测，也适用于HemosILSynthAsil(美国沃芬公司)的APTT实验，及Thromblelastograph(美国Haemoneticse公司)的血栓弹力图实验。

实施例6

一种复合钙剂，功效成分由CaCl

上述复合钙剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)称取各组份备用；

(2)将各组份按照质量比CaCl

实施例7

一种复合钙剂，功效成分由CaCl

上述复合钙剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)称取各组份备用；

(2)将各组份按照质量比CaCl

实施例8

一种复合钙剂，功效成份由CaCl

上述复合钙剂的制备方法，具体步骤如下：

(1)称取各组份备用；

(2)将各组份按照质量比CaCl

综上，本发明利用特定组份的复合钙剂可以实现简便快速的全血检测，其原理主要是：生理状态下，人体血液中存在着由于生理代谢产生的表面具有磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)等促凝物质的细胞、血小板及细胞外微囊泡，这些具有促凝功能的成份可通过代谢渠道清除，并不导致凝血系统失衡(凝血紊乱)。

在病理状态下，表面具有磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)等促凝物质的细胞(可来源于损伤细胞)、血小板及细胞外微囊泡(包括来源于损伤组织细胞的细胞外微囊泡)大量增加，超出了生理代谢的阈值并在血中蓄积，可导致血液处于高凝状态。一旦打破生理性凝血-纤溶系统平衡，可引起血液出现凝血功能紊乱。临床表现为血液高凝或血栓形成，也可因大量凝血物质消耗而出现出血倾向。

本发明采用的复合钙剂在没有促凝成份的血浆中并不能激活凝血系统，而在含有上述促凝成份的全血或血浆中可诱发凝血系统激活，形成纤维蛋白，并导致全血或血浆粘度及电导率等物理性状的表观改变。这种改变可敏感反映血中促凝成份的代谢状态，以及凝血系统活化程度。通过专用仪器测定血液粘度或电导率的表观特征改变，客观反映出人体内凝血状态，为临床早期发现凝血功能紊乱(高凝或低凝状态)提供依据。

上述复合钙剂作为血液凝固检测试剂，在应用过程中以全血中不同疾病时产生的特异性细胞、细胞外微囊泡作为促凝剂(不再需要其他介质或诱导剂，减少体外干扰)，基于病理状态下微粒的促凝机制，在Ca

以上所述实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。