基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒及其应用

技术领域

本申请涉及免疫诊断技术领域，尤其涉及基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒及其应用。

背景技术

我国是乙型肝炎大国，由乙型肝炎发展所致的肝硬化和肝细胞肝癌已为我国医疗资源带来了很大的负担。肝癌的发病率仅次于肺癌和胃癌，居第三位。其死亡率仅次于肺癌。由于肝癌的早期诊断对于有效治疗和长期生存至关重要，因此，十分强调肝癌的早期筛查和早期检测。

甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是一种糖蛋白。正常情况下，来自胚胎的肝细胞和卵黄囊，胎儿出生约两周后甲胎蛋白从血液中消失。正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20μg/L。1956年发现，60年代末应用于临床，70年代用于自然人群与肝癌高危人群普查。至今被公认为优秀的肝癌诊断标记物而广泛使用。

高尔基体糖蛋白-73(Golgi Protein 73，GP73)又称Ⅱ型高尔基体膜蛋白(Golgiphosphoprotein2，GOLPH 2)是存在于高尔基体的一种跨膜蛋白，分子量73KD，恒定表达于正常肝脏的胆管上皮细胞，肝实质细胞中很少表达或几乎不表达。其在慢性肝炎、肝硬化等病人血清中浓度升高，而在肝细胞肝癌病人血清中升高更加明显，和正常人或良性肝病病人之间呈显著差异。荷兰伊拉斯莫斯大学医疗中心的一项荟萃分析显示，GP73作为一种新的血清标志物，其价值优于AFP，可用于肝癌诊断和监测。GP73对于评估术后效果、检测肝癌复发也具有重要意义。因此，GP73是对肝癌诊断非常有价值的生物标志物，可提高肝癌的早期诊断、早期治疗水平。

目前，高尔基体糖蛋白73常用的检测方法有酶联免疫法、化学发光免疫分析法、免疫层析法，这些方法都是基于抗原抗体特异性结合反应进行的检测。

(1)酶联免疫方法(ELISA)是较为常用的一种技术，是通过固相的抗原或者抗体和酶标后的抗原和抗体结合，常见的结合方式有双抗夹心法和间接法。酶联免疫法主要原理是采用双抗夹心的方法进行检测，包被抗体吸附于固相的载体表面，用来和特异抗原结合，当待测物中含有特异抗原时，与其形成抗原-抗体的复合物。再加入另一种用酶标记的抗体作为检测抗体，这种方式可以保留酶的活性和抗体的免疫学活性，用来提高ELISA方法的灵敏度。酶标记后的抗体会和待测物中抗原的不同表位结合形成抗体-抗原-抗体的双抗夹心复合物，形成的复合物也被结合在固相载体上，加入酶反应的底物后，底物会被酶催化成有色产物，有色产物颜色的深浅则可以判断待测物中抗原的浓度，从而进行定性或者定量的实验。该方法检测时间较长，检测范围窄。

(2)化学发光免疫分析法(CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。该方法检测精度不高，仪器设备的成本较高。

(3)免疫胶体金方法(ICA)是将高电子密度的胶体金作为标记物标记在抗体或者抗原上，由于胶体金的颜色可直接用肉眼观察，给操作者带来极大的方便，因而可以用以定性或者半定量的检测研究中。随着胶体金研究的发展，在金核的表面可以进行一定的修饰，主要为含硫的配体、含磷化物、磷氧化物、氨基和羧基的配体。该方法灵敏度较低，不能进行定量的检测，达不到临床诊断的要求。

发明内容

本申请实施例的目的在于提出一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，检测的灵敏度和准确性高，且检测耗时短。

为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，采用了如下所述的技术方案：

一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，所述试剂盒包括时间分辨荧光试纸，所述时间分辨荧光试纸包括PVC底板、硝酸纤维素膜、时间分辨荧光结合垫、样品垫和吸水纸；

其中，所述硝酸纤维素膜粘附在所述PVC底板上，所述时间分辨荧光结合垫和吸水纸分别粘附在硝酸纤维素膜的两端，所述样品垫粘附在时间分辨荧光结合垫的远离所述硝酸纤维素膜的一端，所述时间分辨荧光结合垫上固定有荧光微球标记的GP73单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线，其中，所述检测线包被有GP73单克隆抗体，所述质控线包被有鸡IgY抗体。

进一步的，所述硝酸纤维素膜通过如下步骤制得：

制备包被缓冲液；

通过所述包被缓冲液在初始硝酸纤维素膜上分别包被GP73单克隆抗体和鸡IgY抗体，分别作为检测线和质控线，获得所述硝酸纤维素膜。

进一步的，所述包被缓冲液包括pH为7.4的0.01-0.02M磷酸盐缓冲液和1％的海藻糖。

进一步的，所述检测线包被的GP73单克隆抗体的浓度为0.8-1.2mg/mL，包被量为1.0μL/cm，所述质控线包被的鸡IgY抗体的浓度为1.0-1.5mg/mL，包被量为1.0μL/cm。

进一步的，所述时间分辨荧光结合垫通过如下步骤制得：

制备荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液；

等比例混合所述荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液，获得荧光微球标记液；

将所述荧光微球标记液3-6μL/cm的喷量均匀喷在初始结合垫上，干燥后获得所述时间分辨荧光结合垫。

进一步的，所述制备荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液的步骤包括：

取固含量为1％的时间分辨荧光微球，加入标记缓冲液，混匀后加入标记活化液，离心并去上清，保留沉淀；

用标记缓冲液超声复溶沉淀，加入目标标记抗体，反应后加入封闭液，离心后，保留沉淀；

加入标记保存液，超声混匀，获得目标标记溶液；

其中，在所述目标标记抗体为GP73抗体时，所述目标标记溶液为荧光微球标记的GP73抗体溶液，在所述目标标记抗体为羊抗鸡IgY抗体时，所述目标标记溶液为荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液。

进一步的，所述样品垫通过如下步骤制得：

配置样品垫处理液；

将所述样品垫处理液均匀涂抹于初始样品垫上，干燥后获得所述样品垫。

进一步的，所述样品垫处理液为PB缓冲液，所述PB缓冲液包括0.5-1％的牛血清白蛋白、2％的海藻糖和0.05％-0.1％的吐温20。

进一步的，所述试剂盒还包括GP73稀释液，其中，所述GP73稀释液为磷酸盐缓冲液。

为了解决上述技术问题，本申请实施例还提出一种应用上述试剂盒定量检测高尔基体糖蛋白73的检测方法，采用了如下所述的技术方案：

将样本与所述试剂盒中的GP73稀释液混合后，滴加到试剂盒的检测板的加样孔中；

将检测板放置在荧光免疫检测仪中，荧光免疫检测仪将荧光信号值转换成样本中GP73浓度，获得输出的样本的GP73浓度。

与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：

荧光免疫层析技术，是免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)和传统免疫层析技术相结合发展创新的一种定量新型检测技术。该技术在保留胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速、便携性强的优点外，还通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定量。与传统定量检测技术相比，该技术具有更高的检测灵敏度、重复性好、检测范围更宽、价格低廉。本申请引入C、T线独立系统，使用双抗体夹心法荧光免疫层析技术定量检测血清或血浆中GP73的含量。

附图说明

为了更清楚地说明本申请中的方案，下面将对本申请实施例描述中所需要使用的附图作一个简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本申请的基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒的结构示意图。

附图标记：1、PVC板；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、检测线；6、质控线；7、吸水纸。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请；本申请的说明书和权利要求书及上述附图说明中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。本申请的说明书和权利要求书或上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。

在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。

以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不限定本申请。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

继续参考图1，示出了根据本申请的基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒的一个实施例的流程图。所述的基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒，所述试剂盒包括时间分辨荧光试纸，所述时间分辨荧光试纸包括PVC底板、硝酸纤维素膜、时间分辨荧光结合垫、样品垫和吸水纸；其中，所述硝酸纤维素膜粘附在所述PVC底板上，所述时间分辨荧光结合垫和吸水纸分别粘附在NC膜的两端，所述样品垫粘附在时间分辨荧光结合垫的远离所述硝酸纤维素膜的一端，所述时间分辨荧光结合垫上固定有荧光微球标记的GP73单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线，其中，所述检测线包被有GP73单克隆抗体，所述质控线包被有鸡IgY抗体。所述试剂盒还包括GP73稀释液，其中，所述GP73稀释液为磷酸盐缓冲液。

一种基于荧光免疫层析法定量检测高尔基体糖蛋白73的试剂盒的组成成分、包装及数量(25人份/盒)，如表1：

表1试剂盒的组成成分、包装及数量

时间分辨荧光免疫层析技术是一种在免疫渗透技术的基础上建立的一种快速的免疫学检测技术，本发明的试纸条具有制备过程和操作步骤简单，能够方便快捷的在临床诊断中检测出GP73的含量，用于肝癌的早期筛查和早期检测。临床诊断较为便利，无实验室条件限制，适合医疗条件不完善的基层医院和社区诊所的诊疗工作，普通医务人员经过简单的培训就可操作。本申请检测操作简单；检测用时短，快速、准确；检测灵敏度高，特异性好，只针对高尔基体糖蛋白73进行检测，无任何干扰因素能影响检测结果。

1、所述硝酸纤维素膜通过如下步骤制得：

(1)包被缓冲液的制备方法：所述包被缓冲液由pH为7.4的0.01-0.02M磷酸盐缓冲液、1％的海藻糖和纯化水制成。

(2)喷垫：将NC膜贴在PVC板上，用上述包被缓冲液包被抗体，检测线包被另一配对的GP73单克隆抗体，包被浓度为0.8-1.2mg/mL，包被量1.0μL/cm；质控线包被鸡IgY抗体，包被浓度为1.0-1.5mg/mL，划膜量(即包被量)为1.0μL/cm，37℃恒温干燥箱中固定4h后取出备用。

2、所述时间分辨荧光结合垫通过如下步骤制得：

(1)荧光微球标记的GP73抗体溶液的制备：取固含量为1％的时间分辨荧光微球100μL，加入标记缓冲液MES 1mL，涡旋混匀后加入100μL标记活化液，混匀后旋转反应20-40分钟，待反应完成后，10000rpm、4℃离心20-40min，去上清，用1mL MES标记缓冲液超声复溶。加入50-80μg GP73抗体，旋转反应20-40分钟，反应完成后加入封闭液100μL，旋转反应2h，封闭完成后10000rpm、4℃离心20-40min，离心结束弃掉上清，加入标记保存液5mL，超声混匀，2～8℃保存，获得荧光微球标记的GP73抗体溶液。

(2)荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液的制备：取固含量为1％的时间分辨荧光微球100μL，加入标记缓冲液MES 1mL，涡旋混匀后加入100μL标记活化液，混匀后旋转反应20-40分钟，待反应完成后，10000rpm、4℃离心20-40min，去上清，用1mL MES标记缓冲液超声复溶。加入50-80μg羊抗鸡IgY抗体，旋转反应20-40分钟，反应完成后加入封闭液100μL，旋转反应2h，封闭完成后10000rpm、4℃离心20-40min，离心结束弃掉上清，加入标记保存液5mL，超声混匀，2～8℃保存，获得荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液。

(3)将上述荧光微球标记的GP73抗体溶液和荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体溶液等体积混合，超声混匀，2-8℃保存，获得荧光微球标记液。

(4)将制备好的荧光微球标记液以3-6μL/cm的喷量均匀喷在结合垫上，在37℃下干燥(16～20)h。

3、所述样品垫通过如下步骤制得：

(1)样品垫处理液的配制：所述处理液为PB缓冲液，其中还包含0.5-1％的BSA(牛血清白蛋白)，2％的海藻糖，0.05％-0.1％吐温20。所述处理液可增加样品垫的吸收能力，控制微球释放，促进层析作用的发生。

(2)样品垫处理：将上述处理液按50mL/张(宽：25cm，长：30cm)的用量均匀涂抹在样品垫上，在18-28℃干燥16-24h，即可。将干燥后的样品垫上下两条长边各裁去5mm，然后裁为(23±1)mm×(300±10)mm大小，备用。

4、所述GP73芯片通过如下步骤制得：

取已进行中间产品检测合格的试纸条，GP73校准品，每个校准品至少有5个浓度，每个浓度至少测试3次，将各个浓度校准品测试值(T/C值)的平均值与浓度做标准曲线，在干式荧光免疫实验管理工具上，将准备的曲线数据填入表格中，进行曲线拟合，完成曲线的制备，将上述芯片数据于编程器中烧制芯片，获得所述GP73芯片。

5、应用上述试剂盒定量检测高尔基体糖蛋白73的检测方法：

测试时，样本与稀释液混匀，并滴加到试剂的加样孔中，在毛细效应下进行层析，样本中的GP73抗原与荧光标记GP73抗体结合，扩散至测试区，被检测线包被的GP73单克隆抗体捕获，并形成“抗体-抗原-荧光抗体”复合物；样本中的GP73浓度与复合物荧光强度成正比，根据设定的标准曲线，荧光免疫检测仪将荧光信号值转换成样本中GP73浓度。

显然，以上所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，附图中给出了本申请的较佳实施例，但并不限制本申请的专利范围。本申请可以以许多不同的形式来实现，相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容的理解更加透彻全面。尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来而言，其依然可以对前述各具体实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等效替换。凡是利用本申请说明书及附图内容所做的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本申请专利保护范围之内。