一种纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及骨组织修复以及有机/无机材料复合技术领域，具体涉及一种纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的制备方法以及采用该制备方法制备得到的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

背景技术

丝素蛋白在骨修复材料中的应用广泛，但现在依旧存在着丝素蛋白纤维直接加工受限、复合材料加工条件苛刻或是成本过高等问题。基于丝素蛋白的骨修复材料的应用还需要更深入的研究，采用纳米粒子增强丝素蛋白材料是一个潜在的可行方向。二氧化硅颗粒能与丝素蛋白相互结合进而改善丝素蛋白材料的力学性能，同时还能拥有一定的生物相容性。

如CN201910269969.1的中国发明专利公开了一种纳米二氧化硅/高分子材料引导骨再生复合多孔膜的制备方法，制备所得的复合材料具有机械强度高，生物相容性好，降解速度适中的特点，可应用于组织修复。又如CN202110359379.5的中国发明专利公开了一种丝素蛋白/二氧化硅复合材料及其制备方法，使用正硅酸四乙酯和乙醇来制备丝素蛋白/二氧化硅复合材料，结果显示复合材料力学性能优秀，生物相容性良好。但是该专利通过共混的方法将二氧化硅与丝素蛋白复合时，二氧化硅用量较大，比例占到复合材料的三成甚至四成左右，这是因为纳米二氧化硅团聚，降低了有机无机界面作用力，造成复合性能下降带来的。又如CN202111008612.1的中国发明专利公开了一种蠕虫形氧化硅磨粒及其制备方法和应用，使用正硅酸乙酯和L-赖氨酸来制备蠕虫形二氧化硅磨粒，并在其中加入氯化钙以控制团聚，获得稳定性较好的磨料。但是氯化钙的加入，对于生物材料的应用受到了限制；而蠕虫形氧化硅磨粒也缺乏活性基团，难以用于材料的增强，且制备得到的蠕虫形二氧化硅磨粒粒径较大。因此有必要寻求一种更好的用于增强丝素蛋白材料的方法。考虑到使用时的条件，丝素蛋白复合材料尤其需要增强其湿态下的强度。

发明内容

有鉴于此，为了克服现有技术的缺陷以及达到上述目的，本发明的目的是提供一种纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的制备方法，通过制备小粒径的纳米二氧化硅并加入硅烷偶联剂以增强纳米二氧化硅与丝素蛋白的结合，获得湿态下力学性能优异的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

为达到上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料，包括如下步骤：分别制备纳米二氧化硅溶胶和丝素蛋白溶液，将丝素蛋白溶液与纳米二氧化硅溶胶、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)混合均匀，并形成凝胶，清洗、陈化、干燥后得到纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

根据本发明的一些优选实施方面，所述纳米二氧化硅溶胶通过如下方法制备得到：将去离子水与正硅酸乙酯混合均匀后加入赖氨酸，搅拌溶解，得到混合溶液，调节混合溶液的pH值为8.5～9.5；将混合溶液升温至50～70℃，继续搅拌2～5h，直至混合溶液不再发生分层，调节体系pH值为6.5～7.5，并采用超声波分散；室温下陈化，得到所述纳米二氧化硅溶胶。

根据本发明的一些优选实施方面，所述纳米二氧化硅溶胶中的粒径为10～15nm，粒径小，粒径分布较窄。

根据本发明的一些优选实施方面，正硅酸乙酯与赖氨酸的质量比为10～20:0.3～0.6，赖氨酸的用量比较高，可以提升赖氨酸在纳米二氧化硅表面的含量，以用于在制备复合材料时，提升二氧化硅与丝素蛋白之间的结合力。

根据本发明的一些优选实施方面，去离子水与正硅酸乙酯的质量比为1～2:0.1～0.2。

根据本发明的一些优选实施方面，所述赖氨酸为选自L-赖氨酸、D-赖氨酸、DL-赖氨酸、羟赖氨酸中的一种或多种。

根据本发明的一些优选实施方面，添加赖氨酸搅拌溶解后，使用0.1～1摩尔/升的氢氧化钠溶液调节体系的pH值。

根据本发明的一些优选实施方面，超声波分散前，采用0.1～1摩尔/升的盐酸调节体系的pH值。

根据本发明的一些优选实施方面，所述超声波分散采用的超声波功率为100～300W，处理时间为5～30分钟。

根据本发明的一些优选实施方面，所述丝素蛋白溶液通过如下方法制备得到：在去离子水中加入碳酸钠和/或碳酸氢钠，调整溶液的pH值为9.0～9.5，加入家蚕茧壳保持溶液微沸30～35分钟并通过搅拌保持茧壳的均匀分布，取出茧壳后使用去离子水洗去表面残余丝胶。将脱胶完毕的蚕丝烘干、剪碎并溶于饱和溴化锂溶液中，进行透析处理后得到丝素蛋白溶液。

根据本发明的一些优选实施方面，重复2～3次脱胶操作后，将脱胶茧壳置于55～60℃烘箱中干燥获得脱胶蚕丝。

根据本发明的一些优选实施方面，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为3～7％。

根据本发明的一些优选实施方面，制备纳米增强材料的具体步骤为：将丝素蛋白溶液、所述纳米二氧化硅溶胶、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷混合均匀，形成凝胶后置于60～80℃下3～6小时，充分反应后去除未反应完全的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，陈化并干燥，得到所述纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

根据本发明的一些优选实施方面，所述纳米二氧化硅溶胶的二氧化硅与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为1～7:100；所述γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为0.5～3:10。

根据本发明的一些优选实施方面，形成凝胶的具体步骤为：将纳米二氧化硅溶胶滴加入丝素蛋白溶液中，混合均匀，向混合液中滴加γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，超声振荡处理后，浇注入模具中，置于35-45℃的恒温水浴振荡箱中2～12小时直至形成凝胶。将纳米二氧化硅溶胶与丝素蛋白溶液混合好之后再加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，防止快速加入造成局部交联过度，形成一团凝胶，难以分散均匀。

根据本发明的一些优选实施方面，去除未反应完全的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，具体为：凝胶脱模后使用去离子水以浴比1～3:100浸泡，持续3～4天且每2～3小时换水一次。

根据本发明的一些优选实施方面，所述凝胶的陈化为在温度40～60℃、相对湿度75～90％的恒温恒湿条件下进行3～7天。

根据本发明的一些优选实施方面，所述干燥的温度为60～80℃，时间为1～5天。

在本申请的一些具体实施例中，纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的制备方法，以家蚕茧壳为原料，具体包括以下步骤：

(1)纳米二氧化硅的制备

将去离子水与正硅酸乙酯共混后搅拌均匀，加入赖氨酸，搅拌溶解后，采用氢氧化钠溶液调节体系的pH值为8.5～9.5。将混合溶液升温至50～70℃，继续搅拌2～5小时，直至混合液不再发生分层，采用盐酸调节体系的pH值为6.5～7.5，然后采用超声波分散。室温下陈化2～3天，得到纳米二氧化硅溶胶。

(2)丝素蛋白溶液的制备

在去离子水中加入0.01摩尔/升的碳酸钠和碳酸氢钠，调整溶液pH值为9.0～9.5，加入家蚕茧壳保持溶液微沸30～35分钟并通过搅拌保持茧壳的均匀分布，取出茧壳后使用去离子水洗去表面残余丝胶。重复脱胶3次后，将脱胶完毕的蚕丝烘干、剪碎并溶于饱和溴化锂溶液中，进行透析处理后得到丝素蛋白溶液。

(3)纳米增强材料的制备

按照纳米二氧化硅溶胶中的二氧化硅与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为1～7:100，将纳米二氧化硅溶胶滴加入丝素蛋白水溶液，使用旋涡混合器使液体混匀。按照KH560与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为0.5～3:10向混合液中滴加KH560。之后在100～300W功率下超声振荡处理10～30分钟，混合均匀后浇注入模具中，置于35-45℃恒温水浴振荡箱中2～12小时至凝胶，之后放置于60～80℃烘箱中3～6小时促进KH560环氧基与丝素蛋白活性基团的反应。

之后，将凝胶脱模后，并使用去离子水以浴比1～3:100浸泡，以去除未反应完全的剩余KH560和水解产物乙醇，持续3～4天且每2～3小时换水一次。然后放置于温度40～60℃、相对湿度75～90％的恒温恒湿箱中3～7天缓慢干燥(陈化)。然后提高温度至60～80℃继续在烘箱中干燥1～5天，最终获得纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

本发明还提供了一种采用如上所述的制备方法制备得到的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料，其中，纳米二氧化硅的质量占比为0.5～7％，KH560的质量占比为5～30％，丝素蛋白的质量占比为70～95％。

本发明的技术原理为：通过赖氨酸催化正硅酸乙酯来制备纳米二氧化硅溶胶，生成的纳米二氧化硅颗粒粒径小(低于15nm)。赖氨酸含有较多的氨基，具有一定的碱性，可以催化正硅酸乙酯的水解。另外，赖氨酸带有正电荷，正硅酸乙酯水解后形成的二氧化硅溶胶带有部分的负电荷，可以以赖氨酸为成核的核心，形成纳米颗粒。由于赖氨酸的浓度较高，成核数量较多，所形成的纳米数量大大提高，以至于降低了纳米颗粒后续长大的空间，可以获得较小粒径(低于15nm)的纳米二氧化硅。这种以赖氨酸为模板形成的带有部分的赖氨酸的纳米二氧化硅，与丝素蛋白结合的时候能够产生比较大的结合力。包括赖氨酸的正电荷与丝素蛋白形成的电荷作用力以及纳米二氧化硅与丝素蛋白之间形成的氢键等作用力。这些作用力有效的促使丝素蛋白形成强交联结构，进而达到了干态增强效果。添加环氧基硅烷偶联剂KH560，作为有机/无机的界面增强剂，提高了复合材料中有机丝素蛋白与无机纳米二氧化硅颗粒的结合作用。其中的环氧基团，可以与丝素蛋白上的活泼基团氨基、羟基、酚羟基、羧基反应，而另一头的硅氧烷可以与纳米二氧化硅上的羟基反应，使纳米二氧化硅与丝素蛋白之间形成更多的共价键交联。而纳米二氧化硅中的赖氨酸，可以催化促进硅烷偶联剂中的活性环氧基团与丝素蛋白活性基团之间的反应。另外随着丝素蛋白上的活泼基团反应后降低含量，也降低了复合材料的吸水率，增强了材料在湿态环境下的压缩性能。

由于采用了以上的技术方案，本发明与现有技术相比具有如下的有益之处：本发明的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料，通过赖氨酸催化反应生成粒径很小的纳米二氧化硅颗粒，进入丝素蛋白材料的薄弱环节处，并加入硅烷偶联剂KH560增强纳米二氧化硅颗粒与丝素蛋白的连接，进而实现丝素蛋白材料的增强效果。复合材料在外力作用形变过程中，刚性纳米二氧化硅填料可吸收部分能量。另一方面，通过纳米二氧化硅粒子表面的大量羟基与丝素蛋白间的氢键作用，也增强了大分子链间的相互作用，实现材料的力学强度增加。特别是实现了湿态下的增强，使复合材料能够应用于生物体的湿态环境中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2-5和对比例1-3中制备得到的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的形貌照片；

图2为实施例2及对比例4、5制备得到的纳米二氧化硅材料的溶胶粒径尺寸图；

图3为实施例2-5及对比例1-3制备得到的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的干态压缩强度对比图；

图4为实施例2-5及对比例1-3制备得到的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的湿态压缩强度对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本实施例的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的制备方法，通过特殊方法制备得到粒径小的纳米二氧化硅，减少团聚和降低纳米二氧化硅的用量；同时，通过添加界面偶联剂，增强复合材料有机-无机界面之间的结合力，进一步减少纳米二氧化硅用量，并显著提高丝素蛋白复合材料的力学性能。

具体的，本实施例以家蚕茧壳为原料，制备方法包括以下步骤：

步骤(1)、制备纳米二氧化硅

将去离子水与正硅酸乙酯共混后搅拌均匀，加入赖氨酸粉末，搅拌溶解后，使用0.1～1摩尔/升的氢氧化钠溶液调节体系的pH值为8.5～9.5。将混合溶液升温至50～70℃，继续搅拌2～5小时，直至混合液不再发生分层，采用0.1～1摩尔/升的盐酸调节体系的pH值为6.5～7.5，然后采用超声波分散。室温下陈化2～3天，得到纳米二氧化硅溶胶。

其中，去离子水与正硅酸乙酯的质量比为1～2:0.1～0.2；正硅酸乙酯与赖氨酸的质量比为10～20:0.3～0.6。赖氨酸为选自L-赖氨酸、D-赖氨酸、DL-赖氨酸、羟赖氨酸中的一种或多种。超声波分散的超声波功率为100～300W，时间为5～30分钟。

步骤(2)、制备丝素蛋白溶液

在去离子水中加入0.01摩尔/升的碳酸钠和碳酸氢钠，调整溶液pH值为9.0～9.5，加入茧壳保持溶液微沸30～35分钟并通过搅拌保持茧壳的均匀分布，取出茧壳后使用去离子水洗去表面残余丝胶。重复2～3次脱胶操作后，将脱胶茧壳置于55～60℃烘箱中干燥10～24小时获得脱胶蚕丝。将脱胶完毕的蚕丝烘干、剪碎并溶于饱和溴化锂溶液中，进行透析处理后得到丝素蛋白溶液；

步骤(3)、制备添加环氧基硅烷偶联剂的纳米增强材料

按照纳米二氧化硅溶胶中的二氧化硅与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为1～7:100，将纳米二氧化硅溶胶滴加入丝素蛋白水溶液，使用旋涡混合器使液体混匀。按照KH560与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为0.5～3:10向混合液中滴加KH560。之后在100～300W功率下超声振荡处理10～30分钟，混合均匀后浇注入模具中，置于35-45℃恒温水浴振荡箱中2～12小时至凝胶，之后放置于60～80℃烘箱中3～6小时促进KH560环氧基与丝素蛋白活性基团的进一步的反应。

之后，将凝胶脱模后，并使用去离子水以浴比1～3:100浸泡，以去除未反应完全的剩余KH560和水解产物乙醇，持续3～4天且每2～3小时换水一次。然后放置于温度40～60℃、相对湿度75～90％的恒温恒湿箱中3～7天缓慢干燥(陈化)。然后提高温度至60～80℃继续在烘箱中干燥1～5天，最终获得纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。其中，纳米二氧化硅的质量占比为0.5～7％，KH560的质量占比为5～30％，丝素蛋白的质量占比为70～95％。

优选地，纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料中纳米二氧化硅、硅烷偶联剂、丝素蛋白之间的质量比为5：20：100。

实施例1

本实施例的丝素蛋白溶液的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤(1)、选取家蚕茧壳，除去蚕蛹及其他杂质。使用天平称取80克家蚕茧壳。量取4升去离子水使用电磁炉煮沸，加入1克碳酸钠和3克碳酸氢钠调整溶液pH值为9.5。加入茧壳保持溶液微沸30分钟并通过搅拌保持茧壳的均匀分布，取出茧壳后使用去离子水搓洗，除去表面残余丝胶。重复三次上述操作后将脱胶茧壳置于60℃烘箱干燥24小时获得脱胶蚕丝。

步骤(2)、取上述干燥脱胶蚕丝剪碎，以15/100的质量比溶于9.3摩尔/升的溴化锂水溶液，溶解条件为温度65℃水浴加热、磁力搅拌器温和搅拌作用下1小时左右。溶解后放置于室温下等待丝素/溴化锂溶液冷却，灌装入截留分子量为8～14kDa的透析袋中，使用去离子水透析3天，期间每2小时更换透析用水。过滤后离心去除杂质，最终获得丝素蛋白水溶液。

实施例2

本实施例的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤(1)、纳米二氧化硅的制备

称取100克去离子水、10克正硅酸乙酯，使用旋涡混合器共混制得混合溶液；添加300毫克的L-赖氨酸粉末，溶解后使用0.4摩尔/升的氢氧化钠溶液调节体系的pH值为8.5。

在磁力搅拌器转速600r/min，70℃水浴加热条件下反应5小时，直至混合液不再发生分层，使用0.5摩尔/升的盐酸调整体系的pH值为6.5，使用超声波细胞破碎仪分散，功率100W，震荡30分钟。然后在室温条件下陈化2天，获得L-赖氨酸催化的纳米二氧化硅溶胶。

步骤(2)、采用实施例1中的方法制备得到丝素蛋白溶液。

步骤(3)、添加环氧基硅烷偶联剂的纳米增强材料的制备

按照纳米二氧化硅溶胶的二氧化硅与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为1:100，将纳米二氧化硅溶胶滴加入丝素蛋白水溶液，使用旋涡混合器使液体混匀。

按照γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为5：100向混合液中滴加KH560，100W功率下超声振荡处理30分钟使其均匀混合。混合均匀后浇注入模具中，置于37℃恒温水浴振荡箱中2小时至凝胶。混合液凝胶后取出，放置于60℃烘箱中6小时促进KH560环氧基与丝素蛋白氨基的反应。

之后将凝胶脱模，并使用去离子水以浴比1/100浸泡去除未反应完全的剩余KH560和水解产物乙醇，持续3天且每2小时换水一次。之后先在40℃和90％相对湿度的恒温恒湿箱中缓慢陈化干燥7天，再置于60℃烘箱中干燥处理5天，得到纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

实施例3

本实施例的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤(1)、纳米二氧化硅溶胶的制备

称取120克去离子水、12克正硅酸乙酯，使用旋涡混合器共混制得混合溶液；添加350毫克的D-赖氨酸粉末，溶解后使用0.5摩尔/升的氢氧化钠溶液调节体系的pH值为8.8。

在磁力搅拌器转速650r/min，65℃水浴加热条件下反应4小时，直至混合液不再发生分层，加入0.6摩尔/升的盐酸调整体系的pH值为6.7，使用超声波细胞破碎仪分散，功率150W，震荡25分钟。然后在室温条件下陈化2天，获得D-赖氨酸催化的纳米二氧化硅溶胶。

步骤(2)、采用实施例1中的方法制备得到丝素蛋白溶液。

步骤(3)、添加环氧基硅烷偶联剂的纳米增强材料的制备

按照纳米二氧化硅溶胶的二氧化硅与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为5:100，将纳米二氧化硅溶胶滴加入丝素蛋白水溶液，使用旋涡混合器使液体混匀。

按照γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为10：100向混合液中滴加KH560，150W功率下超声振荡处理25分钟使其均匀混合。混合均匀后浇注入模具中，置于38℃恒温水浴振荡箱中6小时至凝胶。混合液凝胶后取出，放置于70℃烘箱中5小时促进KH560环氧基与丝素蛋白氨基的反应。

之后将凝胶脱模，并使用去离子水以浴比2/100浸泡去除未反应完全的剩余KH560和水解产物乙醇，持续3天且每2小时换水一次。之后先在45℃和85％相对湿度的恒温恒湿箱中缓慢陈化干燥6天，再置于65℃烘箱中干燥处理4天，最终获得纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

实施例4

本实施例的纳米二氧化硅增强丝素蛋白复合材料的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤(1)、纳米二氧化硅溶胶的制备

称取180克去离子水、18克正硅酸乙酯，使用旋涡混合器共混制得混合溶液；添加500毫克的羟赖氨酸粉末，溶解后使用0.7摩尔/升的氢氧化钠溶液调节pH值为9.2。

在磁力搅拌器转速750r/min，55℃水浴加热条件下反应2小时，直至混合液不再发生分层，加入0.8摩尔/升的盐酸调整体系的pH值为7.2，使用超声波细胞破碎仪分散，功率250W，震荡15分钟。然后在室温条件下陈化3天，获得羟赖氨酸催化的纳米二氧化硅溶胶。

步骤(2)、采用实施例1中的方法制备得到丝素蛋白溶液。

步骤(3)、添加环氧基硅烷偶联剂的纳米增强材料的制备

按照纳米二氧化硅溶胶的二氧化硅与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为5:100，将纳米二氧化硅溶胶滴加入丝素蛋白水溶液，使用旋涡混合器使液体混匀。

按照γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为20：100向混合液中滴加KH560，250W功率下超声振荡处理15分钟使其均匀混合。混合均匀后浇注入模具中，置于39℃恒温水浴振荡箱中9小时至凝胶。混合液凝胶后取出，放置于75℃烘箱中4小时促进KH560环氧基与丝素蛋白氨基的反应。

之后将凝胶脱模，并使用去离子水以浴比2.5/100浸泡去除未反应完全的剩余KH560和水解产物乙醇，持续4天且每3小时换水一次。之后先在50℃和80％相对湿度的恒温恒湿箱中缓慢陈化干燥4天，再置于70℃烘箱中干燥处理3天，最终获得纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

实施例5

本实施例的纳米二氧化硅增强丝素蛋白复合材料的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤(1)、纳米二氧化硅溶胶的制备

称取200克去离子水、20克正硅酸乙酯，使用旋涡混合器共混制得混合溶液；添加600毫克的L-赖氨酸粉末，溶解后使用0.8摩尔/升的氢氧化钠溶液调节pH值为9.5。

在磁力搅拌器转速800r/min，50℃水浴加热条件下反应2小时，直至混合液不再发生分层，加入0.9摩尔/升的盐酸调整体系的pH值为7.5，使用超声波细胞破碎仪分散，功率300W，震荡10分钟，然后在室温条件下陈化3天，获得L-赖氨酸催化的纳米二氧化硅溶胶。

步骤(2)、采用实施例1中的方法制备得到丝素蛋白溶液。

步骤(3)、添加环氧基硅烷偶联剂的纳米增强材料的制备

按照纳米二氧化硅溶胶的二氧化硅与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为5:100，将纳米二氧化硅溶胶滴加入丝素蛋白水溶液，使用旋涡混合器使液体混匀。

按照γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为30：100向混合液中滴加KH560，300W功率下超声振荡处理10分钟使其均匀混合。混合均匀后浇注入模具中，置于40℃恒温水浴振荡箱中12小时至凝胶。混合液凝胶后取出，放置于80℃烘箱中3小时促进KH560环氧基与丝素蛋白氨基的反应。

之后将凝胶脱模，并使用去离子水以浴比3/100浸泡去除未反应完全的剩余KH560和水解产物乙醇，持续4天且每3小时换水一次。之后先在60℃和75％相对湿度的恒温恒湿箱中缓慢陈化干燥3天，再置于80℃烘箱中干燥处理2天，最终获得纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。

对比例1

本对比例为不添加纳米二氧化硅的纯丝素蛋白材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)、丝素蛋白溶液的制备：采用实施例1中的方法制备得到丝素蛋白溶液。

步骤(2)、将乙醇溶液滴加入丝素蛋白水溶液，使用旋涡混合器使液体混匀。将混合液浇注入模具中，置于40℃烘箱中1小时，直至形成凝胶。取出凝胶使用去离子水清洗后，放置于温度40℃、相对湿度75％的恒温恒湿箱中5天缓慢干燥得到复合材料。将复合材料置于60℃烘箱中干燥2天，得到纯丝素蛋白材料。

对比例2

本对比例为不添加KH560的纳米二氧化硅/丝素蛋白材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)、丝素蛋白溶液的制备：采用实施例1中的方法制备得到丝素蛋白溶液。

步骤(2)、纳米二氧化硅溶胶的制备：采用实施例2中步骤(1)的方法制备得到纳米二氧化硅溶胶。

步骤(3)、按照纳米二氧化硅溶胶中的二氧化硅与丝素蛋白溶液中丝素蛋白之间的质量比为5:100，将纳米二氧化硅溶胶滴加入丝素蛋白水溶液，使用旋涡混合器使液体混匀。将混合液置于40℃烘箱中直至凝胶化。取出凝胶使用去离子水清洗后，放置于温度40℃、相对湿度75％的恒温恒湿箱中5天缓慢干燥得到复合材料。将复合材料置于60℃烘箱中干燥2天，得到纳米二氧化硅/丝素蛋白材料。

对比例3

本对比例为不添加纳米二氧化硅的硅烷偶联剂/丝素蛋白材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)、丝素蛋白溶液的制备：采用实施例1中的方法制备得到丝素蛋白溶液。

步骤(2)、按照质量比KH560/丝素蛋白为20/100向丝素蛋白溶液中滴加KH560，使用超声振荡混合均匀后置于37℃恒温水浴振荡箱中12小时至凝胶。混合液凝胶后取出，放置于60℃烘箱中3小时促进KH560环氧基与丝素蛋白氨基的反应。

步骤(3)、凝胶脱模后使用去离子水以浴比1/100浸泡去除未反应完全的剩余KH560和水解产物乙醇，持续3天且每2小时换水一次。先在40℃和75％相对湿度的恒温恒湿箱中缓慢陈化干燥5天，再置于60℃烘箱中干燥处理1天，最终获得硅烷偶联剂/丝素蛋白材料。

对比例4

本对比例的纳米二氧化硅溶胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)、取100克去离子水、10克正硅酸乙酯，使用旋涡混合器共混制得混合溶液。

步骤(2)、使用0.1摩尔/升的盐酸溶液调节混合液体系pH值为2.0。

步骤(3)、在磁力搅拌器转速600r/min，60℃水浴加热条件下反应，直至混合液不再发生分层，过滤后在室温条件下陈化2天，获得盐酸催化的纳米二氧化硅溶胶。

对比例5

本对比例的纳米二氧化硅溶胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)、取100克去离子水、10克正硅酸乙酯，使用旋涡混合器共混制得混合溶液。

步骤(2)、使用0.1摩尔/升的氨水调节体系pH值为9.0；

步骤(3)、在磁力搅拌器转速600r/min，60℃水浴加热条件下反应，直至混合液不再发生分层，过滤后在室温条件下陈化2天，获得氨水催化的纳米二氧化硅溶胶。

性能对比与分析

1.对实施例2及对比例4、5制备得到的纳米二氧化硅材料的溶胶粒径进行测试和分析，如图2所示。

由图2的粒径分布可知：对比例4中盐酸催化的正硅酸乙酯水解反应制备获得的纳米二氧化硅颗粒分布主要在50～100nm和500～1000nm，平均粒径尺寸分布差距较大且存在较多1000nm以上的团聚，整体分布不均匀且粒径尺寸较大。因此盐酸催化制备的纳米二氧化硅易发生团聚，可提供的表面羟基数量较少，纳米尺寸效应的应用受限，无法用于后续丝素蛋白的纳米增强填料。

对比例5中氨水催化的溶胶主要分布于34nm左右，无明显团聚。氨水催化形成的纳米二氧化硅分布较为均匀，团聚现象不太严重。但是其粒径仍然较大，与丝素蛋白的结合力不足，加入丝素蛋白形成的复合材料的力学性能提高不太理想。

相较于盐酸和氨水催化方法，实施例2采用L-赖氨酸催化制备获得的纳米二氧化硅溶胶尺寸仅有12nm左右，粒径分布很窄。考虑到赖氨酸可以进一步增强纳米颗粒与丝素蛋白的结合力，赖氨酸催化形成的纳米二氧化硅有作为丝素蛋白纳米增强填料的潜力。

2.复合材料的形貌

图1是制备所得的纯丝素材料和复合材料的照片，相较于纯丝素蛋白材料，添加了硅烷偶联剂复合材料的成型良好，形状呈均匀的柱状固体。

3.纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的力学性能

取各实施例以及对比例制备得到的复合材料，放置于60℃烘箱中平衡3h后取出，使用万能试验机测试，获得干燥状态下的压缩强度。

由图3的干态压缩强度可以看出，相比于纯丝素蛋白材料，纳米二氧化硅以及硅烷偶联剂KH560的添加，能显著提升丝素蛋白材料干态下的压缩强度。对比例2、对比例3以及各实施例的干态压缩强度都有了显著的增加。其中，各实施例由于添加了硅烷偶联剂，压缩强度与对比例相比有了更多的增加。从图3中可以看到，纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的干态压缩强度，随着KH560的质量比增加而提升。当硅烷偶联剂/丝素蛋白的质量比达到20/100时，干态压缩强度由二氧化硅/丝素蛋白复合材料的44.6MPa提升到72.3MPa。原因可能是KH560中的环氧基与丝素蛋白分子链上的氨基或是侧链残基反应形成共价交联，增强了丝素蛋白大分子链间的相互作用，提高了交联度，增强了压缩性能。而进一步提高质量比至30/100后，材料的力学性能无显著改变。原因可能是丝素蛋白提供的反应交联点接近完全反应，过量的KH560不能进一步提升材料大分子链间的交联作用，不能进一步提升材料的干态压缩性能。

取各实施例以及对比例制备的复合材料，材料以浴比1/100置于pH＝7.4的PBS缓冲液中，放置于恒温水浴振荡箱中，在温度37℃条件下浸泡48h后取出，用吸水纸擦干材料外表的水分，使用万能试验机测试，获得湿态下的压缩强度。

由图4的湿态下力学性能测试结果可以看到，KH560的添加可显著提升丝素蛋白复合材料的湿态压缩强度。对比例3比对比例1的湿态压缩强度有了显著的提升。而仅仅采用纳米二氧化硅增强，不添加硅烷偶联剂的对比例2的湿态压缩强度，与纯丝素蛋白相比没有显著性差异。而实施例中，纳米二氧化硅以及硅烷偶联剂两个都添加的，不仅干态强度获得了提升，湿态下的强度也获得了提升。根据图4的湿态压缩强度，硅烷偶联剂/丝素蛋白的质量比大于10/100的硅烷偶联剂复合材料的湿态压缩强度显著提升。而质量比提高至20/100-30/100的复合材料湿态压缩强度相较于二氧化硅/丝素蛋白材料由9.9MPa提升至67.1MPa左右，显著改善了原本丝素蛋白材料湿态力学性能大幅下降的缺陷。其原因可能是KH560的疏水性降低了复合材料在湿态环境下的吸水率，水分子进入大分子之间的过程受到限制，减少了水分子的作用导致的丝素蛋白大分子链的滑移，改善了材料的湿态力学性能。复合材料在KH560添加量达到KH560/丝素蛋白质量比为20/100时可实现材料的力学性能的显著增强效果，而进一步提高KH560质量比至30/100的增强效果不显著。

由以上测试结果表明，采用本发明的方法制备得到的一种纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料，可以显著地提高纯丝素蛋白材料的干态和湿态下的压缩强度。

本发明的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料的制备方法，包括以下步骤：(1)选用赖氨酸催化正硅酸乙酯混合溶液制备纳米二氧化硅溶胶；(2)将家蚕茧壳浸入碳酸钠和碳酸氢钠复配的溶液中进行脱胶处理；(3)将脱胶完毕的蚕丝烘干、剪碎并溶于溴化锂溶液中，进行透析处理后得到丝素蛋白溶液；(4)丝素蛋白溶液与纳米二氧化硅溶胶混合制得纳米二氧化硅/丝素蛋白混合液；(5)向纳米二氧化硅/丝素蛋白混合液中滴加γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH560)制得纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料。上述制备方法简单且可批量制备，制备的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料力学性能较纯丝素蛋白材料有大幅提升。与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

1.本发明提供的纳米二氧化硅/硅烷偶联剂/丝素蛋白复合材料，以溶液共混干燥的方法获得，操作简单，材料易得、成本低，适于工业化量产。

2.本发明为了解决纳米颗粒的极高表面能易产生发生颗粒间的团聚，导致最终与材料复合时的纳米颗粒粉体材料分布不均匀、比表面积减小等不利于材料增强效果的问题。选用正硅酸乙酯作为硅源，高浓度赖氨酸作为催化剂，催化制备纳米二氧化硅溶胶，得到的纳米二氧化硅颗粒粒径小，分布窄。由于粒径的降低以及团聚的减少，纳米二氧化硅的用量可以大幅下降，在用量极低时就能够实现力学性能的显著增强。并加入硅烷偶联剂KH560，实现二氧化硅颗粒在复合材料中的均匀分散并降低复合材料的亲水性能，降低材料的吸水率，改善了材料的湿态力学性能。

3.本发明通过赖氨酸催化反应生成粒径很小(低于15nm)的纳米二氧化硅颗粒，进入丝素蛋白材料的薄弱环节处，并加入硅烷偶联剂KH560增强纳米二氧化硅颗粒与丝素蛋白的连接，进而实现丝素蛋白材料的增强效果。复合材料在外力作用形变过程中，刚性纳米二氧化硅填料可吸收部分能量。另一方面，通过纳米二氧化硅粒子表面的大量羟基与丝素蛋白间的氢键作用，也增强了大分子链间的相互作用，实现材料的力学强度增加。特别是实现了湿态下的增强，使复合材料能够应用于生物体的湿态环境中。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。