一种用于阴道分泌物湿片荧光染色的微生物免疫显色试剂

技术领域

本发明属于荧光染色液技术领域，具体地，涉及一种用于阴道分泌物湿片荧光染色的微生物免疫显色试剂，尤其是一种微生物免疫显色试剂及其制备方法和应用。

背景技术

传统的检测方法有湿片显微镜检查和革兰氏染色法。但是这两种方法都具有较大的局限性，湿片显微镜检测法对细菌形态较小的线索细胞，常不能准确观测细菌形态，观测真菌芽生孢子效果不佳，滴虫失活或死亡时形态与白细胞几乎一致难以分辨；革兰氏染色法相对准确，但比较耗时，且与每个检验工作者的操作手法有一定关系，不适宜在门诊检测推广。因此，快速且准确的阴道分泌物检测方法也得到越来越多的关注，尤其是门诊检验。

荧光染色法是新近开始的一种借助荧光染色液和荧光显微镜可直接镜检经荧光标记的染色方法，且可保存图片与报告一同发出以供临床直接查看，该方法除了在病理科得到一定使用，目前在抗核抗体的检验和真菌的检测方面也得到了一定的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种用于阴道分泌物湿片荧光染色的微生物免疫显色试剂，尤其是一种微生物免疫显色试剂及其制备方法和应用。

本发明的微生物免疫显色试剂，包括荧光染色剂、缓冲溶液、通透剂和抑菌剂。将微生物免疫显色试剂和微生物样本混合，即可在荧光显微镜下进行湿片检测。这一操作简单快速便捷，大大降低了操作人员的工作强度，可实现大量样本的快速检测。并且灵敏度和准确率高，适用范围广泛。

本发明的目的可以通过以下方案来实现：

本发明提供了一种用于阴道分泌物湿片荧光染色的微生物免疫显色试剂，包括荧光剂、抑菌剂、通透剂、缓冲溶液、水。

所述荧光剂包括吖啶橙和碘化丙啶，质量比为1：2～7：6。

所述抑菌剂包括ProClin

所述通透剂包括PVP-k90、PVA、吐温-20、Triton-100、S9中的一种或多种，优选为PVP-k90、PVA，更优选为PVP-k90。PVP-k90是一种具有良好生物稳定性的水溶性聚合物，其化学性稳定、毒性低、生物相容性良好。本发明是针对湿片染色，加入PVP-k90，细胞染色后细胞核和细胞质形态更清晰分明，效果要好于其它常规用于干法染色的通透剂。

所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲溶液中的一种或多种，优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。缓冲溶液的浓度为10-100mM。

所述荧光剂、抑菌剂、通透剂、缓冲溶液、水的用量比为1-18mg：250-2500μL：0.1-1g：2000-4000ml：1000-1600ml。

本发明还提供了一种所述微生物免疫显色试剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一、称量各组分，将荧光剂、抑菌剂、通透剂分别均匀溶解于水中，得到各组分原料溶液：荧光剂溶液、抑菌剂溶液、通透剂溶液；

步骤二、再将各组分原料溶液按量加入缓冲溶液中，即得微生物免疫显色试剂

步骤一中，所述荧光剂溶液中荧光剂的浓度为0.02-10mg/L。

步骤一中，所述抑菌剂溶液中抑菌剂浓度为0.1～10μL/mL。

步骤一中，所述通透剂溶液中通透剂的质量分数为0.01％～1％。

步骤二中，所述缓冲溶液浓度为10mM～100mM。

本发明还提供了一种所述微生物免疫显色试剂在湿片染色中的应用。

本发明还提供了一种所述微生物免疫显色试剂的使用方法，步骤如下方法一或方法二：

方法一、将样本和所述微生物免疫显色试剂混合，加入到湿片玻片上，置于显微镜下观察染色形态；

方法二、在盖玻片加入样本，再加入微生物免疫显色试剂，置于显微镜下观察染色形态。

方法一中，样本、微生物免疫显色试剂的体积比为1：4-6，优选为1：5。

方法一中，样本、微生物免疫显色试剂的体积比为1：0.5-2，优选为1：1。

样本包括阴道内分泌物样本、宫颈脱落细胞样本中的一种。

使用方法具体为：

将样本和微生物免疫显色试剂各自混匀后，取一200μL离心管，先加10μL样本，再加50μL微生物免疫显色试剂，吹打或者混匀后，取20μL混合后的溶液加入到湿片玻片(重庆天海医疗设备有限公司)，擦拭盖玻片上溢出的液体，置于显微镜下观察染色形态；(常用)

或，将样本和染色液各自混匀后，取一湿片玻片(重庆天海医疗设备有限公司)，在盖玻片右侧加入10μL样本，再加入10μL微生物免疫显色试剂，擦拭盖玻片上溢出的液体，置于显微镜下观察染色形态。(盖玻片左侧可能会有部分样本未染色或者存在漏检情况，边缘效应导致)

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)通过微生物免疫显色试剂对临床样本(如：阴道分泌物样本、宫颈脱落细胞样本)中的细胞和微生物进行特殊染色，解决了湿片漏检的问题，实现湿片荧光染色染出其细胞和微生物具体形态，有效区分上皮细胞、白细胞、红细胞、细菌、真菌和原虫等。

(2)通过采用本发明方法，制备出了一种微生物免疫显色试剂染色方法，微生物免疫显色试剂可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，能观察到阴道分泌物中脱落的上皮细胞，白细胞、细菌、真菌、滴虫及混合感染，提高病原菌检出率；使得检测不受滴虫失活的影响，降低漏诊率。

(3)该方法制备的产品为微生物免疫显色试剂，该发明在染色操作时无需将玻片上的稀释液烤干，变为涂片进行染色。该发明将稀释液和微生物免疫显色试剂液体混合反应，直接滴加到玻片上，然后在生物显微镜下进行湿片荧光染色观察，可以将脱落的上皮细胞，白细胞、红细胞、细菌、真菌、原虫的形态清晰得呈现在视野中，操作简单，一次染色用量极少，时间和金钱成本大大降低。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明微生物免疫显色试剂的工艺流程状态图；

图2为本发明实施例3的微生物免疫显色试剂对白假丝酵母标准菌株进行染色后的状态图；

图3为本发明实施例3的微生物免疫显色试剂对金黄色葡萄球菌标准菌株进行染色后的状态图；

图4为本发明实施例3的微生物免疫显色试剂对大肠埃希氏菌标准菌株进行染色后的状态图；

图5为本发明实施例3的微生物免疫显色试剂对阴道分泌物中线索细胞进行染色后的状态图；

图6为本发明实施例3的微生物免疫显色试剂对阴道分泌物中菌丝进行染色后的状态图；

图7为本发明实施例3的微生物免疫显色试剂对阴道分泌物中孢子进行染色后的状态图；

图8为本发明实施例3的微生物免疫显色试剂对阴道分泌物中上皮细胞进行染色后的状态图；

图9为实施例2染色液对VVC样本染色后形态图；

图10为实施例5染色液对VVC样本染色后形态图；

图11为实施例6染色液对VVC样本染色后形态图；

图12为实施例7染色液对VVC样本染色后形态图；

图13为实施例8染色液对VVC样本染色后形态图；

图14为实施例9染色液对VVC样本染色后形态图；

图15为实施例10使用0.01％PVP-k90，染色液对VVC样本染色后形态图；

图16为实施例11使用0.05％PVP-k90，染色液对VVC样本染色后形态图；

图17为实施例12使用0.01％PVA，染色液对VVC样本染色后形态图；

图18为通透剂为PVA时，单染形态图；

图19为通透剂为PVP-k90时，单染形态图；

图20为通透剂为Tx-100时，单染形态图；

图21为通透剂为吐温-20时，单染形态图；

图22为通透剂为S9时，单染形态图；

图23为不加通透剂时，单染形态图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种微生物免疫显色试剂，包括以下组分：荧光剂、通透剂、抑菌剂、缓冲液。制备方法如图1所示，包括：将荧光剂、抑菌剂、通透剂分别均匀溶解于水中，得到荧光剂溶液、抑菌剂溶液、通透剂溶液；加入准备好的缓冲液中，即得微生物免疫显色试剂，再经过内包装、外包装，即得最终产品。

实施例1

本实施例制备了一种微生物免疫显色试剂，包括以下组分：荧光剂、通透剂、抑菌剂、缓冲液。其中，荧光剂为吖啶橙和碘化丙啶，通透剂为PVP-k90，抑菌剂为ProClin

制备方法如下：

(1)将4.5mg吖啶橙溶于0.45L超纯水中(浓度为10mg/L)，7.5mg碘化丙啶溶于0.75L超纯水中(浓度为10mg/L)，将抑菌剂ProClin

(2)称取7.2g NaH

(3)将步骤(1)得到的原料溶液加入3800ml磷酸盐缓冲液(浓度为100mM)，即得微生物免疫显色试剂。

实施例2

本实施例制备了一种微生物免疫显色试剂，包括以下组分：荧光剂、通透剂、抑菌剂、缓冲液。其中，荧光剂为吖啶橙和碘化丙啶，通透剂为PVP-k90，抑菌剂为ProClin

制备方法如下：

(1)将4.5mg吖啶橙溶于0.45L超纯水中，7.5mg碘化丙啶溶于0.75L超纯水中，将抑菌剂ProClin

(2)称取12.11g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入1000mL超纯水溶解混匀，再用浓盐酸调pH至9.0±0.05(温度为25℃)，配制成100mM Tris(pH＝9.0)，取400mL100mM Tris(9.0)缓冲溶液，再加入3600mL超纯水混匀，得缓冲液。

(3)将步骤(1)得到的原料溶液先加入3750ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液(浓度为10mM)，即得微生物免疫显色试剂。

实施例3

本实施例制备了一种微生物免疫显色试剂，包括以下组分：荧光剂、通透剂、抑菌剂、缓冲液。其中，荧光剂为吖啶橙和碘化丙啶，抑菌剂为ProClin

制备方法如下：

(1)将4.5mg吖啶橙溶于0.45L超纯水中，7.5mg碘化丙啶溶于0.75L超纯水中，将抑菌剂ProClin

(2)称取12.11g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加入1000mL超纯水溶解混匀，再用浓盐酸调pH至9.0±0.05(温度为25℃)，配制成100mM Tris(pH＝9.0)，取400mL100mM Tris(9.0)缓冲溶液，再加入3600mL超纯水混匀，得缓冲液。

(3)将步骤(1)得到的原料溶液先加入3700ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液(浓度为10mM)，即得微生物免疫显色试剂。

实施例4

将不同样本和实施例3所制备的微生物免疫显色试剂各自混匀后，取一200μL离心管，先加10μL样本，再加50μL微生物免疫显色试剂，混匀后，取20μL混合后的溶液加入到湿片玻片(重庆天海医疗设备有限公司)，擦拭盖玻片上溢出的液体，置于显微镜下观察染色形态。并用Imageview软件截图并保存。

样本1为白假丝酵母标准菌株(BNCC 186382)，菌液和超纯水的体积比为3：17，所用微生物免疫显色试剂对白假丝酵母标准菌株进行染色后的状态图如图2所示；

样本2为金黄色葡萄球菌标准菌株(BNCC 186335)，菌液和超纯水的体积比为1：3，所用微生物免疫显色试剂对金黄色葡萄球菌标准菌株进行染色后的状态图如图3所示；

样本3为大肠埃希氏菌标准菌株(BNCC 185253)，菌液和超纯水的体积比为1：3，所用微生物免疫显色试剂对大肠埃希氏菌标准菌株进行染色后的状态图如图4所示；

样本4为BV样本(细菌性阴道病)，所用微生物免疫显色试剂对阴道分泌物中线索细胞进行染色后的状态图如图5所示；

样本5为VVC样本(外阴阴道假丝酵母菌病)所用微生物免疫显色试剂对阴道分泌物中菌丝进行染色后的状态图如图6所示；

样本6为VVC样本(外阴阴道假丝酵母菌病)，所用微生物免疫显色试剂对阴道分泌物中孢子进行染色后的状态图如图7所示；

样本7为阴性样本(正常人样本)，所用微生物免疫显色试剂对阴道分泌物中上皮细胞进行染色后的状态图如图8所示。

实施例5-12

本实施例微生物免疫显色试剂的组成、制备方法与实施例2基本相同，区别在于：使用不同的通透剂及用量，如下表所示。

将各实施例2、5-10的微生物免疫显色试剂按实施例4的方法观察染色形态。所用样本为：同一管VVC样本(外阴阴道假丝酵母菌病)。

实施例2染色液染色后形态如图9所示，使用PVP-90，孢子形态清晰，颜色明亮，杆菌形态清晰，细胞清晰，细胞核和细胞质形态、颜色区分明显，容易观察。

实施例5染色液染色后形态如图10所示，使用PVA，孢子形态清晰，颜色明亮，杆菌形态清晰，细胞整体形态清晰，细胞核颜色会覆盖细胞质，在观察形态时，细胞质绿色颜色会被细胞核橙色颜色遮挡，使细胞核具体形态不宜观察。

实施例6染色液染色后形态如图11所示，使用吐温-20，细胞形态较模糊。

实施例7染色液染色后形态如图12所示，使用TX-100(0.1％，质量/体积)，有背景，细胞形态较模糊。

实施例8染色液染色后形态如图13所示，使用TX-100(0.5％，质量/体积)，孢子颜色不明亮，有背景，细胞形态模糊程度较0.1％TX-100轻。

实施例9染色液染色后形态如图14所示，使用S9，孢子颜色明亮，形态清晰，杆菌形态清晰，细胞清晰程度不如PVP-k90、PVA.

综上：加入PVP-k90和PVA的染色液染色视野里细胞形态更清晰，孢子形态清晰明亮，无漏检。加入其他3种表活细胞形态较模糊。

将各实施例10-12的微生物免疫显色试剂按实施例4的方法观察染色形态。所用样本为：同一管VVC样本(外阴阴道假丝酵母菌病)。

实施例10使用0.01％PVP-k90，染色液染色后形态如图15所示。

实施例11使用0.05％PVP-k90，染色液染色后形态如图16所示。

实施例12使用0.01％PVA，染色液染色后形态如图17所示。

观察染色效果，低浓度PVP-k90、PVA配制染色液染色时，细胞染色更清楚；对比同浓度PVP-k90、PVA，染色液中0.01％PVP-k90，可以看到细胞质和细胞核形态、颜色最清晰，也没有背景色的影响，可以清楚看到细胞质和细胞核边界。

本发明还做了单染实验，只有染色剂Sybr Green I 50μL和缓冲液850μl，通透剂10mg。

通透剂为PVA时，单染形态如图18所示，形态不完整；

通透剂为PVP-k90时，单染形态如图19所示，形态完整；

通透剂为Tx-100时，单染形态如图20所示，形态不是特别完整，视野不是很清晰；

通透剂为吐温-20时，单染形态如图21所示，形态不完整，视野清晰；

通透剂为S9时，单染形态如图22所示，形态不完整，视野不清晰；

不加通透剂(对照组，只有缓冲液和染色剂)时，单染形态如图23所示，形态不完整，视野不清晰。

加入PVA、PVA-k90，单染酵母菌荧光淬灭时间大约为30s左右，跟之前超纯水做缓冲液比，荧光维持时间多了10s；TX-100、吐温-20、S9染色后荧光维持时间大概在20s，跟之前超纯水做缓冲液比无差异；对照组和实验组染色结果比较，对照组效果略微差一些。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。