重组耐高温延胡索酸酶催化制备L-苹果酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组耐高温延胡索酸酶催化制备L-苹果酸的方法。

背景技术

L-苹果酸是一种四碳二羧酸，具有一个不对称碳原子，因此有两个异构体，分别为D-苹果酸和L-苹果酸。L-苹果酸是一种普遍存在于所有生物体中的二羧酸，而D-苹果酸在自然界中很罕见。只有L-苹果酸在活细胞内具有代谢活性，D-苹果酸是非生理性的，因此美国FDA规定DL-苹果酸不可作为食品添加剂，而L-苹果酸是安全食品级产品。直接提取法可以得到高纯度的L-苹果酸，但是水果中存在的L-苹果酸很少，生产成本高且效率低下。化学合成法产生的是混合型DL-苹果酸，并不是L-苹果酸。通过微生物发酵生产L-苹果酸对环境的污染低，有利于生态友好型的可持续发展，但由于其发酵周期较长、发酵过程中需要加入中和剂、副产物较多导致下游分离提纯成本高等因素的限制，并没有被广泛应用于L-苹果酸的生产。通过酶催化法制备L-苹果酸，具有底物特异性高、催化效果好、产品纯度高、较化学合成法更绿色环保等优点，成为了目前工业化生产L-苹果酸最主要的方法。

发明内容

本发明的目的是开发一种平衡产率高、反应周期短、操作简单、反应条件温和的酶催化法制备L-苹果酸的工艺路线。

本发明采取的技术方案如下：

所述的重组耐高温延胡索酸酶催化制备L-苹果酸的方法，包括以下步骤：

1)克隆来自Thermus thermophilus HB8的延胡索酸酶基因FumCth，构建重组表达质粒pET28a-FumCth，并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)进行表达，获得延胡索酸酶重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth；

2)将延胡索酸酶重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth进行热处理；

3)配制富马酸溶液，并用氨水调pH至5.0-10.0；

4)将步骤3)所得富马酸溶液预热，然后将步骤2)热处理后的延胡索酸酶重组细胞与所述预热后的富马酸溶液混合均匀，进行酶催化反应，制备L-苹果酸。

进一步地，所述步骤2)中热处理温度为25℃-80℃，优选为60℃，热处理时间为25-35min，优选为30min。

进一步地，所述步骤3)中富马酸溶液的浓度为14％-22％，优选为20％。

进一步地，步骤4)中富马酸溶液的预热温度为反应温度，预热时间为25-35min，优选为30min。

进一步地，步骤4)中酶催化反应的温度为40℃-80℃，最优温度为60℃；酶催化反应的pH为5.0-10.0，优选pH为7.0-8.0。

进一步地，步骤4)中酶催化反应的反应液体系中，延胡索酸酶重组细胞的菌体量为0.3-1.0％，优选为0.5％。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明的方法操作简便，将重组延胡索酸酶细胞热处理即可将平衡产率(平衡产率＝生成率/转化率；生成率＝产物的实际量/转化完全时应生成的产物量

×100％；转化率＝(底物的初始量-底物的剩余量)/底物的初始量×100％)由现有的77％提高至94％，且将催化条件优化后，平衡产率高达100％；反应周期更短，60min即可完成酶催化反应，而现有的酿酒酵母表达延胡索酸酶进行酶催化反应生产L-苹果酸反应周期长达36h。该工艺路线具有工业化制备L-苹果酸的潜力。

附图说明

图1为本发明实施例1中E.coli BL21(DE3)中代谢L-苹果酸的杂酶失活温度的实验结果；

图2为本发明实施例2中E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth酶催化反应的转化率及生成率的实验结果；

图3为本发明实施例3中富马酸浓度对FumCth全细胞催化的影响结果；

图4为本发明实施例4中反应温度对FumCth全细胞催化的影响结果；

图5为本发明实施例5中反应pH对FumCth全细胞催化的影响结果；

图6为本发明实施例6中5L全细胞催化反应的转化率及生成率随时间的影响结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：E.coli BL21(DE3)菌株中代谢L-苹果酸的杂酶失活温度

取1gE.coli BL21(DE3)离心湿菌体，加5mL Tris-HCl(pH 8.0)破胞缓冲液混合均匀，分装成500μL/管，实验组分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃热处理30min，对照组不进行热处理。将实验组和对照组分别加入至5mL质量浓度18％的L-苹果酸溶液(氨水调pH至7.5)中，70℃，220rpm反应30min。E.coli BL21(DE3)中代谢L-苹果酸的杂酶失活温度的实验结果如图1所示，从图1中可以看出当温度超过60℃后L-苹果酸的消耗率几乎不再发生改变，这说明60℃以上时，E.coli BL21(DE3)中代谢L-苹果酸的杂酶几乎完全失活，优选热处理温度为60℃。

实施例2：E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth酶催化反应的转化率及生成率

克隆来自Thermus thermophilus HB8的延胡索酸酶基因FumCth，构建重组表达质粒pET28a-FumCth，并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)进行表达，离心，获得延胡索酸酶重组细胞E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth。

将E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth离心湿菌体加入适量的Tris-HCl(pH 8.0)破胞缓冲液，混合均匀，在60℃下热处理30min后，离心，得到湿菌体。配制质量浓度18％富马酸溶液，用氨水调pH至7.5，加入质量终浓度为0.5％的上述热处理后的离心湿菌体，70℃，220rpm反应30min。E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth酶催化反应的转化率及生成率的实验结果参见图2所示，由图2可知，热处理后酶催化反应还能顺利进行，因此目的蛋白FumCth未失活，但蛋白表达宿主E.coli BL21(DE3)中代谢L-苹果酸的杂酶失活，转化的L-苹果酸几乎能全部积累，平衡产率达到94％。

实施例3：富马酸浓度对FumCth全细胞催化的影响

酶活U定义为：在相应的反应条件下，1g菌体1min内催化生成产物的摩尔质量。酶活计算公式为

c：产物含量，g/L；

V：反应体积，L；

Mr：产物分子量，g/mol；

t：反应时间min；

m：投入菌体量，单g。

相对酶活即将该实验中酶活最高的一组数据设置为100％，计算公式为相对酶活＝实际酶活/最高酶活×100％。

配制不同浓度的富马酸溶液：140g/L、160g/L、180g/L、200g/L、220g/L，溶剂为水，用氨水调pH至7.0，反应体系为100mL，加入质量终浓度为0.5％的E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth离心湿菌体(0.5g)，将没有加入菌体的反应液置于70℃水浴锅中预热30min，所述菌体在使用前预先置于60℃水浴锅中热处理30min。在反应液中加入热处理后的菌体，机械搅拌50rpm，70℃精准反应15min后，立即取样，样品液按照1:1体积加入1MH

实施例4：温度对FumCth全细胞催化的影响

配置200g/L的富马酸溶液(氨水调pH至7.0)。反应体系为100mL，加入质量终浓度为0.5％的E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth离心湿菌体(0.5g)。将没有加入菌体的反应液分别置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的水浴锅中预热30min，所述菌体在使用前预先置于60℃水浴锅中热处理30min。在反应液中加入热处理后的菌体，用机械搅拌棒以50rpm转速搅拌，40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃分别精准反应15min后，立即取样，样品液按照1:1体积加入1M H

实施例5：pH对FumCth全细胞催化影响

配置200g/L的富马酸溶液(氨水调pH至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)。反应体系为100mL，加入质量终浓度为0.5％的E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth离心湿菌体(0.5g)，将没有加入菌体的反应液置于60℃的水浴锅中温育30min，所述菌体在使用前预先置于60℃水浴锅中热处理30min。在反应液中加入热处理后的菌体，用机械搅拌棒以50rpm转速搅拌，60℃精准反应15min后，立即取样，样品液按照1:1体积加入1M H

实施例6：5L全细胞催化反应

5L转化体系内含有富马酸1000g，氨水调pH至7.0，E.coli BL21(DE3)-pET28a-FumCth离心湿菌体25g，60℃，500rpm反应，30min取样一次，样品液按照1:1体积加入1MH

以上结果表明，高温延胡索酸酶催化合成L-苹果酸的工艺路线，与已被文献报道的酶催化法制备L-苹果酸相比具有操作简单、生产周期更短、副产物少和平衡产率高等优点。具备工业化生产L-苹果酸的潜力。

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。