一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种利用水稻内源序列抑制HPPD抑制剂敏感型1基因(HIS1)的植物表达载体和其构建方法和应用。

背景技术

转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系或恢复系是解决问题的有效手段之一。

β-三酮类除草剂(b-Triketone herbicides,bTHs)是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂，广泛应用于农业，可有效地防除多种阔叶杂草和禾本科杂草。用于稻田中杂草控制的bTH双环磺草酮(benzobicyclon,BBC)，对于可以对抗其他类型除草剂(包括磺酰脲)的稻杂草有明显功效(Kraehmer,et al."Herbicides as Weed Control Agents:Stateof the Art:I.Weed Control Research and Safener Technology:The Path to ModernAgriculture."Plant Physiology(2014).)。因此，β-三酮类除草剂常用于清除稻田的大多数阔叶类杂草和禾本科杂草，而研究表明，水稻对BBC的抗性候选基因为HIS1(HPPD抑制剂敏感型1)。HIS1编码351个氨基酸的Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型加氧酶蛋白，BBC敏感型品种的第Ⅳ外显子缺失28bp，造成功能缺失(Maeda,Hideo,et al."A rice gene that confersbroad-spectrum resistance to β-triketone herbicides."ence 365.6451(2019):393-396.)。若能培育出对β-三酮类除草剂显性敏感的水稻，将会在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效抑制HPPD抑制剂敏感型1基因(HIS1)表达的植物表达载体及其构建方法。

为达到以上目的，本发明提供了一种抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体，该载体含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。

其中，SEQ ID No.1所示的DNA片段为基于HIS1编码框的长度为243bp的正向DNA片段，SEQ ID No.3所示的DNA片段为基于HIS1编码框的长度为243bp的与SEQ ID No.1所示的DNA片段反向互补的DNA片段。SEQ ID No.2为来自水稻Zinc finger基因的内含子序列(Rice intron)。

SEQ ID No.1-3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发卡结构表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。

其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。

其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、Rubisco小亚基启动子、Cab启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动子。优选的，当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰HIS1基因表达的效果。

所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为NOS终止子。

所述RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子，CAMV 35S启动子或Actin启动子，优选的，当启动子为CAMV 35S启动子时，能够取得良好的驱动选择标记基因在植物中超量表达的效果。所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子，优选为NOS终止子。

所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、荧光标记基因(如荧光蛋白基因)、抗生素标记基因(可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因)、除草剂筛选标记基因(如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因等)。特别优选的，所述标记基因为潮霉素基因。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述的RNAi植物表达载体是将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4。

特别优选的，所述的RNAi植物表达载体，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

其中，所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。

值得注意的是，用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的RNAi表达载体，工程菌、细胞、愈伤组织、转基因苗、种子等均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个方面还提供了一种RNAi植物表达载体的构建方法，包括将SEQ IDNo.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体上。

本发明一个优选的实施例是将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4。

具体的，所述方法可以按照以下步骤进行：

(1)设计3对引物，分别扩增SEQ ID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接

HIS1i-4-F:ATCGGGGAAATTCGAGCTcGTAATGTGCAATGGCATCTTCAGGA(SEQ ID No.5)

HIS1i-4-Rv1:GAGATTTTCATCAGATCCTCAGGGAGTCGATGT(SEQ ID No.6)

HIS1i-4-F2:CTGAGGATCTGATGAAAATCTCGAAACAGCCGTGT(SEQ ID No.7)

HIS1i-4-Rv2:CTGAGGATCTGAGGTAAGTTACTACAAACCTTTTTGTATTTATGTTCC(SEQ IDNo.8)

HIS1i-4-F3:AGTAACTTACCTCAGATCCTCAGGGAGTCGATGT(SEQ ID No.9)

HIS1i-4-Rv:CTGCAGGTCGACTCTAGAGgatccGTAATGTGCAATGGCATCTTCAGGA(SEQ IDNo.10)

(2)RNAi植物表达载体的构建与转化

以水稻cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HIS1i-4基因片段1和3。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。

以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HIS1i-4基因片段2。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。

获得PCR产物片段，回收后，分别命名为HIS1i-4-1(SEQ ID No.1所示序列)、HIS1i-4-2(SEQ ID No.2所示序列)及HIS1i-4-3(SEQ ID No.3所示序列)。用SacⅠ+BamHⅠ酶切植物双元转化载体pTCK303，将目的片段HIS1i-4-1、HIS1i-4-2及HIS1i-4-3直接连入经酶切的pTCK303质粒，获得载体pTCK303-HIS1i-4。

本发明还提供了一种本发明所述的RNAi植物表达载体在干扰植物HIS1基因表达、制备对β-三酮类除草剂显性敏感植物中的应用。

本发明的RNAi植物表达载体可通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织。

优选的，所述应用包括将pTCK303-HIS1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织。所述愈伤组织可以为花药诱导的愈伤组织、成熟胚诱导的愈伤组织、幼胚诱导的愈伤组织、幼穗诱导的愈伤组织。

本发明的一个方面还提供了一种获得对β-三酮类除草剂显性敏感植物的方法，包括将所述RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物HPPD抑制剂敏感型1基因HIS1表达。

在本发明的一种实施方式中，所述获得除草剂显性敏感植物的方法包括：

(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4；

(2)转化：将pTCK303-HIS1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物。

其中，所述RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

其中，所述除草剂可以为β-三酮类除草剂。所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。

本发明所述的β-三酮类除草剂包括但不限于甲基磺草酮、双环磺草酮。本发明的实施例中，验证发现筛选双环磺草酮敏感转基因株系的最低浓度为1000mg/L双环磺草酮，筛选甲基磺草酮敏感转基因株系的最低浓度为6mg/L甲基磺草酮。

本发明提供了所述RNAi植物表达载体在培育转基因新品种、杂交水稻制种或防止转基因逃逸中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明基于RNAi技术，通过筛选构建了一个针对水稻HIS1基因的植物双元转基因载体，该载体可高效的抑制HIS1基因，且其序列完全为水稻内源序列，可有效消除公众对于外源基因转基因引起的风险和担忧。将该载体转化水稻，成功抑制了HIS1基因的表达，并将水稻从对β-三酮类除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对β-三酮类除草剂显性敏感的水稻。使得转基因植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有非常重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明3个DNA片段HIS1i-4-1、HIS1i-4-2及HIS1i-4-3的片段扩增回收电泳图；其中1-6泳道为HIS1i-4-1目的片段；7-12泳道为HIS1i-4-2目的片段；13-18泳道为HIS1i-4-3目的片段。

图2为本发明pTCK303骨架载体酶切回收电泳图；其中CK为pTCK303骨架载体作为对照；1-2泳道为Sac I/BamH I双酶切pTCK303骨架载体。

图3为本发明pTCK303-HIS1i-4载体经SacⅠ和BamHⅠ酶切的电泳图；图中CK为pTCK303-HIS1i-4单克隆重组质粒；泳道1-4分别为酶切的单克隆重组质粒，M为marker，所切出的片段大小964bp，包括目的片段的正向、反向互补序列及水稻内含子序列。

图4为本发明转基因株系潮霉素抗性基因PCR检测电泳图；泳道1，H

图5为本发明pTCK303-HIS1i-4转基因T0代三叶期幼苗对2250mg/L双环磺草酮溶液敏感度测试14d；图中，WT为ZH11非转基因植株；整株枯萎为高度敏感株系；叶片发白，叶尖枯黄为中度敏感株系；无反应为抗性株系。

图6为本发明pTCK303-HIS1i-4转基因T0代三叶期幼苗叶片对15mg/L甲基磺草酮溶液敏感度测试14d；WT为ZH11非转基因植株，102-1及103-1为敏感株系。

图7为对比例1中将环序列替换为SEQ ID No.11所示序列后，构建RNAi载体后转基因苗喷施6000mg/L双环磺草酮14d结果；箭头所指为敏感株系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1菌株、质粒的获得及PCR引物的合成

(1)菌株和质粒

作为骨架载体的植物双元转化载体pTCK303包含潮霉素抗性基因、玉米Ubi启动子及NOS终止子。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5α；农杆菌(Agrobacterimtumefacieus)菌株为EHA105。

(2)PCR引物序列

设计3对引物，分别扩增SEQ ID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接。

设计得到的引物组合序列信息如下：

HIS1i-4-F:ATCGGGGAAATTCGAGCTcGTAATGTGCAATGGCATCTTCAGGA(SEQ ID No.5)

HIS1i-4-Rv1:GAGATTTTCATCAGATCCTCAGGGAGTCGATGT(SEQ ID No.6)

HIS1i-4-F2:CTGAGGATCTGATGAAAATCTCGAAACAGCCGTGT(SEQ ID No.7)

HIS1i-4-Rv2:CTGAGGATCTGAGGTAAGTTACTACAAACCTTTTTGTATTTATGTTCC(SEQ IDNo.8)

HIS1i-4-F3:AGTAACTTACCTCAGATCCTCAGGGAGTCGATGT(SEQ ID No.9)

HIS1i-4-Rv:CTGCAGGTCGACTCTAGAGgatccGTAATGTGCAATGGCATCTTCAGGA(SEQ IDNo.10)

实施例2 RNAi植物表达载体的构建与转化

(1)为了构建HPPD抑制剂敏感型1基因HIS1的干扰载体，以水稻cDNA为模板，利用实施例1的引物进行PCR扩增HIS1i-4基因片段1和3。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。

(2)以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HIS1i-4基因片段2。扩增体系及程序如下：

程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。

(3)经琼脂糖凝胶电泳后，利用

SacI+BamHI双酶切反应体系如下：

(4)2x Lightening Cloning Kit连接试剂盒

连接程序：50℃30min。

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，重组质粒经SacⅠ和BamHⅠ双酶切，目的片段大小符合预期，见图3，并将重组子送测序验证正确，即以水稻Zinc finger基因内含子(Rice intron)为环，构建的HIS1i-4RNAi载体，将此载体命名为pTCK303-HIS1i-4。

实施例3农杆菌转化水稻及转基因植株鉴定

将pTCK303-HIS1i-4重组质粒导入农杆菌EHA105菌株，并转化粳稻中花11愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根获得再生转基因株系21株，通过PCR鉴定转基因植株中转入的潮霉素抗性基因，结果显示，PCR阳性植株14株(图4)，将阳性植株移栽至泥土中，成活14株。

实施例4水稻β-三酮类除草剂双环磺草酮敏感与抗性转基因株系的获得

为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用25％双环磺草酮母液(日本史迪士生物科学株式会社，批号2019050603)配制1000mg/L～4500mg/L双环磺草酮溶液，喷施实施例3获得的pTCK303-HIS1i-4转基因T0代三叶期幼苗，喷后连续观察。

双环磺草酮2250mg/L喷施HIS1i-4转基因10个株系，喷施后14d，有8个株系出现叶片整片发白至枯萎，属于高度敏感株系；有1个株系均出现叶片发白至叶尖枯黄，属于中敏感株系；有1个株系出现个别叶片发白，属于低敏感株系(图5)。

进一步使用低浓度双环磺草酮1000mg/L喷施HIS1i-4转基因5个株系，喷施后14d，有3个株系出现叶片发白至枯萎，属于高度敏感株系；有1个株系出现叶片发白至叶尖枯黄，属于中敏感株系；有1个株系出现个别叶尖枯黄，属于低敏感或不敏感株系。以上结果表明，我们成功获得了除草剂显性敏感的转基因材料。

实施例5水稻甲基磺草酮(硝磺草酮)敏感与抗性转基因株系的获得

为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用甲基磺草酮母液(江苏丰山集团股份有限公司，批号20190119004)配制6mg/L～750mg/L甲基磺草酮溶液，喷施实施例3获得的pTCK303-HIS1i-4转基因T0代三叶期幼苗，喷后连续观察。

甲基磺草酮15mg/L喷施HIS1i-4转基因4个株系叶片，喷施后7d，HIS1i-4转基因T0代幼苗部分株系叶片叶尖微卷曲，叶片些许发白；喷施后14d，有2个株系出现叶片发白至枯黄，属于高度敏感株系(图6)；有2个株系喷施前后叶片反应不明显，属于抗性株系。

进一步使用低浓度甲基磺草酮溶液6mg/L喷施HIS1i-4转基因4个株系叶片，喷施后14d，有1个株系出现叶片发白至枯萎，属于高度敏感株系。

以上结果表明，我们成功获得了除草剂显性敏感的转基因材料。

对比例1

为测试不同茎环对干扰效率的影响，将SEQ ID No.2内含子序列缩短至300bp后(见SEQ ID No.11)，构建载体并转化中花11制备获得转基因株系。

对上述转基因株系分别喷施浓度2250mg/L-4500mg/L双环磺草酮，结果却发现转基因株系表现出较高的抗性。当对双环磺草酮喷施6000mg/L以上浓度才有敏感表型，且敏感株系比例低，表明按照此方法设计茎环的OsHIS1i对HIS1基因的干扰效率较差。此方法设计的OsHIS1i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对6000mg/L双环磺草酮测试结果见图7。

对比例2

进一步将SEQ ID No.2内含子序列缩短至240bp后(见SEQ ID No.12)，构建载体并转化中花11制备获得转基因株系。对上述转基因株系分别喷施高浓度双环磺草酮，结果发现转基因株系也表现出较高的抗性，其结果与对比例1中类似，表明按照此方法设计茎环的OsHIS1i对HIS1基因的干扰效率较差。

除了上述2个对比例，本发明在研究过程中，针对OsHIS1基因内含子序列选择了全内含子序列、以及OsHIS1基因内含子序列中不同截短大小的序列期望与SEQ ID No.1和3所示的DNA片段形成发卡结构，但发现这些内含子序列所示的DNA片段无法形成发卡的“环”或所形成茎环结构效率很差，进而使得它们在替换本发明SEQ ID No.2所示序列后，不能使SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”最终被顺利在体内形成双链短RNA。这充分说明了，本发明SEQ ID No.2内含子序列与SEQ ID No.1和3所示的DNA片段形成发卡结构，构建得到的植物表达载体，能够很好地抑制HIS1基因，干扰效率高，使转基因植株表现出对β-三酮类除草剂表现出显著的敏感性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用

<130> KHP201115213.6

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtaatgtgca atggcatctt caggagcccg gtgcacaggg tggtgacaaa cgccgagaag 60

gagaggatct ccctggccat gttatacagc gtgaacgatg agaaagacat tgagccggcg 120

gctggtttgc tggatgagaa tcggcctgca agatacagga aagtgagcgt cgaagagttc 180

agggccggga tctttggaaa attctctcga ggagagaggt acatcgactc cctgaggatc 240

tga 243

<210> 2

<211> 478

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaaaatctc gaaacagccg tgtcatagtc aatcattagg tgttatagga acaatcaaag 60

gttttttcaa gtgttaatct tcatactaat atatacagtg ggtactcttt atctactgcc 120

gtggaactgt catatttgat tatgaaattt tagctctaga aaatatttga tcatcaatgt 180

caagacttta tgaccttgca aaatacattt cctaattgag aacagggtaa aattatgaac 240

tatgcctctg aaccttcata cacaggcagc acattttttg ttgtaaaatt catcttaata 300

tcagcggaaa gactggacca gagaaagaaa aagttaagac aggcatatac tcttgatcct 360

ctaaaagaga tgaggcggta caatgatcaa ccatgaacat taaagtgata cgtggaacat 420

gagaacacaa ataattgtca ctggaacata aatacaaaaa ggtttgtagt aacttacc 478

<210> 3

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcagatcctc agggagtcga tgtacctctc tcctcgagag aattttccaa agatcccggc 60

cctgaactct tcgacgctca ctttcctgta tcttgcaggc cgattctcat ccagcaaacc 120

agccgccggc tcaatgtctt tctcatcgtt cacgctgtat aacatggcca gggagatcct 180

ctccttctcg gcgtttgtca ccaccctgtg caccgggctc ctgaagatgc cattgcacat 240

tac 243

<210> 4

<211> 15034

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catggtagat ctgagggtaa atttctagtt tttctccttc attttcttgg ttaggaccct 60

tttctctttt tatttttttg agctttgatc tttctttaaa ctgatctatt ttttaattga 120

ttggttatgg tgtaaatatt acatagcttt aactgataat ctgattactt tatttcgtgt 180

gtctatgatg atgatgatag ttacagaacc gacgactcgt ccgtcctgta gaacgtgaaa 240

tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt ggaattgatc 300

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acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg 420

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tttgtgtgaa caacgaactg aactggcaga ctatcccgcc gggaatggtg attaccgacg 660

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gcagcgtaat gctctacacc acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc gtggtgacgc 780

atgtcgcgca agactgtaac cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc aatggtgatg 840

tcagcgttga actgcgtgat gcggatcaac aggtggttgc aactggacaa ggcactagcg 900

ggactttgca agtggtgaat ccgcacctct ggcaaccggg tgaaggttat ctctatgaac 960

tgtgcgtcac agccaaaagc cagacagagt gtgatatcta cccgcttcgc gtcggcatcc 1020

ggtcagtggc agtgaagggc gaacagttcc tgattaacca caaaccgttc tactttactg 1080

gctttggtcg tcatgaagat gcggacttac gtggcaaagg attcgataac gtgctgatgg 1140

tgcacgacca cgcattaatg gactggattg gggccaactc ctaccgtacc tcgcattacc 1200

cttacgctga agagatgctc gactgggcag atgaacatgg catcgtggtg attgatgaaa 1260

ctgctgctgt cggctttaac ctctctttag gcattggttt cgaagcgggc aacaagccga 1320

aagaactgta cagcgaagag gcagtcaacg gggaaactca gcaagcgcac ttacaggcga 1380

ttaaagagct gatagcgcgt gacaaaaacc acccaagcgt ggtgatgtgg agtattgcca 1440

acgaaccgga tacccgtccg caagtgcacg ggaatatttc gccactggcg gaagcaacgc 1500

gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt aatgttctgc gacgctcaca 1560

ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa ccgttattac ggatggtatg 1620

tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga aaaagaactt ctggcctggc 1680

aggagaaact gcatcagccg attatcatca ccgaatacgg cgtggatacg ttagccgggc 1740

tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagagtatca gtgtgcatgg ctggatatgt 1800

atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg tcgtcggtga acaggtatgg aatttcgccg 1860

attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa caagaaaggg atcttcactc 1920

gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc tgctgcaaaa acgctggact ggcatgaact 1980

tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aagctagcca ccaccaccac caccacgtgt 2040

gaattacagg tgaccagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 2100

ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 2160

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taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt aaactatcag 2340

tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg 2400

gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc 2460

acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt 2520

cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt 2580

tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg 2640

cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc 2700

cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg 2760

ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag 2820

gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac 2880

agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg 2940

catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac 3000

gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct 3060

aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg 3120

cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga 3180

aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg 3240

cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg 3300

tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga 3360

acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc 3420

gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg 3480

cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc 3540

ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac 3600

agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag 3660

gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca 3720

tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt 3780

ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg 3840

ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact 3900

tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag 3960

ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc 4020

tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg 4080

tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg 4140

ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg 4200

ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc 4260

aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat 4320

gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc 4380

aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc 4440

ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct 4500

gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat 4560

gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg 4620

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ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 4800

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caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 4920

tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 4980

gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 5040

cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 5100

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cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 5340

cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 5400

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cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 5580

gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 5640

gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 5700

ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 5760

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attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 5940

tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 6000

tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 6060

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tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 6180

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acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 6360

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acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 6480

agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 6540

aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 6600

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 6660

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 6720

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 6780

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 6840

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 6900

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 6960

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 7020

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 7080

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 7140

tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 7200

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 7260

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 7320

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 7380

attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata atattttatt 7440

ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata ctgttcttcc 7500

ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt gtccgccctg 7560

ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa gatgttgctg 7620

tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt ctttaaaaaa 7680

tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc gcaatccaca 7740

tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc taagctattc 7800

gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc cgcatacagc 7860

tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag gacgccatcg 7920

gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag gacctttgga 7980

acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac atcataggtg 8040

gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc tcccaccagc 8100

ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta tttttcgatc 8160

agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct tcctcttttc 8220

tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc aattcactgt 8280

tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg ttttcaaagt 8340

tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca caggcagcaa 8400

cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt gtttcaaacc 8460

cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag tctgccgcct 8520

tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat cgagtggtga 8580

ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga tatattgtgg 8640

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aattaacgcc gaattaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg gttttaggaa 8760

ttagaaattt tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag ggtttcttat 8820

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acacattatt atggagaaac tcgagcttgt cgatcgacag atccggtcgg catctactct 8940

atttctttgc cctcggacga gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta 9000

cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc 9060

cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat 9120

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gtcgtggcga tcctgcaagc tccggatgcc tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca 9240

tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga 9300

acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt 9360

tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca 9420

tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc 9480

agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac 9540

cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga 9600

tcgcatccat agcctccgcg accggttgta gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt 9660

cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctaaact 9720

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ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga 9900

cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt 9960

tcatatctca ttgccccccc ggatctgcga aagctcgaga gagatagatt tgtagagaga 10020

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cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg atgaagtgac 10320

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atgaatagat gctgcatatg ccatcatgta tatgcatcag taaaacccac atcaacatgt 12540

atacctatcc tagatcgata tttccatcca tcttaaactc gtaactatga agatgtatga 12600

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ccgatctaga acgaatgaac gaccgcccaa ccacaccaca tcatcacaac caagcgaaca 12720

aaaagcatct ctgtatatgc atcagtaaaa cccgcatcaa catgtatacc tatcctagat 12780

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gaacagaagt agaactaccg ggccctaacc atggaccgga acgccgatct agagaaggta 13260

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cggcgtttaa caggctggca ttatctactc gaaacaagaa aaatgtttcc ttagtttttt 13740

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagattttca tcagatcctc agggagtcga tgt 33

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgaggatct gaggtaagtt actacaaacc tttttgtatt tatgttcc 48

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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