一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒，可在2小时内快速检测出EGFR突变位点，属于常见基因耐药性位点突变检测、等温扩增等技术领域。

背景技术

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是鸟类成红细胞白血病病毒(avianerythroblastic leukemia viral,v-erb-b)致癌基因同源体，为HER/ErbB家族的四个成员之一。EGFR及其配体是细胞信号传导系统的一部分，EGFR基因拷贝数增加或者过度表达，均能促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移。当EGFR20号外显子第790位点上的苏氨酸被蛋氨酸所取代，增强了ATP与EGFR-TK结合域的亲和力，导致EGFR-TKI不能有效阻断信号通路而产生耐药，极大的降低了受体酪氨酸激酶抑制剂EGFR-TKI等药物的治疗应答效果。

目前，检测EGFR基因突变最常用的方法是聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)和测序法；聚合酶链式反应如数字微滴PCR，虽然精度高，但仪器过于昂贵，样品处理流程麻烦，反应时间较长，其中，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR，qPCR)，也是存在类似的问题；扩增阻遏突变系统PCR(Amplification RefractoryMutation System PCR，ARMS PCR)除时间较长外精度也有局限；NGS(Next-GenerationSequencing)是近年发展起来的高通量深度测序技术，可一次性对几百万条至十亿条DNA分子进行并行测序，但对稀有突变及结构变异不敏感且价格昂贵，优势是通量大，可同时检测多个位点、方式的突变，但耗时过长，仪器昂贵，绝大多数测到的数据是无用的。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒，利用设计的环锁引物与等温扩增信号放大机制来实现快速、精准、低成本、操作简单的检测方法，降低诊断的成本、缩短诊断的时间。

本发明的技术方案如下：

一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒，所述试剂盒含有与EGFR基因T790M位点结合的探针结合预混液、酶促反应预混液和信号放大预混液；

所述探针结合预混液包括特异性识别检测人类EGFR基因20号外显子上T790M突变位点并带有修饰的环锁核酸探针引物、RecA蛋白、单链结合蛋白以及促进探针结合缓冲液；所述环锁核酸探针引物包含与EGFR基因上可结合部分和非特异结合部分，环锁核酸探针引物序列如SEQ ID NO.1；

所述酶促反应预混液包括高保真高温连接酶、四种随机脱氧核糖核苷酸dNTP和酶促反应缓冲液；

所述信号放大预混液包括具有链置换活性的等温扩增酶、链置换等温扩增的引物dNTP、结合双链DNA的

进一步地，所述试剂盒还含有纯合子阳性对照品、阴性对照品和标准品；

所述纯合子阳性对照品为浓度15ng/μL的与探针结合预混液中环锁核酸探针结合但不促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；

所述阴性对照品为浓度15ng/μL的与探针结合预混液中环锁核酸探针结合且促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；

所述标准品为用于荧光计检测的双链DNA片段，由低浓度DNA和高浓度DNA两管组分组成。

进一步地，所述探针结合预混液中的促进探针结合缓冲液pH为7.5，促进探针结合缓冲液包括但不限于Tris-HCl、MgCl

进一步地，所述酶促反应预混液中的酶促反应缓冲液pH为7.6，酶促反应缓冲液包括但不限于Tris-HCl、醋酸钾、醋酸镁、NADⅠ型辅酶、DTT、Triton X-100或甘油中的一种。

进一步地，所述信号放大预混液中的促进酶反应活性缓冲液的pH为7.5，促进酶反应活性缓冲液包括但不限于Tris-HCl、MgCl

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒，利用设计的能够特异识别检测人类EGFR基因20号外显子上T790M突变位点并带有修饰环锁探针引物与等温扩增信号放大机制来实现快速、精准、低成本、操作简单的检测方法，其中，环锁探针引物包含与EGFR基因上可结合部分和非特异结合部分，非特异结合部分不与人基因组任何片段互补，在RecA(Recombination A)蛋白的带领下，环锁探针引物可以与基因组EGFR基因特异区域结合形成杂交链；在野生型样本中由于环锁探针引物不能与模板完全互补，从而不能成环，而在T790M突变的基因型存在时，环锁探针引物自身与模板互补，或在酶促反应完成后与模板互补，并能够进一步收尾连接成环，进而能够区分EGFR基因第790位点野生型和突变型(T790M)，实现EGFR基因耐药突变的快速、精准地检测。

2、本发明提供的一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒，对于EGFR基因耐药突变的检测全程可在室温条件下进行反应，整体操作时间在2小时以内完成。

附图说明

图1为本发明实施例中环锁探针引物序列及结构示意图；

具体实施方式

下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒，所述试剂盒含有与EGFR基因T790M位点结合的探针结合预混液、酶促反应预混液和信号放大预混液；

所述探针结合预混液包括特异性识别检测人类EGFR基因20号外显子上T790M突变位点并带有修饰的环锁核酸探针引物、RecA蛋白、单链结合蛋白以及促进探针结合缓冲液；所述环锁核酸探针引物包含与EGFR基因上可结合部分和非特异结合部分，环锁核酸探针引物序列如SEQ ID NO.1；GAATGAATGGGTGAAAGAAGATAAGCCTCATGCTTCTTCGGTGCCCATTACGAGCGCGCAGACACGATAGTCTGACTAATACTGCTGAATGAATGAATGAA；

其中，第一位G和第二位A之间存在修饰基团，第五位G和第六位A之间存在修饰基团，第十三位G和第十四位A之间存在修饰基团，第八十五位G和第八十六位T之间存在修饰基团，第九十五位G和第九十六位A之间存在修饰基团，第九十九位G和第一百位A之间存在修饰基团，第一百位A和第一百零一位A之间存在修饰基团，修饰基团，不限于磷酸基团、未完整磷酸基团、羟基、未完整羟基、突变碱基、损伤碱基或化学基团、异常DNA双链结构等化学结构信息；探针上未带阴影区域代表可与人基因上结合的部分，带阴影区域代表与人基因不可结合的部分；

所述促进探针结合缓冲液pH为7.5，包括但不限于Tris-HCl、MgCl

所述酶促反应预混液包括高保真高温连接酶、四种随机脱氧核糖核苷酸dNTP和酶促反应缓冲液；所述酶促反应缓冲液pH为7.6，包括但不限于Tris-HCl、醋酸钾、醋酸镁、NADⅠ型辅酶、DTT、Triton X-100或甘油中的一种；

所述信号放大预混液包括具有链置换活性的等温扩增酶、链置换等温扩增的引物dNTP、结合双链DNA的

进一步地，所述试剂盒还含有纯合子阳性对照品、阴性对照品和标准品；

所述纯合子阳性对照品为特定浓度15ng/μL(检测范围内100％可以检出)的与探针结合预混液中环锁核酸探针结合但不促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；

所述阴性对照品为特定浓度15ng/μL(检测范围内100％可以检出)的与探针结合预混液中环锁核酸探针结合且促进环锁探针成环的合成DNA双链片段；

所述标准品为用于荧光计检测的双链DNA片段，由低浓度DNA和高浓度DNA两管组分组成。

本发明还公开了一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒操作方法，包括如下：

(1)探针结合反应：在干净的无核酸酶反应管中用移液器加入30-100ng纯化的样本人源基因组DNA或对照组样品，分别与一次反应所需的探针结合预混液(2×)，在37℃条件下(可用金属浴)反应15min，人源基因组DNA须从体细胞采样，例如抽提自全血白细胞基因组DNA、口腔上皮细胞DNA(用口腔拭子采集)等；

(2)酶促反应：等体积在上述各反应管中用移液器加入一次反应所需的酶促反应预混液(2×)，移液器至少10次吹打混匀后，在37℃条件下反应25min；

(3)信号放大：按照稀释倍数(1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000)稀释对应的体系，再在上述各反应管中用移液器加入一次反应所需的信号放大预混液(5×)，在37℃条件下反应2h；

(4)信号检测：按照赛默飞旗下Life公司

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 上海融享生物科技有限公司

<120> 一种快速检测EGFR基因耐药突变的试剂盒

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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