与小麦粒重相关的SNP分子标记的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及与小麦粒重相关的SNP分子标记的应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum)在全世界范围内广泛种植，也是我国三大主要粮食作物之一，经过加工可制作面包、馒头、饼干、面条等食物，发酵后可制成啤酒、酒精、白酒或生物燃料等(张英华，王志敏，周顺利，等.当前小麦研究的国际热点[J].科技导报，2014，32(13)：64-69.)。提高小麦产量是满足人口增长和提升人民生活水平的重要条件，因此提高产量是育种家的首要育种目标，单位面积穗数、每穗粒数及千粒重是小麦产量的重要遗传因素(王婧姝.小麦与产量相关的农艺性状研究进展[J].农村经济与科技，2018，29(018)：23.)。上世纪60年代，矮杆基因的应用掀起了一场粮食绿色革命，通过增强小麦抗倒伏能力，大大提高了粮食产量。近年来，随着高密度分子标记和基因测序等分子生物学技术的发展，很多小麦产量相关基因及其功能得到解析(Gupta P K，Mir RR，Mohan A，et al.WheatGenomics：Present Status and Future Prospects[J].Intemational Journal ofPlantGenomics，2008，2008(1687-5370)：896451.)。千粒重基因主要位于1A、1B、第二同源群、3A、3D、4A、5A、5D、第六同源群和第七同源群，例如TaSus1-7A，6-SFT-A2，TaGASR-A1，TaTGW-7A，TaMOC1-7A，TaSAP1-A1等基因(侯健.小麦蔗糖合酶基因TaSus1，TaSus2与千粒重的关联分析[D].2012.；Yue A，Li A，Mao X，et al.Identification and development of afunctional marker from 6-SFT-A2associated with grain weight in wheat[J].Molecular Breeding，2015，35(2)：63.；Ming-Jian H，Hai-Ping Z，Kai L，et al.Cloningand Characterization of TaTGW-7A Gene Associated with Grain Weight in Wheatvia SLAF-seq-BSA[J].Frontiers in Plant ence，2016，7(e0145970).)。

分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)是现代分子生物学和传统遗传育种相结合的新型育种模式，可以利用分子标记在植物发育的任何时期从DNA水平对目标植株进行选择(Tanksley等，RFLP mapping in plant breeding：New tools foran old science.1989，Biotechnology，7：257-263)，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，成为解决品种选育难这一问题的有效途径。其中，利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加产量育种准确度与提高育种效率的有效手段。

单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的DNA序列多态性，主要包括单个碱基的缺失、插入、转换及颠换等(唐立群等，SNP分子标记的研究及其应用进展.2012，中国农学通报，28(12)：154-158.)。基于SNP位点设计的标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第二代分子标记相比，基于SNP位点设计的KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。因此，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。

上述很多小麦产量相关基因的连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但多为SSR标记、InDel标记或酶切标记，检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，并不适用于高通量的分子检测平台(胡明建.小麦粒重相关基因TaTGW6、TaTGW-7A克隆及其功能标记开发[D].2016.；相吉山，穆培源，桑伟等.小麦粒重基因TaCwi-A1功能标记CWI22、CWI21的验证及应用[J].中国农业科学，2014，47(13)：2671-2679.)。因此，开发适合于高通量分子检测平台的小麦产量KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国小麦的育种效率和育种水平具有重要意义。

发明内容

本发明提供了鉴定或辅助鉴定小麦粒重的方法，包括检测待测小麦的基因型，根据待测小麦的基因型鉴定或辅助鉴定小麦粒重；所述基因型为小麦基因组中KASP_78A16位点的基因型；所述KASP_78A16位点是小麦基因组中的一个SNP位点，位于小麦第5A号染色体上SEQ ID No.4的第51位核苷酸，其核苷酸种类为A或T，所述KASP_78A16位点的基因型为TT基因型的待测小麦的粒重低于或者候选低于所述KASP_78A16位点的基因型为AT基因型或者AA基因型的待测小麦；所述KASP_78A16位点的基因型为AT基因型的待测小麦与所述KASP_78A16位点的基因型为AA基因型的待测小麦在粒重上无显著差异；其中，所述TT基因型表示小麦基因组中所述KASP_78A16位点的核苷酸种类为T的纯合型；所述AA基因型表示小麦基因组中所述KASP_78A16位点的核苷酸种类为A的纯合型；所述AT基因型表示小麦基因组中所述KASP_78A16位点的核苷酸种类为A和T的杂合型。

上述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围之内。

本发明还提供了检测所述KASP_78A16位点的多态性或基因型的物质的应用。所述应用为在鉴定或辅助鉴定小麦粒重中的应用、在制备鉴定或辅助鉴定小麦粒重产品中的应用或在小麦辅助育种或制备小麦辅助育种产品中的应用。

本发明又提供了小麦育种的方法，包括选择所述KASP_78A16位点的基因型为AA或AT的小麦作为亲本进行育种，所述AA基因型表示小麦基因组中所述KASP_78A16位点的核苷酸种类为A的纯合型；所述AT基因型表示小麦基因组中所述KASP_78A16位点的核苷酸种类为A和T的杂合型。

上文中，所述小麦育种可为培育高粒重小麦。

含有检测所述KASP_78A16位点的多态性或基因型的物质的产品也在本发明的保护范围之内。

所述产品为C1)-C3)中任一种产品：

C1)检测与小麦粒重相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

C2)鉴定或辅助鉴定小麦粒重的产品；

C3)用于小麦辅助育种的产品。

上文中，检测所述KASP_78A16位点的多态性或基因型的物质可为如下D1)、D2)或D3)：

D1)检测所述KASP_78A16位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_78A16位点在内的小麦基因组DNA片段的PCR引物；

D2)检测所述KASP_78A16位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；

D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。

上文中，所述PCR引物可为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-42位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-42位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA组成的引物组。

可选地，所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ IDNo.2所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

上述应用、方法和产品中，所述PCR引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如

本发明提供了一种小麦粒重相关基因TaCYP78A16紧密连锁的SNP分子标记开发与应用，所述分子标记是与小麦粒重相关基因TaCYP78A16紧密连锁的SNP分子标记KASP_78A16。该分子标记可高通量检测小麦基因组第5A号染色体的第527492344位碱基。本发明提供的方法对小麦粒重相关基因TaCYP78A16紧密连锁的SNP分子标记进行基因型鉴定，例如，应用KASP技术，该方法具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测小麦粒重相关基因TaCYP78A16，对促进小麦产量育种具有重要意义。

在本发明的一个实施例中，使用KASP技术对26份小麦品种的KASP_78A16位点的基因型进行鉴定。实验证明，KASP_78A16位点为A的纯合型小麦品种的粒重最大值为50.43，最小值为41.25，平均值为46.26，中位数为46.24，KASP_78A16位点为T的纯合型小麦品种的粒重最大值为46.67，最小值为35.61，平均值为42.89，中位数为43.25，AA基因型待测小麦品种的粒重显著高于或候选高于TT基因型的待测小麦品种，说明KASP_78A16位点是与小麦粒重相关的SNP分子标记，可用于鉴定或辅助鉴定小麦粒重，可用于小麦高粒重品种的筛选，可用于小麦分子标记辅助育种。KASP_78A16位点的多态性直接以DNA的形式表现，在小麦的各个组织及各个发育阶段均可检测到，有利于方便快捷地预测小麦粒重。在实际应用中，为了提高准确率，可将检测KASP_78A16位点多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与小麦粒重相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制各鉴定小麦高粒重品种的产品。

附图说明

图1为实施例1利用分子标记KASP_78A16检测26份测试小麦品种材料的分型图，其中，TT-FAM表示基因型为TT，AA-VIC表示基因型为AA。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的小麦品种均可从商业途径得到。

本发明的发明人筛选出一个和小麦粒重相关的SNP位点，该位点与TaCYP78A16基因(核苷酸序列的genbank登录号为MH572527，2019年1月20日)紧密连锁，锚定在小麦第5A号染色体)的第527492344位(http：∥plants.ensembl.org/index.html，基因组版本Triticum aestivum IWGSC(Genomic sequence))，将该SNP位点命名为KASP_78A16，其侧翼序列如SEQ ID No.4所示，SEQ ID No.4中，w为a或t。KASP_78A16位于SEQ ID No.4的第51位，该处的核苷酸种类为A或T。

下述TT基因型表示KASP_78A16的核苷酸种类为T的纯合型；AA基因型表示KASP_78A16的核苷酸种类为A的纯合型；AT基因型表示KASP_78A16的核苷酸种类为A和T的杂合型。

实施例1与小麦粒重相关基因TaCYP78A16紧密连锁KASP标记开发

1.引物的设计：根据KASP_78A16位点提取左右各100bp的侧翼序列，优选利用Primer5.0软件设计3组KASP引物。利用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测后，挑选出1套多态性良好的KASP引物用于后续验证。

用于检测KASP_78A16的KASP引物具体如下：

Primer X：5’-gaaggtcggagtcaacggattGCCATACATACATGCACGGAA-3’(SEQ IDNo.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；

Primer Y：5’-gaaggtgaccaagttcatgctGCCATACATACATGCACGGAT-3’(SEQ IDNo.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；

Primer R：5’-CGACGTACCGTACATGCTTGAG-3’(SEQ ID No.3)。

2.DNA提取：采用常规CTAB法从小麦叶片中提取基因组DNA。

3.KASP反应测试

SNP标记扩增及反应体系：

(1)荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测：

5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、PrimerY 100pmol·L

以上反应体系为AB-Q6 Flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

(2)选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测

1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL0.8μL，引物混液0.03μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、PrimerY 100pmol·L

以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。

其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg

扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测小麦基因组中KASP_78A16位点的基因型(即检测小麦基因组第5A号染色体的第527492344位碱基是A还是T)，若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近X轴(VIC信号)，则待测小麦基因组中KASP_78A16位点的基因型为AA纯合型(即小麦基因组第5A号染色体的第527492344位碱基为AA纯合型)；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近Y轴(FAM信号)，则待测小麦基因组中KASP_78A16位点的基因型为TT纯合型(即小麦基因组第5A号染色体的第527492344位碱基为TT纯合型)；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析位于X轴和Y轴中间(VIC和FAM信号)，则待测小麦基因组中KASP_78A16位点的基因型为AT杂合型(即小麦基因组第5A号染色体的第527492344位碱基为AT杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。

5.标记分型数据分析

为了验证KASP_78A16标记的可靠性，对26份小麦品种材料进行千粒重测量，千粒重测量方法见文献(孔忠新，程瑞如，张利伟，等.小麦粒重主效QTL近等基因系的构建和效应评价[J].麦类作物学报，2017(03)：30-36.)。材料基因型采用DouglasScientific公司ArrayTape平台进行检测，检测方法、反应体系以及扩增程序按照上述优选方案实行。

扩增结果表明，KASP_78A16标记在26份材料中能够获得稳定的PCR产物，并且能够检测到AA-VIC和TT-FAM两个等位位点(图1)。对测试品种的粒重数据进行统计(表1)，AA基因型品种的粒重最大值为50.43，最小值为41.25，平均值为46.26，中位数为46.24；TT基因型品种的粒重最大值为46.67，最小值为35.61，平均值为42.89，中位数为43.25。通过软件Microsoft EXCEL2010的“方差分析：单因素方差分析”方法对表1数据进行分析，结果为F(value＝7.7)＞F crit(value＝4.26)，P value＝0.05，两种基因型材料的粒重达到显著差异。由此，可看出携带AA基因型的品种粒重更大。

因此，本发明所述的KASP_78A16标记可用于小麦粒重相关基因TaCYP78A16的分子标记辅助育种。

表1.26份测试小麦品种的粒重与基因型信息

实施例2与小麦粒重相关基因TaCYP78A16紧密连锁的KASP标记在分子标记辅助选择小麦高粒重植株中的应用

为检测本发明KASP_78A16标记的实用性，将表1所述的小麦品种济麦44(作为母本)与藁优8901(作为父本)杂交配制F2分离群体，对F2分离群体进行KASP标记检测和千粒重称量(检测结果见表2)，标记检测和千粒重测量实施方法参考实施例1。

对测试品种的粒重数据进行统计，在48份分离群体单株中，AA或AT基因型品种的千粒重最大值为52.11，最小值为35.61，平均值为45.69，中位数为45.52；TT基因型品种的千粒重最大值为47.43，最小值为35.91，平均值为41.79，中位数为42.13。通过软件Microsoft EXCEL2010的“方差分析：单因素方差分析”方法对表2数据进行分析，结果为F(value＝10.27)＞F crit(value＝4.05)，P value＝0.01，AA或AT基因型品种和TT基因型品种相比较，粒重达到极显著差异。根据上述结果，可知携带A基因型的品种粒重更大，表明标记KASP_78A16在小麦高粒重植株筛选中具有较高的实用性。

表2.小麦分离群体的表型与基因型信息

注：‘*’表示无检测信号。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 河北省农林科学院粮油作物研究所

<120> 与小麦粒重相关的SNP分子标记的应用

<130> 211240

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtcgga gtcaacggat tgccatacat acatgcacgg aa 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tgccatacat acatgcacgg at 42

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacgtaccg tacatgcttg ag 22

<210> 4

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccccacatac gacgtaccgt acatgcttga gctcaggcta ttcgattcga wtccgtgcat 60

gtatgtatgg cccaatygat ggagctatac cggctgtagc c 101