黑木耳凝集素的提取方法

技术领域

本发明涉及一种黑木耳凝集素的提取方法。

背景技术

黑木耳是常见的食用菌,不仅营养丰富,还具有众多的生物活性。近年来对黑木耳多糖研究较多,对于其他成分研究较少，凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球(含血型物质)，故名凝集素。常用的为植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，通常以其被提取的植物命名。凝集素是动物细胞和植物细胞都能够合成和分泌的、能与糖结合的蛋白质，在细胞识别和粘着反应中起重要作用，主要是促进细胞间的粘着。凝集素具有一个以上同糖结合的位点，因此能够参与细胞的识别和粘着，将不同的细胞联系起来。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种黑木耳凝集素的提取方法。

黑木耳凝集素的提取方法按照以下步骤进行：

一、称取干燥的黑木耳5g，加入100m L的磷酸盐缓冲液，在捣碎机中充分搅碎至粘稠的匀浆，每5min搅碎2次，两次之间将黑木耳匀浆放入冰浴中制冷3min，将黑木耳匀浆以5000r/min冷冻离心30min，收集上清液后采用四层FN 15膜高压过滤，滤液为黑木耳凝集素粗提液3MTHS1-0；

二、将25mL 3MTHS1-0与25mL猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B充分混合，于6℃搅拌过夜，次日以3000r/min离心5min，得到上清液3MTHS1-1；

三、将步骤二离心后的下层液分别用10mL PBS缓冲液洗三次，以3000r/min离心速率离心5min，弃去上清液；

四、解离：向步骤三所得的溶液中加入10mL甘氨酸浓度为0.1mol/L、NaCl浓度为1mol/L、pH值为3.0的溶液，充分摇匀10min，以3000r/min离心速率离心5min，在得到的上清中加入Tris-HCl缓冲溶液；

五、重复步骤四三次，并将三次得到的溶液合并，得到溶液3MTHS1-2；

六、向步骤四中弃去上清液后的溶液中加入2ml浓度为1mol/L、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲溶液和25mL PBS缓冲溶液，以3000r/min离心5min，清洗2次；

七、将3MTHS1-1按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液1；

八、将3MTHS1-0按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液2；

九、将提取液1、提取液2和溶液3MTHS1-2合并，进行5kDa超滤除盐，凝缩至2mL，再用10kDa的超滤离心管以4400r/min继续超滤至0.5mL，超滤过程中加水除盐3次，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素。

步骤一中所述磷酸盐缓冲液浓度为10mmol/L、pH值为7.6。

步骤四中按照每10mL上清中加入1mL Tris-HCl缓冲溶液的比例加入Tris-HCl缓冲溶液。

步骤四中所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为1mol/L、pH值为7.8。

用全自动氨基酸分析仪分析黑木耳凝集素中氨基酸组分，发现黑木耳凝集素含有较多酸性氨基酸，天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)分别为11.83％和13.46％。但黑木耳凝集素含碱性氨基酸较少，赖氨酸(Lys)含量为2.03％、组氨酸(His)含量为3.14％和精氨酸(Arg)含量为2.42％。

黑木耳凝集素对RAW264.7细胞无细胞毒性，而且可以提高RAW264.7细胞的增殖活性、核酸代谢活性和吞噬能力。

首次对黑木耳凝集素进行免疫活性分析，发现黑木耳凝集素具有免疫调节活性，且以不依赖LPS的方式能够刺激RAW264.7细胞调节炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌、NO的分泌以及iNOS、COX-2蛋白的分泌；LPS耐受性可降低黑木耳凝集素分泌炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α，LPS耐受性不会影响黑木耳凝集素对NO的分泌。

黑木耳凝集素可上调MAPK通路关键蛋白ERK1/2和p38磷酸化水平，通过MAPK通路分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α及NO。

黑木耳凝集素可上调NF-κB通路关键蛋白NF-κB p50和NF-κB p65上调，可通过NF-κB通路分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α及NO。

发明点：

首次从黑木耳中提取出一种新型凝集素LAA，其分子量为20KDa，对黑木耳凝集素分析氨基酸组分，丰富了食用菌凝集素的种类。

首次对黑木耳凝集素进行免疫活性研究，发现黑木耳凝集素以不依赖LPS的形式促进IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、iNOS和COX-2的分泌。

本发明首次探索出黑木耳凝集素可以通过MAPK通路和NF-κB通路上调IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子和NO的产生。为免疫调节药物的研发以及黑木耳的开发利用奠定坚实的理论基础。

附图说明

图1是实验一中黑木耳凝集素相对分子质量测试图；图2是实验一中标准物质测试曲线图；图3是实验一中黑木耳凝集素蛋白质鉴定一级质谱图；图4是实验一中黑木耳凝集素蛋白质鉴定二级质谱图；图5是实验一中用Uniprot数据库比较图；图6是实验一中黑木耳凝集素的温度依赖性图；图7是实验一中黑木耳凝集素的温度稳定性图；图8是实验一中黑木耳凝集素的血凝集反应结果图；图9是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞毒性影响图；图10是实验一中黑木耳凝集素处理RAW264.7细胞形态变化的倒置显微镜图片(200×)，图中A:阴性对照；B：1μg/mL LPS；C-I为黑木耳凝集素浓度为：1,5,10,15,25,50,100μg/mL；图11是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞增殖活性影响图；图12是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞吞噬能力影响图；图13是实验一中不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞核酸代谢活性影响图；图14是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞分泌炎性因子IL-1β释放量的影响图；图15是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞分泌炎性因子IL-6释放量的影响图；图16是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞分泌炎性因子TNF-α释放量的影响图；图17是实验一中黑木耳凝集素对RAW264.7细胞细胞产生NO的影响图；图18是实验一中不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞表达iNOS蛋白结果图；图19是实验一中不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞产生COX-2蛋白表达结果图；图20是实验一中黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子IL-1β释放量的影响图；图21是实验一中黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子IL-6释放量的影响图；图22是实验一中黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子TNF-α释放量的影响图；图23是实验一中黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞产生炎性因子IL-1β释放量的影响图；图24是实验一中黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞产生炎性因子IL-6释放量的影响图；图25是实验一中黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞产生炎性因子TNF-α释放量的影响图；图26是实验一中PMB对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生NO的影响图；图27是实验一中黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞产生NO的影响图；图28是实验一中LPS耐受性对RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响图；图29是实验一中LPS耐受性对RAW264.7细胞分泌IL-6的影响图；图30是实验一中LPS耐受性对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响图；图31是实验一中LPS耐受性对RAW264.7细胞分泌NO的影响图；图32是实验一中黑木耳凝集素作用对RAW264.7细胞产生p-ERK1/2、p-p38蛋白表达结果对比图；图33是实验一中ERK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎性因子的影响图；图34是实验一中ERK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生NO的影响图；图35是实验一中JNK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎性因子的影响图；图36是实验一中JNK抑制剂对凝集素LAA(黑木耳凝集素)诱导RAW264.7细胞产生NO的影响图；图37是实验一中p38抑制剂对凝集素LAA(黑木耳凝集素)诱导RAW264.7细胞产生炎性因子的影响图；图38是实验一中p38抑制剂对凝集素LAA(黑木耳凝集素)诱导RAW264.7细胞产生NO的影响图；图39是实验一中黑木耳凝集素作用对RAW264.7细胞产生NF-κB p50、NF-κB p65蛋白表达结果图；图40是实验一中PDTC对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎性因子的影响图；图41是实验一中PDTC对凝集素LAA(黑木耳凝集素)诱导RAW264.7细胞产生NO的影响图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式一、称取干燥的黑木耳5g，加入100m L的磷酸盐缓冲液，在捣碎机中充分搅碎至粘稠的匀浆，每5min搅碎2次，两次之间将黑木耳匀浆放入冰浴中制冷3min，将黑木耳匀浆以5000r/min冷冻离心30min，收集上清液后采用四层FN 15膜高压过滤，滤液为黑木耳凝集素粗提液3MTHS1-0；

二、将25mL 3MTHS1-0与25mL猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B充分混合，于6℃搅拌过夜，次日以3000r/min离心5min，得到上清液3MTHS1-1；

三、将步骤二离心后的下层液分别用10mL PBS缓冲液洗三次，以3000r/min离心速率离心5min，弃去上清液；

四、解离：向步骤三所得的溶液中加入10mL甘氨酸浓度为0.1mol/L、NaCl浓度为1mol/L 、pH值为3.0的溶液，充分摇匀10min，以3000r/min离心速率离心5min，在得到的上清中加入Tris-HCl缓冲溶液；

五、重复步骤四三次，并将三次得到的溶液合并，得到溶液3MTHS1-2；

六、向步骤四中弃去上清液后的溶液中加入2ml浓度为1mol/L、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲溶液和25mL PBS缓冲溶液，以3000r/min离心5min，清洗2次；

七、将3MTHS1-1按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液1；

八、将3MTHS1-0按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液2；

九、将提取液1、提取液2和溶液3MTHS1-2合并，进行5kDa超滤除盐，凝缩至2mL，再用10kDa的超滤离心管以4400r/min继续超滤至0.5mL，超滤过程中加水除盐3次，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述磷酸盐缓冲液浓度为10mmol/L、pH值为7.6。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤四中按照每10mL上清中加入1mL Tris-HCl缓冲溶液的比例加入Tris-HCl缓冲溶液。其他与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤四中所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为1mol/L、pH值为7.8。其他与具体实施方式一至三之一相同。

采用下述实验验证本发明效果：

实验一：

黑木耳凝集素的提取方法按照以下步骤进行：

一、称取干燥的黑木耳5g，加入100m浓度为10mmol/L、pH值为7.6的磷酸盐缓冲液，在捣碎机中充分搅碎至粘稠的匀浆，每5min搅碎2次，两次之间将黑木耳匀浆放入冰浴中制冷3min，将黑木耳匀浆以5000r/min冷冻离心30min，收集上清液后采用四层FN 15膜高压过滤，滤液为黑木耳凝集素粗提液3MTHS1-0；

二、将25mL 3MTHS1-0与25mL猪胃粘蛋白II型-溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B充分混合，于6℃搅拌过夜，次日以3000r/min离心5min，得到上清液3MTHS1-1；

三、将步骤二离心后的下层液分别用10mL PBS缓冲液洗三次，以3000r/min离心速率离心5min，弃去上清液；

四、解离：向步骤三所得的溶液中加入10mL甘氨酸浓度为0.1mol/L、NaCl浓度为1mol/L 、pH值为3.0的溶液，充分摇匀10min，以3000r/min离心速率离心5min，在得到的上清中按照每10mL上清中加入1mL Tris-HCl缓冲溶液的比例加入Tris-HCl缓冲溶液，所述Tris-HCl缓冲溶液浓度为1mol/L、pH值为7.8；

五、重复步骤四三次，并将三次得到的溶液合并，得到溶液3MTHS1-2；

六、向步骤四中弃去上清液后的溶液中加入2ml浓度为1mol/L、pH值为7.8的Tris-HCl缓冲溶液和25mL PBS缓冲溶液，以3000r/min离心5min，清洗2次(中和并回收亲和层析柱)；

七、将3MTHS1-1按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液1；

八、将3MTHS1-0按照步骤二-步骤五的步骤重复提取，得到提取液2；

九、将提取液1、提取液2和溶液3MTHS1-2合并，进行5kDa超滤除盐，凝缩至2mL，再用10kDa的超滤离心管以4400r/min继续超滤至0.5mL，超滤过程中加水除盐3次，冷冻干燥，即得黑木耳凝集素。

1凝集素的结构鉴定结果

1.1相对分子质量的测定结果

黑木耳凝集素运用基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱(5800MALDI

-TOF/TOF)，经过点样、校准测试、测试样品及质谱数据处理，最终测定相对分子量为18913.22，测定结果如图1所示，标准物质测试曲线图如图2所示；

黑木耳凝集素相对分子质量测试质谱显示，这三个峰由于质荷比成倍数关系，判定均为黑木耳凝集素，第一个峰为三电荷电离质荷比为6303.5361，第二个峰为双电荷下电离质荷比为9472.3320，第三个峰为单电荷下电离质荷比为18913.2246，第一个峰下面的质荷比推测为高分子聚合物、后期包装材料的残渣(如EP管残留物)等物质，并非测试样品黑木耳凝集素，这是由于基质辅助激光解吸-电离飞行时间质谱(5800MALDI-TOF/TOF)非常灵敏，能够检测到非常细微的物质造成的。因此确定黑木耳凝集素相对分子质量为18913.22。

1.2蛋白质鉴定结果

黑木耳凝集素通过质谱仪(Applied Biosystem,MALDI-TOF/TOF 5800型)进行蛋白质鉴定(一级质谱、二级质谱图见图3、图4)。经过UniProt数据库比对(见图5)，分析得出该凝集素可能含有以下4条肽段，其氨基酸序列分别为QIDAERK、TNHSVVTWNDK、RLNFTAGNPFPR、VRELEQQVDSMTK。在已有的黑木耳蛋白质质谱库中未发现该序列的存在，推断此为黑木耳中的新型蛋白质，并确定是一种新的凝集素。

1.3N-末端氨基酸序列分析结果

经全自动蛋白质多肽测序仪测定，黑木耳凝集素的N-末端十三个氨基酸序列为ITAPTTTSSAATE。

1.4温度依赖性试验结果

凝集素3MTHS1-2在不同温度条件下作用10min后血凝集反应结果如图6所示。

通过温度依赖性试验可以得出在20℃～50℃条件下作用10min，黑木耳凝集素的血凝集活性比较稳定，与室温条件下血凝集活性相同为2

2凝集素的性质鉴定结果

2.1温度稳定性试验结果

黑木耳凝集素在50℃下作用不同时间的血凝集反应结果如图7所示。

通过温度稳定性试验结果显示，黑木耳凝集素在50℃条件下处理10min～40min后，溶液的血凝集活性未发生改变，与室温条件下凝集活性相同为2

2.2pH值依赖性试验结果

经过不同pH值缓冲溶液处理后的黑木耳凝集素的血凝集反应结果如图8所示。

用不同pH缓冲溶液处理后，黑木耳凝集素的血凝集反应结果显示，该凝集素耐酸性比耐碱性强。pH值为3.5时凝集活性为2

2.3糖特异性试验结果

黑木耳凝集素在不同糖及蛋白溶液作用下的血凝集反应结果如表2-1所示。

表2-1黑木耳凝集素的糖特异性

试验结果显示D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-木糖(D-Xyl)、D-甘露糖(D-Man)、D-果糖(D-Fru)、L-鼠李糖(L-Rha)溶液作用凝集素后凝集活性均为2

2.4金属离子依赖性试验结果

黑木耳凝集素经过含有EDTA·2Na的缓冲液透析后进行血凝集反应，凝集活性并未消失。在含有氯化钙(CaCl

3.1黑木耳凝集素氨基酸分析结果

将纯化的黑木耳凝集素水解，因为氨基酸酸水解可以破坏色氨酸，故未检测色氨酸含量。水解后用全自动氨基酸分析仪分析氨基酸组成测定。结果如表3-1所示，黑木耳凝集素含有较多酸性氨基酸，天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)分别为11.83％和13.46％。但黑木耳凝集素含碱性氨基酸较少，赖氨酸(Lys)含量为2.03％、组氨酸(His)含量为3.14％和精氨酸(Arg)含量为2.42％。凝集素中有很多都含有丰富的酸性氨基酸，如青蛤凝集素(CGL)、海鞘凝集素(DTL-A)、海绵凝集素(CAL)等。

表3-1黑木耳凝集素的氨基酸组成

色氨酸—未检测

3.2黑木耳凝集素对RAW264.7细胞中活性物质的影响

3.2.1黑木耳凝集素对RAW264.7细胞毒性结果

通过细胞坏死引起细胞膜结构性破坏，会使细胞内稳定的乳酸脱氢酶(LDH)释放出来。所以通过检测LDH的含量，来确定黑木耳凝集素对RAW264.7细胞的毒性。根据这个原理设计实验，结果如图9所示，检测黑木耳凝集素在100μg/mL内对RAW264.7细胞毒性，发现随着黑木耳凝集素浓度的增加，LDH分泌量液逐渐增多，但是与空白对照组相比没有显著性差异，说明黑木耳凝集素在100μg/mL内对RAW264.7细胞没有毒性。

3.2.2黑木耳凝集素对RAW264.7细胞形态学的影响

为了研究黑木耳凝集素对RAW264.7细胞形态影响，用不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞处理24h后，通过倒置显微镜放大200倍观察。结果如图3-7所示。未加药处理组(阴性对照)细胞为圆形、光亮(图10A)。LPS可以活化巨噬细胞，诱导细胞分化、增殖。用1μg/mL LPS处理组(阳性对照)细胞出现了典型的活化后特征：细胞体积增大、细胞形态变为多边形、长梭形(图10B)。用不同浓度黑木耳凝集素处理RAW264.7细胞，与阳性对照组相比，细胞形态发生改变，出现了活化特征(图10C-I)。说明黑木耳凝集素可以活化RAW264.7细胞。

3.2.3黑木耳凝集素对RAW264.7细胞增殖活性影响

采用CCK-8法检测黑木耳凝集素对RAW264.7细胞增殖活性的影响。实验结果如图11(Means±SD(n＝3),one-way ANOVA,*p<0.05，表示处理组与对照组存在差异性显著；**p<0.001,表示处理组与对照组差异极显著)所示：黑木耳凝集素在1μg/mL时，可以促进RAW264.7细胞的增殖。在5μg/mL-10μg/mL时，以浓度依赖性极显著促进RAW264.7细胞的增殖活性，在10μg/mL时，对RAW264.7细胞的增殖活性最强。超过10μg/mL后，RAW264.7细胞的增殖活性，随着黑木耳凝集素浓度的增加而降低；当黑木耳凝集素浓度高于25μg/mL时，RAW264.7细胞的增殖活性变化不大，但是均可促进RAW264.7细胞的增殖。结果表明，黑木耳凝集素在100μg/mL内均可提高RAW264.7细胞的增殖活性，在10μg/mL时具有最大增值率。综合上述结果，黑木耳凝集素可以促进RAW264.7细胞的增殖，为进一步研究黑木耳凝集素的免疫活性作用奠定基础。

3.2.4黑木耳凝集素对RAW264.7细胞吞噬能力影响

巨噬细胞在机体中主要是起到吞噬异物的作用，所以对巨噬细胞吞噬能力的考察是研究其免疫活性的重要手段。采用中性红法检测黑木耳凝集素对RAW264.7细胞吞噬能力的影响。实验结果如图12所示：当黑木耳凝集素在1μg/mL时，可以促进RAW264.7细胞的吞噬能力。黑木耳凝集素在5μg/mL-10μg/mL时，以浓度依赖性极显著促进RAW264.7细胞的吞噬能力，在10μg/mL时，对RAW264.7细胞的吞噬能力最强。当黑木耳凝集素浓度高于50μg/mL时，RAW264.7细胞的吞噬能力变化不大，但是均可促进RAW264.7细胞的吞噬能力。结果表明：黑木耳凝集素在100μg/mL内均可提高RAW264.7细胞的吞噬能力，总体呈现先增高后下降的趋势，且在10μg/mL时作用效果最强。综合上述结果，黑木耳凝集素可以提高RAW264.7细胞的吞噬能力，说明黑木耳凝集素可以调节细胞的免疫功能。

3.2.5黑木耳凝集素对RAW264.7细胞中核酸代谢活性影响

利用吖啶橙荧光染色法检测黑木耳凝集素对RAW264.7细胞核酸代谢活性的影响。实验结果如图13所示：黑木耳凝集素在1μg/mL时，与阴性对照组相比，可以提高RAW264.7细胞核酸荧光相对比列。随着黑木耳凝集素浓度的提高，RAW264.7细胞核酸荧光强度相对比例也逐渐增强。当黑木耳凝集素浓度在10μg/mL时，对RAW264.7细胞核酸荧光强度相对比例的作用效果最强。当超过15μg/mL后，随着浓度的增加对RAW264.7细胞核酸核酸荧光强度相对比例的影响逐渐降低。结果表明：黑木耳凝集素在100μg/mL内均可促进RAW264.7细胞的核酸荧光强度相对比例，且在10μg/mL时核酸荧光强度相对比例最佳。综合上述实验结果，黑木耳凝集素可以提高RAW264.7细胞核酸代谢活性。

3.3黑木耳凝集素对RAW264.7细胞产生炎症因子和NO的影响

活化的巨噬细胞可以分泌多种细胞因子。NO是免疫药理学的关键分子，可以抑制或杀死机体中的多种微生物，参与免疫调节、炎症反应，所以NO是考察巨噬细胞免疫活性的重要指标。NO是一氧化氮合酶(iNOS)在细胞受到刺激而产生的，因此可以用NO的分泌量间接地推断iNOS的表达量。COX-2是诱导酶，当遇到刺激后在巨噬细胞中高度表达。IL-1β、IL-6、TNF-α是较重要的促炎症因子，是由活化的巨噬细胞分泌的。IL-6和IL-1β在免疫系统发挥重要作用。TNF-α可以抑制或杀死肿瘤细胞，在抗肿瘤方面具有重要作用。因此本研究选择IL-1β、IL-6、TNF-α、NO以及iNOS、COX-2表达量进行详细研究，探讨黑木耳凝集素对RAW264.7细胞的免疫调节作用。

3.3.1黑木耳凝集素对RAW264.7细胞释放炎症因子的影响

IL-1β、IL-6和TNF-α是较重要的促炎症因子，可以作为重要的免疫介质对机体的炎症起到重要作用。利用ELISA检测试剂盒检测黑木耳凝集素对RAW264.7细胞释放IL-1β、IL-6和TNF-α的影响，结果如图3-11所示：阴性对照组中IL-1β的浓度为7.24pg/mL，用1μg/mL凝集素LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)处理后，分泌IL-1β的浓度为18.45pg/mL，随着凝集素LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)浓度的升高，在5μg/mL时，IL-1β的浓度与阴性对照组相比呈现极显著差异(图14)；在10μg/mL时，IL-1β的浓度达到最大。阴性对照组中IL-6的浓度为47.15pg/mL，用1μg/mL黑木耳凝集素处理后，分泌IL-6的浓度为145.52pg/mL，与阴性对照组相比呈现极显著差异(图15)；随着黑木耳凝集素浓度的升高，在10μg/mL时，IL-6的浓度达到最大。阴性对照组中TNF-α的浓度为62.71pg/mL，用1μg/mL黑木耳凝集素处理后，分泌TNF-α的浓度为126.64pg/mL，随着黑木耳凝集素浓度的升高，在5μg/mL时，TNF-α的浓度与阴性对照组相比呈现极显著差异(图16)；在10μg/mL时，TNF-α的浓度达到最大。

结果表明：黑木耳凝集素可以促进炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的产生，总体呈现上升趋势，且在10μg/mL时，RAW264.7细胞释放IL-1β浓度为61.267pg/mL、IL-6浓度为572.48pg/mL和TNF-α浓度为489.19pg/mL；经过LPS处理后，RAW264.7细胞释放IL-1β浓度为71.02pg/mL、IL-6浓度为733.76pg/mL和TNF-α浓度为666.17pg/mL，但最高浓度黑木耳凝集素的刺激作用均未超过LPS处理组，所以黑木耳凝集素的这种免疫促进作用与LPS相比还存在差距。

3.3.2黑木耳凝集素对RAW264.7细胞产生NO的影响

用Griess法检测不同浓度黑木耳凝集素处理24h后NO含量，结果如图17所示：阴性对照组中NO的浓度为17.91μM，用1μg/mL黑木耳凝集素处理后，分泌NO的浓度为38.75μM；在5μg/mL时，NO的分泌量与阴性对照组相比呈现极显著差异。结果表明：黑木耳凝集素以剂量依赖性方式促进NO的产生，且在10μg/mL时，RAW264.7细胞分泌NO最多，为76.25μM；LPS处理后，分泌NO的浓度为80.41μM，但最高浓度黑木耳凝集素的刺激作用均为超过LPS，说明黑木耳凝集素的这种免疫促进作用与LPS相比还存在差距。

3.3.3黑木耳凝集素对RAW264.7细胞表达iNOS和COX-2的影响

3.3.3.1黑木耳凝集素对RAW264.7细胞表达iNOS蛋白的影响

考察不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞处理后，用Western blot法分析黑木耳凝集素对RAW264.7细胞中iNOS蛋白表达量(β-actin作内参)的影响，结果如图18所示：与空白对照组相比，1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的黑木耳凝集素均可以促进RAW264.7细胞中iNOS蛋白表达量，且在5μg/mL时iNOS蛋白的表达最高

3.3.3.2黑木耳凝集素对RAW264.7细胞表达COX-2蛋白的影响

考察不同浓度黑木耳凝集素对RAW264.7细胞处理后，用Western blot法分析黑木耳凝集素对RAW264.7细胞中COX-2蛋白表达量(β-actin作内参)的影响，结果如图19所示：与空白对照组相比，1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的黑木耳凝集素均可以促进RAW264.7细胞中COX-2蛋白表达量，且在5μg/mL时COX-2蛋白的表达最高。

3.4黑木耳凝集素以不依赖LPS的方式产生炎症因子和NO

3.4.1黑木耳凝集素以不依赖LPS的方式释放炎症因子

3.4.1.1PMB抑制剂对RAW264.7细胞释放炎症因子的影响

Polymyxin B(PMB)是带正电的抗生素，可以与带负电的LPS结合，被当做LPS抑制剂，抑制LPS活化巨噬细胞。先用PMB处理RAW264.7细胞后，再次用LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)或LPS处理24h，用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量。结果如图20-21所示：LPS处理组与PMB+LPS处理组相比，PMB+LPS处理组IL-1β分泌量为12.41pg/mL，呈现极显著差异，说明试验所用PMB与LPS结合后，可以抑制LPS活化RAW264.7细胞分泌炎症因子。LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)处理组与LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)+PMB处理组相比，LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)+PMB处理组IL-1β分泌量并没有减少(图20)，这说明黑木耳凝集素没有被LPS污染。用相同的方法处理检测后，发现PMB+LPS处理组释放IL-6为50.09pg/mL和TNF-α为77.47pg/mL，呈现极显著差异，而LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)+PMB处理组IL-6和TNF-α分泌量并没有减少(图21和图22)。结果表明：用PMB处理后，黑木耳凝集素处理RAW264.7细胞，并没有减少炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量，说明试验所用黑木耳凝集素没有被LPS污染。

3.4.1.2黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞释放炎症因子的影响

利用凝集素是蛋白质的特性，加热后蛋白质变性，丧失生物活性。但LPS耐热不会因加热而失活。将黑木耳凝集素和LPS沸水浴处理10min后，用加热后LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)或LPS处理24h，用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量。结果如图23-24所示：加热后LPS处理组与LPS处理组相比，IL-1β分泌量没有显著性差异，这说明加热不能使LPS失活。而LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)处理组与加热后LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)处理组相比，加热后LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)处理组分泌IL-1β分泌量明显降低(图23)，呈现极显著差异，这说明加热使LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)失活，不能分泌IL-1β。用同样的方式处理检测后，发现IL-6和TNF-α的释放量显著减少，呈现极显著差异，而加热后LPS处理组IL-6和TNF-α分泌量并没有减少(图24和图25)。结果表明：用加热处理后，LPS不会失活，具有诱导RAW264.7产生炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的能力；而LAA(黑木耳凝集素)(黑木耳凝集素)蛋白质变性失活，丧失诱导RAW264.7分泌炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的能力，这说明试验所用黑木耳凝集素没有被LPS污染。

3.4.2黑木耳凝集素以不依赖LPS的方式产生NO。

3.4.2.1PMB抑制剂对RAW264.7细胞产生NO的影响

先用PMB处理RAW264.7细胞后，再用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理24h，用Griess法检测黑木耳凝集素产生NO的量。结果如图26所示：LPS处理组与PMB+LPS处理组相比，PMB+LPS处理组NO分泌量明显降低，呈现极显著差异，这说明实验所用PMB可以与LPS结合，使LPS失去激活RAW264.7细胞的能力。而LAA(黑木耳凝集素)处理组与LAA(黑木耳凝集素)+PMB处理组相比，LAA(黑木耳凝集素)+PMB处理组NO分泌量并没有减少，这说明试验所用黑木耳凝集素不能与PMB结合，所以试验所用黑木耳凝集素没有被LPS污染。

3.4.2.2黑木耳凝集素加热处理后对RAW264.7细胞产生NO的影响

用加热后LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理RAW264.7细胞24h后，用Griess法检测黑木耳凝集素产生NO的量。结果如图27所示：加热后LPS处理组与LPS处理组相比，NO分泌量没有显著性差异，这说明加热不能使LPS失活。而LAA(黑木耳凝集素)处理组与加热后LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，加热后LAA(黑木耳凝集素)处理组分泌NO分泌量明显降低，呈现极显著差异，这说明加热使LAA(黑木耳凝集素)失活，不能分泌NO。实验表明：试验所用黑木耳凝集素没有被LPS污染。

综合PMB和加热处理试验，可以证明试验所用黑木耳凝集素没有被LPS污染，可用于后续MAPK和NF-κB信号通路的研究。

3.5LPS耐受性对黑木耳凝集素释放炎症因子和NO的影响

细菌内毒素刺激巨噬细胞后会引起强烈的炎症反应，包括细胞激素及炎性因子的过表达，细胞以少量细菌内毒素刺激后，将会对再一次大量的细菌内毒素刺激降低反应，此现象称为内毒素耐受性(LPS tolerance)。LPS耐受性是细胞自我保护的机制，可以降低在次感染的炎症反应。本研究探索黑木耳凝集素是否能通过诱导LPS耐受性反应，减少细菌内毒素诱导巨噬细胞产生炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及NO。

3.5.1LPS耐受性对黑木耳凝集素释放IL-1β的影响

RAW264.7细胞用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理后，更换培养基再用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理，收集细胞培养液，用ELISA检测IL-1β的分泌量。结果如图28所示：用PBS培养的RAW264.7细胞分泌IL-1β的分泌量非常少，这说明PBS不能诱导RAW264.7细胞分泌IL-1β，实验组用PBS处理不会对实验结果产生影响。LPS+LPS处理组与PBS+LPS处理组相比，LPS+LPS处理组分泌IL-1β的量明显减少，呈现极显著差异，这说明出现了LPS耐受性。LAA(黑木耳凝集素)+LPS处理组与PBS+LPS处理组相比，LAA(黑木耳凝集素)+LPS处理组分泌IL-1β的量明显减少，呈现显著性差异，这说明LPS耐受性降低了IL-1β的分泌量。通过这个结果证明，当受到细菌LPS刺激后，黑木耳凝集素可以有效地降低IL-1β的分泌量。

3.5.2LPS耐受性对黑木耳凝集素释放IL-6的影响

RAW264.7细胞用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理后，更换培养基再用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理，收集细胞培养液，用ELISA检测IL-6的分泌量。结果如图29所示：用PBS培养的RAW264.7细胞分泌IL-6的量非常少，这说明PBS不能诱导RAW264.7细胞分泌IL-6，实验组用PBS处理不会对实验结果产生影响。LPS+LPS处理组与PBS+LPS处理组相比，LPS+LPS处理组分泌IL-6的量明显减少，呈现极显著差异，这说明出现了LPS耐受性。LAA(黑木耳凝集素)+LPS处理组与PBS+LPS处理组相比，LAA(黑木耳凝集素)+LPS处理组分泌IL-6的量明显减少，呈现极显著差异，LPS耐受性降低了IL-6的分泌量。通过这个结果证明，当受到细菌LPS的刺激后，黑木耳凝集素可以有效地降低IL-6的分泌量。

3.5.3LPS耐受性对黑木耳凝集素释放TNF-α的影响

RAW264.7细胞用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理后，更换培养基再用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理，收集细胞培养液，收集细胞培养液，用ELISA检测TNF-α的分泌量。结果如图30：用PBS培养的RAW264.7细胞分泌TNF-α的量非常少，这说明PBS不能诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α，实验组用PBS处理不会对实验结果产生影响。LPS+LPS处理组与PBS+LPS处理组相比，LPS+LPS处理组分泌TNF-α的量明显减少，呈现极显著差异，这说明出现了LPS耐受性。LAA(黑木耳凝集素)+LPS处理组与PBS+LPS处理组相比，LAA(黑木耳凝集素)+LPS处理组分泌TNF-α的量明显减少，呈现显著性差异，这说明LPS耐受性降低了TNF-α的分泌量。通过这个结果证明，当受到细菌LPS的刺激后，黑木耳凝集素可以有效地降低TNF-α的分泌量。

3.5.4LPS耐受性对黑木耳凝集素释放NO的影响

巨噬细胞RAW264.7用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理24h后，更换培养基再用LAA(黑木耳凝集素)或LPS处理24h，收集细胞培养液，用Griess检测NO的分泌量。结果如图31：用PBS培养的RAW264.7细胞分泌NO的量非常少，这说明PBS不能诱导RAW264.7细胞分泌NO，实验组用PBS处理不会对实验结果产生影响。LPS+LPS处理组与PBS+LPS处理组相比，LPS+LPS处理组分泌NO的量明显减少，呈现极显著差异，这说明出现了LPS耐受性。LAA(黑木耳凝集素)+LPS处理组与PBS+LPS处理组相比，LAA(黑木耳凝集素)+LPS处理组分泌NO的量没有减少，这说明LPS耐受性不能降低RAW264.7细胞分泌NO。通过这个结果证明，当受到细菌LPS的刺激后，黑木耳凝集素不能降低NO的分泌量。

综合上述实验结果可知，当被细菌LPS刺激后，凝集素LAA(黑木耳凝集素)可以有效地降低细RAW264.7细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α，降低由LPS的炎症反应对机体的损伤，可以用来治疗由内毒素引发的炎症反应。

3.6黑木耳凝集素对RAW264.7细胞胞内MAPK通路的影响

MAPK在巨噬细胞AP-1诱导炎症反应中处于重要的地位，是治疗的重要位点。LPS可以刺激一些激酶(如MAPK、MAPKK、MAPKKK)激活单核巨噬细胞中的JNK、ERK和p38，使MAPK被激活，诱导炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及NO的分泌。本研究用不同浓度抑制剂抑制MAPK通路，探索黑木耳凝集素是否通过活化MAPKs，诱导巨噬细胞活化、炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及NO的分泌。

3.6.1黑木耳凝集素对RAW264.7细胞胞内MAPK通路蛋白的影响

考察黑木耳凝集素对RAW264.7细胞不同处理时间后，用Western blot分析对细胞胞内MAPK通路p-ERK1/2和p-p38蛋白表达量的影响。实验结果如图32A所示：与阴性对照组相比，黑木耳凝集素可以促进MAPK蛋白的磷酸化。通过对条带灰度分析，结果如图32B-C所示，黑木耳凝集素处理RAW264.7细胞30min后p-ERK1/2和p-p38蛋白表达量最多。结果表明：黑木耳凝集素可以活化MAPK通路相关蛋白，且在30min时效果最好。

3.6.2ERK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子和NO的影响

3.6.2.1ERK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞释放炎症因子的影响

ERK最常见的抑制剂PD98059，可以抑制ERK1/2的活化。先用5μM、10μM和20μMPD98059处理RAW264.7细胞后，再用黑木耳凝集素处理，ELISA试剂盒检测炎症因子的释放量。结果如图3-24所示：LAA(黑木耳凝集素)处理组IL-1β分泌量为61.17pg/mL；5μM、10μM和20μM PD98059处理后，IL-1β分泌量分别为：59.54pg/mL、54.37pg/mL、50.27pg/mL，其中用20μM PD98059+LAA(黑木耳凝集素)处理后IL-1β分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比呈现显著性差异(图33A)。LAA(黑木耳凝集素)处理组IL-6分泌量为637.35pg/mL；5μM、10μM和20μM PD98059处理后，IL-6分泌量分别为：602.18pg/mL、568.72pg/mL、490.29pg/mL，用5μM PD98059+LAA(黑木耳凝集素)处理后IL-6分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，呈现显著性差异；当PD98059抑制剂浓度大于10μM后，IL-6分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比呈现极显著差异(图33B)。LAA(黑木耳凝集素)处理组TNF-α分泌量为502.53pg/mL；5μM、10μM和20μM PD98059处理后，TNF-α分泌量分别为：494.20pg/mL、459.67pg/mL、423.66pg/mL，用10μM PD98059+LAA(黑木耳凝集素)处理后TNF-α分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，TNF-α分泌量呈现显著性差异；20μM PD98059+LAA(黑木耳凝集素)处理后TNF-α分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，TNF-α分泌量呈现极显著差异(图33C)。综上所述，PD98059+LAA(黑木耳凝集素)处理组与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，总体呈现下降趋势。黑木耳凝集素可以通过MAPK/ERK信号通路诱导炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。

3.6.2.2ERK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生NO的影响

用5μM、10μM和20μM PD98059处理RAW264.7细胞后，再用黑木耳凝集素处理，Griess法检测NO的产生量。结果如图34所示：LAA(黑木耳凝集素)处理组NO分泌量为76.25μM；5μM、10μM和20μM PD98059处理后，TNF-α分泌量分别为：72.08μM、67.91μM、59.58μM，用20μM PD98059+LAA(黑木耳凝集素)处理后NO分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，NO分泌量呈现显著性差异(图34)。综上所述，PD98059+LAA(黑木耳凝集素)处理组与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，总体呈现下降趋势，黑木耳凝集素可以通过MAPK/ERK信号通路诱导NO的分泌。

3.6.3JNK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子和NO的影响

3.6.3.1JNK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞释放炎症因子的影响

SP600125是JNK抑制剂，它可以抑制JNK1/2的磷酸化和激活。用0.5μM、1μM和3μMSP600125处理RAW264.7细胞后，再用黑木耳凝集素处理，ELISA试剂盒检测炎症因子的释放量。结果如图35所示：LAA(黑木耳凝集素)处理组IL-1β分泌量为61.17pg/mL；0.5μM、1μM和3μM SP600125处理后，IL-1β分泌量分别为：59.54pg/mL、55.80pg/mL、54.37pg/mL，虽然分泌量减少，但是与LAA(黑木耳凝集素)组相比差异性并不显著(图35A)。LAA(黑木耳凝集素)处理组IL-6分泌量为637.35pg/mL；0.5μM、1μM和3μM SP600125处理后，IL-6分泌量分别为：618.72pg/mL、586.59pg/mL、562.32pg/mL，当SP600125抑制剂浓度大于1μM后，IL-6分泌量与LAA(黑木耳凝集素)组相比，呈现极显著差异(图35B)。LAA(黑木耳凝集素)处理组TNF-α分泌量为502.53pg/mL；0.5μM、1μM和3μM SP600125处理后，TNF-α分泌量分别为：472.55pg/mL、423.22pg/mL、377.32pg/mL，当SP600125抑制剂浓度大于1μM后，TNF-α分泌量与LAA(黑木耳凝集素)组相比，呈现极显著差异(图35C)。综上所述，黑木耳凝集素可以通过MAPK/JNK信号通路诱导炎症因子IL-6和TNF-α的分泌，而黑木耳凝集素不能通过MAPK/JNK信号通路诱导炎症因子IL-1β分泌。

3.6.3.2JNK抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生NO的影响

用0.5μM、1μM和3μM SP600125处理RAW264.7细胞后，再用黑木耳凝集素处理，Griess检测NO的产生量。结果如图3-27所示：LAA(黑木耳凝集素)处理组NO分泌量为76.25μM；0.5μM、1μM和3μM SP600125处理后，TNF-α分泌量分别为：72.08μM、55.41μM、47.25μM，用1μM SP600125+LAA(黑木耳凝集素)处理后NO分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，NO分泌量呈现显著性差异(图36)。综上所述，SP600125+LAA(黑木耳凝集素)处理组与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，总体呈现下降趋势，黑木耳凝集素可以通过MAPK/JNK信号通路诱导NO的分泌。

3.6.4p38抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生炎症因子和NO的影响

3.6.4.1p38抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞释放炎症因子的影响

SB203580是一种常用的p-38抑制剂，它可以抑制p-38的磷酸化和激活。用0.25μM、0.5μM和1μM SB203580处理RAW264.7细胞后，再用黑木耳凝集素处理，ELISA试剂盒检测炎症因子的释放量。结果如图37所示：LAA(黑木耳凝集素)处理组IL-1β分泌量为61.17pg/mL；0.25μM、0.5μM和1μM SB203580处理后，IL-1β分泌量分别为：53.85pg/mL、48.90pg/mL、39.71pg/mL，当SB203580抑制剂浓度大于0.5μM后，IL-1β分泌量与LAA(黑木耳凝集素)组相比，呈现显著性差异(图37A)。LAA(黑木耳凝集素)处理组IL-6分泌量为637.35pg/mL；0.25μM、0.5μM和1μM SB203580处理后，IL-6分泌量分别为：540.95pg/mL、492.90pg/mL、458.92pg/mL，当SB203580抑制剂浓度大于0.25μM后，IL-6分泌量与LAA(黑木耳凝集素)组相比，呈现极显著差异(图37B)。LAA(黑木耳凝集素)处理组TNF-α分泌量为502.53pg/mL；0.25μM、0.5μM和1μM SB203580处理后，TNF-α分泌量分别为：494.82pg/mL、430.21pg/mL、329.02pg/mL，用0.5μM SB203580+LAA(黑木耳凝集素)处理后TNF-α分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，呈现显著性差异；用1μM SB203580+LAA(黑木耳凝集素)处理后TNF-α分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比呈现极显著差异(图37C)。综上所述，SB203580+LAA(黑木耳凝集素)处理组与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，总体呈现下降趋势，黑木耳凝集素可以通过MAPK/p-38信号通路诱导炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。

3.6.4.2p38抑制剂对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生NO的影响

用0.25μM、0.5μM和1μM SB203580处理RAW264.7细胞后，再用黑木耳凝集素处理，Griess检测NO的产生量。结果如图38所示：LAA(黑木耳凝集素)处理组NO分泌量为76.25μM；0.25μM、0.5μM和1μM SB203580处理后，TNF-α分泌量分别为：67.91μM、59.58μM、55.41μM，用1μM SB203580+LAA(黑木耳凝集素)处理后NO分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，呈现显著性差异。综上所述，SB203580+LAA(黑木耳凝集素)处理组与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，总体呈现下降趋势，黑木耳凝集素可以通过MAPK/p38信号通路诱导NO的分泌。

综合上述实验，黑木耳凝集素可以通过MAPK信号通路中的ERK、JNK和p38诱导促炎症因子IL-6和TNF-α以及炎症介质NO的分泌；通过MAPK信号通路中的ERK和p38诱导促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。

3.7黑木耳凝集素对RAW264.7细胞胞内NF-κB通路的影响

NF-κB是重要的转录因子(transcription factor)，调控许多免疫相关基因的表达，是巨噬细胞活化过程中重要的信号传导分子，本研究将探讨黑木耳凝集素是否能通过活化NF-κB，诱导炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α以及NO的分泌。

3.7.1黑木耳凝集素对RAW264.7细胞胞内NF-κB通路蛋白的影响

考察黑木耳凝集素对RAW264.7细胞处理不同时间后，用Western blot分析对细胞NF-κB p50和NF-κB p65蛋白表达量的影响。结果如图39A(Western blot分析结果图)所示：与对照组相比，黑木耳凝集素可以促进NF-κB蛋白的表达。通过对条带灰度分析，结果如图39B-C所示，黑木耳凝集素处理RAW264.7细胞20min时NF-κB p50蛋白表达量最多(38B)；黑木耳凝集素处理RAW264.7细胞60min时NF-κB p65蛋白表达量最多(38C)。结果表明：黑木耳凝集素可以激活NF-κB通路。

3.7.2PDTC对LAA(黑木耳凝集素)诱导RAW264.7细胞产生炎症因子和NO的影响

3.7.2.1PDTC对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞释放炎症因子的影响

PDTC是NF-κB常用抑制剂。用不同浓5μM、10μM和20μM PDTC处理RAW264.7细胞后，再用黑木耳凝集素处理，ELISA试剂盒检测炎症因子的释放量。结果如图40所示：LAA(黑木耳凝集素)处理组IL-1β分泌量为61.26pg/mL；5μM、10μM和20μM PDTC处理后，IL-1β分泌量分别为：55.23pg/mL、48.33pg/mL、38.28pg/mL，其中用20μM PD98059+LAA(黑木耳凝集素)处理后，IL-1β分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比呈现显著性差异(图40A)。LAA(黑木耳凝集素)处理组IL-6分泌量为572.32pg/mL；5μM、10μM和20μM PDTC处理后，IL-6分泌量分别为：527.28pg/mL、442.58pg/mL、313.49pg/mL，其中用10μM PDTC+LAA(黑木耳凝集素)处理后，IL-6分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比呈现显著性差异；20μM PDTC+LAA(黑木耳凝集素)处理后IL-6分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比呈现极显著差异(图40B)。LAA(黑木耳凝集素)处理组TNF-α分泌量为502.53pg/mL；5μM、10μM和20μM PDTC处理后，TNF-α分泌量分别为：488.30pg/mL、453.18pg/mL、428.72pg/mL，PDTC在5μM-10μM之间时TNF-α分泌量，与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比呈现显著性差异；20μM PDTC+LAA(黑木耳凝集素)处理后TNF-α分泌量，与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比呈现极显著差异(图40C)。综上所述，黑木耳凝集素可以通过NF-κB信号通路调节炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的产生。

3.7.2.2PDTC对黑木耳凝集素诱导RAW264.7细胞产生NO的影响

用PDTC处理RAW264.7细胞后，再用黑木耳凝集素处理，Griess检测NO的产生量。结果如图3-32：LAA(黑木耳凝集素)处理组NO分泌量为76.25μM；5μM、10μM和20μM PDTC处理后，NO分泌量分别为：67.92μM、55.42μM、47.08μM，20μM PDTC+LAA(黑木耳凝集素)处理后NO分泌量与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，呈现显著性差异。综上所述，PDTC+LAA(黑木耳凝集素)处理组与LAA(黑木耳凝集素)处理组相比，总体呈现下降趋势，黑木耳凝集素可以通过NF-κB信号通路诱导NO的分泌。

综合上述实验，黑木耳凝集素可以通过NF-κB信号通路诱导促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α和NO的分泌。

结论：

1.用全自动氨基酸分析仪分析黑木耳凝集素中氨基酸组分，发现黑木耳凝集素含有较多酸性氨基酸，天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)分别为11.83％和13.46％。但黑木耳凝集素含碱性氨基酸较少，赖氨酸(Lys)含量为2.03％、组氨酸(His)含量为3.14％和精氨酸(Arg)含量为2.42％。

2.黑木耳凝集素对RAW264.7细胞无细胞毒性，而且可以提高RAW264.7细胞的增殖活性、核酸代谢活性和吞噬能力。

3.首次对黑木耳凝集素进行免疫活性分析，发现黑木耳凝集素具有免疫调节活性，且以不依赖LPS的方式能够刺激RAW264.7细胞调节炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌、NO的分泌以及iNOS、COX-2蛋白的分泌；LPS耐受性可降低黑木耳凝集素分泌炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α，LPS耐受性不会影响黑木耳凝集素对NO的分泌。

4.黑木耳凝集素可上调MAPK通路关键蛋白ERK1/2和p38磷酸化水平，通过MAPK通路分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α及NO。

5.黑木耳凝集素可上调NF-κB通路关键蛋白NF-κB p50和NF-κB p65上调，可通过NF-κB通路分泌炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α及NO。

发明点：

首次从黑木耳中提取出一种新型凝集素LAA，其分子量为20KDa，对黑木耳凝集素分析氨基酸组分，丰富了食用菌凝集素的种类。

首次对黑木耳凝集素进行免疫活性研究，发现黑木耳凝集素以不依赖LPS的形式促进IL-1β、IL-6、TNF-α、NO、iNOS和COX-2的分泌。

本发明首次探索出黑木耳凝集素可以通过MAPK通路和NF-κB通路上调IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子和NO的产生。为免疫调节药物的研发以及黑木耳的开发利用奠定坚实的理论基础。