一种用于评估脱霉剂对营养物质吸附选择性的方法及应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于评估脱霉剂对营养物质吸附选择性的方法及其应用。

背景技术

真菌毒素也称霉菌毒素(Mycotoxins)，是某些真菌在生长过程中产生的次级代谢产物，目前已知有350多种不同的真菌毒素，其化学、生物学和毒理学性质多种多样。随着检测分析技术的发展，发现它们普遍存在于饲料原料和配合饲料中。

真菌在生殖繁衍过程不但会消耗饲料的营养成分，降低饲料营养价值，而且还可能产生多种对动物有毒副作用的代谢产物，饲料中常见的且对动物影响最大的真菌毒素有黄曲霉素(Aflatoxins)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone)、赭曲霉毒素A(OchratoxinA)、伏马毒素(Fumonisins)等，引起动物采食量下降、饲料转化率降低、体质下降、发病率升高以及繁殖机能下降等。真菌毒素具有广泛的致癌性(主要是肝脏和肾脏的癌变)、致突变、致畸性、生殖抑制以及免疫抑制等代谢干扰作用，真菌毒素还能通过直接或间接(如通过动物产品传播)途径污染食品，影响人类的健康。因此，对真菌毒素的脱毒研究显得十分迫切和需要，这对于人类健康与经济的发展都有非常积极的意义。

由于霉菌毒素对人畜的多方面危害，研究粮食及饲料霉菌毒素脱毒措施有重要的实际价值。目前，霉菌毒素脱毒方法可概括为机械脱毒、化学脱毒、生物脱毒、物理脱毒和添加吸附剂五大类。在工业化生产中，添加霉菌毒素吸附剂是目前最直接、最具可操作性和可行性的方法。

霉菌毒素吸附剂主要有三类：黏土或硅铝酸盐类、活菌或利用其产生的酶类、酵母细胞壁类产品，霉菌毒素吸附剂在动物的消化道内吸附霉菌毒素，减少毒素进入动物体内的数量，从而保护动物免受霉菌毒素毒害。

鉴于无机吸附剂有着各种各样的局限性，近年来，有机吸附剂引起了广大研究者的重视，因其具有与无机吸附剂相比，添加量低、吸附多种霉菌毒素、吸附营养物质少的特点。比如，目前研究较多的酵母细胞提取物葡甘露聚糖对某些霉菌毒素的吸附有一定的效果。但目前生产中的毒素吸附剂种类繁多，质量参差不齐，也无统一的国家或行业标准，迫切需要建立可靠的霉菌毒素吸附剂吸附性能评估方法，而评估吸附剂产品的优劣不能只考虑体外对毒素吸附率的高低，体外试验往往不能反映出这些吸附剂的吸附选择性，一旦它们加入谷物或饲料中，某些营养成分也可被它们吸附，而这些营养成分在基质中的浓度远高于其中的毒素浓度,结果吸附剂被营养成分饱和而不能吸附毒素。因此，评价脱霉剂效果还需要注意吸附剂是否存在对维生素、微量元素和氨基酸等营养物质吸附以及吸附程度程度。其中维生素是动物正常代谢所必需的营养素，对动物健康和生长极为重要。由于大部分饲料原料中的维生素含量都很低，且单胃动物体内不能合成维生素，所以日粮中缺乏维生素就会导致动物的维生素缺乏症。B族维生素除B12外，都不能在体内贮存，如采食过量则全部从尿中排泄，必须按需要量在日粮中不断补充。维生素B

发明内容

本发明所解决的技术问题是，寻找一种可以在体外利用脱霉剂对营养物质进行吸附，筛选不同脱霉物质对特定的营养物质效果最好的评估方法及其应用。

发明人为了解决上述问题，采用了不同吸附物质，并将营养物质配制成不同浓度的溶液，将不同的营养物质混合在一起，向其中加入脱霉物质，恒温振荡进行吸附，吸附反应完成后，进行离心处理，取上清液进行剩余营养物质检测，这种评估方法可以在体外进行，并且只对上述营养物质进行吸附，可以避免在体内吸附实验时其他毒素的影响，本发明的方法可以让脱霉物质对营养物质的吸附量达到最大，效果更加准确。

具体来说，本发明为了解决上述技术问题，提供了如下技术方案：

一种用于评估脱霉剂对营养物质吸附选择性的方法，其中，该方法通过分别检测不同脱霉剂对不同营养物质的吸附性高低来评估脱霉剂，其中，所述脱霉剂选自凹凸棒石类脱霉剂、复合凹凸棒石类脱霉剂、酵母细胞壁类脱霉剂、可立吸类脱霉剂和蒙脱石类脱霉剂中的一种或二种以上；所述营养物质包括：维生素类、矿物质微量元素类和氨基酸类；

其中，所述维生素类包括维生素C(VC)、维生素E(VE)、维生素B

所述矿物质微量元素类包括Cu、Fe、Mn、Zn、Se和Mg；所述氨基酸包括赖氨酸和蛋氨酸。

优选地，对于所述方法，其中，脱霉剂中所述复合凹凸棒石包括2wt％木质活性炭和凹凸棒石；优选所述复合凹凸棒石颗粒为200目。

优选地，对于所述方法，其中，所述可立吸脱霉剂包括酵母细胞壁和凹凸棒石，优选的是其中包括酵母细胞壁70wt％。

优选地，对于所述方法，其中，用该方法进行评估时，所述营养物质配制的溶液浓度分别为：VC：0.1-1.5mg/mL；VE：1.0-1.2mg/mL；VB

优选地，对于所述方法，其中，用该方法进行评估时，所述营养物质选自1.2mg/mLVE、0.2mg/mLVB

优选地，对于所述方法，其中，所述方法用于评估酵母细胞壁类脱霉剂对于包括1.5mg/mLVC、0.6mg/mL Se

优选地，对于所述方法，其中，包括下述步骤：

(1)配制不同营养物质的不同浓度溶液待用；

(2)向步骤(1)中配制的溶液中分别加入五种脱霉物质，进行恒温振荡吸附；

(3)吸附完成后进行离心，取上清液进行剩余营养物质的检测。

优选地，对于所述方法，其中，所述营养物质的来源包括矿物质盐，优选所述矿物质盐包括氯化铜、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、亚硒酸钠以及氯化镁。

优选地，对于所述方法，其中，步骤(2)中所述恒温振荡的温度为：25℃-45℃，优选为37℃；优选所述振荡吸附时间为：60min-120min，优选为90min。

优选地，对于所述方法，其中，步骤(3)中吸附完成后对剩余营养物质的检测方法包括采用高效液相色谱法、碘量法、原子吸收光谱法和氨基酸自动分析仪进行检测；优选为对于VE、VB

优选地，对于所述方法，其中，在步骤(1)中在制备待测样品溶液同时，还包括准备空白对照溶液，并与待测样品溶液在步骤(2)、(3)中进行相同的操作。

优选地，对于所述方法，其中，该方法还包括步骤(4)：根据步骤(3)的检测结果筛选出对目标营养物质吸附性低的脱霉剂。

一种根据营养物质类型选择脱霉剂制备饲料的方法，其中，采用上一段所述的方法筛选出脱霉剂，根据饲料中所含营养物质类型在制备饲料时候选择性添加该脱霉剂，从而制成饲料。

优选地，以上任一段所述的方法在生物检测领域的应用。

本发明的有益效果包括:

(1)本发明提供的评估方法可以在体外进行，并且只对特定的营养物质进行吸附，可以避免在体内吸附实验时其他毒素的影响，并使脱霉物质对营养物质的吸附量达到最大，使得检测结果更加直观、真实；

(2)本发明对特定营养物质采取了特定的检测方法，检测结果更加准确；

(3)本发明所提供的方法可以筛选出对于某一种营养物质吸附率低的脱霉剂，进而可以在包含这一种营养物质的特定饲料中添加筛选出来的特定脱霉剂，避免了脱霉剂应用不当而降低饲料的营养价值，具备良好的应用前景。

具体实施方式

本发明旨在提供一种评估方法，其可以在体外测定特定的脱霉物质对于特定营养物质的吸附效果进而进行筛选。

在本发明的一个优选实施方案中，所述脱霉剂选自凹凸棒石类脱霉剂、复合凹凸棒石类脱霉剂、酵母细胞壁类脱霉剂、可立吸类脱霉剂和蒙脱石类脱霉剂中的一种或两种以上；所述营养物质包括：维生素类、矿物质微量元素类和氨基酸类。

在本发明的一个优选实施方案中，所述维生素类包括维生素C(VC)、维生素E(VE)、维生素B

在本发明的一个优选实施方案中，所述方法为用于筛选酵母细胞壁类脱霉物质对于包括0.2mg/mLVB

在本发明的一个优选实施方案中，所述方法为用于筛选酵母细胞壁类脱霉剂对于包括1.5mg/mLVC、0.6mg/mLSe

本发明还提供了所述方法的使用步骤，具体包括：

(1)配制不同营养物质的不同浓度溶液待用；

(2)向步骤(1)中配制的溶液中分别加入五种脱霉物质，进行恒温振荡吸附；

(3)吸附完成后进行离心，取上清液进行剩余营养物质的检测。

在本发明的一个优选实施方案中，在步骤(1)配制不同浓度的营养物质溶液的同时，还包括准备不添加任何营养物质的空白对照溶液，并在步骤(2)和(3)中与待测样品溶液进行相同的操作。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)中所述恒温振荡的温度为25℃-45℃，所述振荡吸附时间为60min-120min。

在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)中吸附完成后对剩余营养物质的检测方法包括：高效液相色谱法、碘量法、原子吸收光谱法和氨基酸自动分析仪；优选为对于VE、VB

在本发明的一个优选实施方案中，所述筛选方法包括下述步骤：

(1)配制营养物质溶液：分别将十三种营养物质：(VC、VE、VB

维生素溶液：VC：0.1、0.3、0.5、0.7、1.0和1.5mg/mL，VE：1.2mg/mL，VB

微量元素浓度：Cu

氨基酸溶液：赖氨酸：10、15、20、25和100mg/mL，蛋氨酸：1.0、5.0、10、15和100mg/mL。

(2)取上述不同浓度不同种类的营养物质溶液，向其中加入不同脱霉吸附物质，恒温振荡，使得脱霉吸附物质对营养物质进行吸附，之后对溶液进行离心，取上清液进行营养物质含量检测；

(3)对营养物质剩余含量的检测手段为：

对VE、VB

其中，各营养物质的检测条件如下：

对维生素类的检测：

(1)高效液相色谱

VE：SE-30毛细管色谱柱，氢火焰离子检测器，保持柱箱温度250℃，汽化温度、检测温度为300℃；载气为氮气。

VB

VB

VB

(2)碘量法测定VC

称取0.2g实验室样品，置于250mL碘容量瓶中，加20mL无二氧化碳的水及25mL硫酸溶液使溶解，立即用碘标准滴定溶液滴定，近终点时，加1mL淀粉指示液，滴至溶液显蓝色，保持30s不褪色为终点。同时做空白试验，除不加试样外，其他步骤与样品测定相同。

2.对于微量元素的检测：

(1)原子吸收光谱检测

Cu

(2)荧光分光光度计

Se

3.对于氨基酸类的检测

氨基酸自动分析仪检测条件为：色谱柱：磺酸型阳离子树脂；检测波长：570nm和440nm。

本发明中的液相色谱仪、原子吸收光谱仪、氨基酸自动分析仪厂家及仪器型号分别为：液相色谱仪，waters公司，waters 2695+2998PDA；原子吸收分光光度计，日本日立，ZA3700 AA(用于检测铜)、原子吸收分光光度计，日本日立，Z-2000(用于检测铁、锰、锌和镁)；荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司，F98(用于检测硒)；氨基酸自动分析仪，日本日立公司，L-8900。

在下述实施例中所用离心机采购于上海安亭科学仪器厂，TGL-16G。

本发明中所用到的脱霉吸附物质的来源分别为：

(1)凹凸棒、和蒙脱石和酵母细胞壁类脱霉剂商购来源分别为：

凹凸棒石：江苏盱眙博图凹土股份有限公司；

蒙脱石：内蒙古赤峰和正美化工有限公司；

酵母细胞壁：安琪酵母股份有限公司，商品名称：福邦甘露寡糖(酵母细胞壁)25kg(畜禽)；

(2)复合凹凸棒石自制方法：木质活性炭(2wt％)与凹凸棒石进行混合，对辊粉碎至200目，其中木质活性炭购自购买于溧阳市江南活性炭厂，

(3)可立吸制备方法：70wt％酵母细胞壁和30wt％凹凸棒石混合均匀即可。

另外，在本发明实施例在步骤(1)准备待测溶液样品的同时，还包括准备空白对照溶液(不添加营养物质)；并且所有空白对照组溶液与实验组在步骤(2)和(3)中均进行相同的实验操作，此操作能够排除实验操作对于含量的影响；并且，营养物质吸附率为：1-(测定的实验组营养物质剩余含量/测定的空白对照组营养物质含量)(记为1-(W/W

实施例

实施例1

(1)对维生素的吸附：取30ml带帽玻璃管5个，向每一玻璃管中分别加入1.0mg/ml的VC、1.2mg/ml的VE、1.0mg/ml的VB

(2)对矿物质微量元素的吸附：取30ml带帽玻璃管，每个玻璃管中分别加入1.0mg/ml的氯化铜(Cu

(3)对氨基酸的吸附：取30ml带帽玻璃管，每个玻璃管中分别加入10mg/ml的赖氨酸和1.0mg/ml蛋氨酸溶液，每种氨基酸溶液加入量均为10ml，再向每种氨基酸溶液中加入100mg细胞壁，设一空白对照组；将上述溶液(包括空白对照组)置37℃，150r/min摇床中振荡90min后，取振荡后玻璃管中溶液在4000r/min的速度下离心10min，取上清液测定赖氨酸和蛋氨酸含量，并计算吸附率1-(W/W

以上步骤中通过细胞壁脱霉物质吸附营养物质并离心处理后，对上清液进行营养物质含量测定，其中对(1)中VE、VB

表1细胞壁对维生素的吸附率(％)

表2细胞壁对微量元素吸附率(％)

表3细胞壁对氨基酸吸附率(％)

从表1-3可以看出：在维生素类营养物质中，酵母细胞壁类脱霉剂脱霉吸附物质对VE

实施例2

(1)对不同浓度维生素B

(2)对不同浓度微量元素的吸附：取30ml带帽玻璃管分别加入(5mg/ml、10mg/ml)的氯化铜(Cu

(3)对氨基酸的吸附：取30ml带帽玻璃管，向每个玻璃管中分别加入15mg/ml的赖氨酸和5mg/ml蛋氨酸溶液，加入量均为10ml，准备6份，向每种氨基酸溶液分别加入五种不同的脱霉物质：凹凸棒石、可立吸、细胞壁、蒙脱石以及复合凹凸棒石，每种均为100mg，剩余一组为空白对照组，置37℃，150r/min摇床中振荡90min后，取振荡后玻璃管中溶液在4000r/min的速度下离心10min，取上清液测定赖氨酸和蛋氨酸含量，并计算吸附率1-(W/W

将以上经离心得到的上清液进行检测。其中维生素B2采用高效液相色谱法；微量元素采用原子吸收光谱法；氨基酸采用氨基酸自动分析仪，检测结果与空白对照组相比得到每种脱霉物质对营养物质的吸附率，如下表所示：

表4不同脱霉物质对不同浓度维生素B2的吸附率(％)

表5不同脱霉物质对不同微量元素的吸附率(％)

表6不同脱霉物质对不同氨基酸的吸附率(％)

从表4中可以看出，在5种不同脱霉剂对VB

从表5中可以看出，在5种不同脱霉物质对Cu

同样，从表6中可以看出，对于赖氨酸的吸附，蒙脱石的吸附率最高，细胞壁的吸附率最低；对于蛋氨酸的吸附，五种脱霉物质均没有吸附量。

综上所述，在以上所述的营养物质吸附实验中，酵母细胞壁的吸附率最低，综合效果较好。

实施例3

分别将四种营养物质(VB

(1)对不同浓度VB

(2)对不同微量元素的吸附：取30ml带帽玻璃管，向每个玻璃管中分别加入(15mg/ml)的氯化铜(Cu

(3)对氨基酸的吸附：取30ml带帽玻璃管，向每个玻璃管中分别加入20mg/ml的赖氨酸和10mg/ml蛋氨酸溶液，加入量均为10ml，每种溶液准备6份，向其中得到5份分别加入5种不同的脱霉物质:凹凸棒石、可立吸、细胞壁、蒙脱石以及复合凹凸棒石，每种脱霉物质加入量均为100mg，剩余的1份设为空白对照组，置37℃，150r/min摇床中振荡90min后，取振荡后玻璃管中溶液在4000r/min的速度下离心10min，取上清液测定赖氨酸和蛋氨酸含量，并计算吸附率1-(W/W

将以上经离心得到的上清液进行检测。其中维生素B

表7不同脱霉物质对不同浓度VB

表8不同脱霉物质对不同微量元素的吸附率(％)

表9不同脱霉物质对不同氨基酸的吸附率(％)

从表7中我们可以看出，五种物质分别对(0.2mg/ml、1.0mg/ml、1.8mg/ml、2.6mg/ml、3.2mg/ml)浓度的VB

从表8中我们可以看出，在15mg/ml的Cu

在表9中，五种物质对蛋氨酸

实施例4

(1)对不同浓度维生素C的吸附：取30ml带帽玻璃管，向每个玻璃管中分别加入不同浓度(0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml、0.7mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml)的VC溶液，每种浓度的加入量均为10ml，每种浓度准备6份，向其中5份分别加入5种不同的的脱霉吸附物质：凹凸棒石、可立吸、细胞壁、蒙脱石以及复合凹凸棒石，每种脱霉吸附物质的加入量均为100mg，剩余一份设为空白对照组，置37℃，150r/min摇床中振荡90min后，取振荡后玻璃管中溶液在4000r/min的速度下离心10min，取上清液测定VC含量，并计算吸附率1-(W/W

(2)对微量元素的吸附：取30ml带帽玻璃管，向每个玻璃管中分别加入(20mg/ml、25mg/ml)的氯化铜(Cu

(3)对不同氨基酸的吸附：取30ml带帽玻璃管，向每个玻璃管中分别加入25mg/ml的赖氨酸和15mg/ml蛋氨酸溶液，加入量均为10ml，每种溶液准备6份，其中5份分别加入5中不同脱霉物质：凹凸棒石、可立吸、细胞壁、蒙脱石以及复合凹凸棒石，每种脱霉物质加入量均为100mg，剩余1份设为空白对照组，置37℃，150r/min摇床中振荡90min后，取振荡后玻璃管中溶液在4000r/min的速度下离心10min，取上清液测定赖氨酸和蛋氨酸含量，并计算吸附率1-(W/W

将以上经离心得到的上清液进行检测。其中维生素C采用碘量法；微量元素采用原子吸收光谱法；氨基酸采用氨基酸自动分析仪，检测结果与空白对照组相比得到每种脱霉物质对营养物质的吸附率，如下表所示：

表10不同脱霉物质对不同浓度VC的吸附率(％)

表11不同脱霉物质对不同微量元素的吸附率(％)

表12不同脱霉物质对不同氨基酸的吸附率(％)

在表10中的对不同浓度的VC的吸附率中，在每一浓度时，均是蒙脱石吸附率最高，酵母细胞壁吸附率最低；并且当浓度为1.5mg/ml，酵母细胞壁剂吸附率最低，为6.2％。

表11是五种脱霉物质对不同浓度的不同微量元素的吸附率，从表中可以看出，对于同一营养物质的溶液。蒙脱石吸附率最高，酵母细胞壁吸附率最低；在表中，酵母细胞壁对Mn

在表12中，对于赖氨酸

实施例5

(1)对不同浓度不同种类微量元素的吸附：取30ml带帽玻璃管，向每个玻璃管中分别加入(35mg/ml、250mg/ml)的氯化铜(Cu

(2)对不同氨基酸的吸附：取30ml带帽玻璃管，向每个玻璃管中分别加入100mg/ml的赖氨酸和100mg/ml的蛋氨酸溶液，每种溶液加入量均为10ml，每种溶液准备6份，向其中5份分别加入5中不同脱霉物质：凹凸棒石、可立吸、细胞壁、蒙脱石以及复合凹凸棒石，每种脱霉物质加入量均为100mg，剩余1份设为空白对照组，置37℃，150r/min摇床中振荡90min后，取振荡后玻璃管中溶液在4000r/min的速度下离心10min，取上清液测定赖氨酸和蛋氨酸含量，并计算吸附率1-(W/W

将以上经离心得到的上清液进行检测。其中微量元素采用原子吸收光谱法；氨基酸采用氨基酸自动分析仪，检测结果与空白对照组相比得到每种脱霉物质对营养物质的吸附率，如下表所示：

表13不同脱霉物质对微量元素的吸附率(％)

表14不同脱霉物质对氨基酸的吸附率(％)

表13是五种不同脱霉吸附物质对(35mg/ml、250mg/ml)的Cu

从表14中可以看出当蛋氨酸的浓度达到100mg/ml，酵母细胞率仍然没有吸附行为，其他四种脱霉物质出现了吸附行为；对于赖氨酸，100mg/ml浓度时，蒙脱石吸附率最高，而酵母细胞壁吸附率最低，为4.2％。

从实施例1-5总结可得到以下结论：

(1)对于维生素类、微量元素类以及氨基酸类，在五种脱霉物质中，酵母细胞壁脱霉剂的吸附率最低；

(2)在酵母细胞壁对1.0mg/ml的VC、1.2mg/ml的VE、1.0mg/ml的VB

(3)在酵母细胞壁对微量元素吸附实验中，对Mg

(4)在5种不同脱霉物质分别对维生素VB

(5)在5种脱霉吸附物质对微量元素进行吸附时，酵母细胞壁吸附率最低，其中，对10mg/mL的Cu

(6)在五种脱霉剂对赖氨酸和蛋氨酸的吸附中，酵母细胞壁吸附率最低，其中:赖氨酸浓度为20mg/mL时，吸附率最低，为1.3％，而蛋氨酸浓度为5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL，脱霉物质对其都没有吸附现象，当浓度为1mg/mL时，平均吸附量仅为0.068％。

综上所述，通过本发明提供的方法，可以评估特定脱霉剂对于特定营养物质吸附的选择性，从而筛选出不同脱霉剂对不同营养物质的吸附性高低；在实际应用中，通过上述方法筛选出对于某一种营养物质吸附率低的脱霉剂，进而可以在包含这一种营养物质的特定饲料中添加筛选出来的特定脱霉剂，避免了脱霉剂应用不当而降低饲料的营养价值，具备良好的应用前景。