一种通过月季体胚诱导萌发的高效植株再生方法

技术领域

本发明涉及植株再生技术领域，更具体的说是涉及一种通过月季体胚诱导萌发的高效植株再生方法。

背景技术

月季(Rosa hybrid)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物，原产于中国，栽培历史悠久，自汉武帝时期就有月季种植的记录。

作为我国传统十大名花之一，月季因花香独特，花色丰富，花型多样，可四季开花，花期长，具有极高的观赏价值和商业价值，广泛应用于园林造景、环境绿化之中。但是，白粉病和黑斑病是月季常见病害；此外，虽然月季花色丰富，但是蓝色月季仍然稀缺。栽培月季品种抗病、蓝色亲本资源缺乏，遗传背景复杂，使得常规育种改良进程缓慢，效率低下。

分子育种具有目的性强、育种周期短等优点。因此，能否通过该手段改良月季抗性和花色，高频植株再生体系的建立是必要的研究基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种通过月季体胚诱导萌发的高效植株再生方法，以解决现有技术中的不足。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种通过月季体胚诱导萌发的高效植株再生方法，具体包括以下步骤：

(1)无菌外植体的获得

从月季植株上选取具腋芽的健壮枝条作为外植体，然后将外植体进行冲洗、剪切和消毒，得到无菌外植体；

(2)无菌母株的获得

将无菌外植体接种到无菌母株筛选培养基上进行光照培养，得到无菌母株；

(3)无菌苗的增殖

切割无菌母株的无菌芽形成楔形基部的无菌苗，然后接种到全能培养基上进行光照培养，4周后挑选出生长迅速、健壮、增殖明显的无菌苗，每4周进行一次同配方继代培养，得到单芽无性系无菌苗；

(4)幼嫩愈伤组织的诱导

切下单芽无性系无菌苗的带叶柄叶片，并沿叶片主脉的垂直方向切2-3刀，然后将叶背朝下接种到高浓度2,4-D愈伤组织诱导培养基上进行暗培养，1个月后切下幼嫩愈伤组织；

(5)胚性愈伤组织的诱导

将幼嫩愈伤组织接种到低浓度2,4-D胚性化诱导培养基上进行暗培养，每2周进行一次同配方继代培养，继代培养两次观察到颗粒状体胚的形成后接种到全能培养基中进行光照培养，得到体胚；

(6)体胚的增殖

将体胚接种到全能培养基中进行同配方继代培养，适度切割，聚集成簇，得到簇状体胚；

(7)体胚的萌发

将簇状体胚分离，得到单个子叶状体胚，然后接种到全能培养基中进行光照培养，3周后体胚萌发，切取体胚后接种到全能培养基中进行光照培养，3周后获得通过体胚萌发的月季再生植株。

进一步，上述步骤(1)中，月季植株为4-5年生，无病虫害，个体健壮，具有品种典型性；枝条为1年生，直径为3-5mm；冲洗的时间为1-2h；剪切的长度为1-2cm；消毒的步骤具体为：先将外植体放入质量浓度为75％的酒精中浸泡30s，取出后放入质量浓度为0.1％的升汞中浸泡7-9min，最后用无菌水冲洗3次。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过冲洗外植体，能够去除附着在植物表面的真菌和细菌等污染物，提高无菌材料的获得率；通过剪切适合大小的外植体，能够确保外植体消毒处理简单，降低污染率，并保证材料的存活率；通过消毒处理，能够确保最大可能获得成活的无菌材料。

进一步，上述步骤(2)中，无菌母株筛选培养基的配方为：MS+BA 0-3.0mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH为6.0；光照培养的光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000Lx，培养时间为10天。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选无菌母株筛选培养基能够最大可能获得萌发的无菌苗。

进一步，上述步骤(3)中，全能培养基的配方为：MS+BA 0.1-3.0mg/L+IBA 0.1-2.0mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH为6.0。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选全能培养基为最适宜的配方，仅需一个培养基配方即可用于无菌苗增殖、体胚增殖和体胚萌发，几乎涵盖月季植株再生诱导的全过程。

进一步，上述步骤(4)中，叶片的尺寸为5mm×10mm；叶柄的长度为1mm；高浓度2,4-D愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+2,4-D 1.0-10.0mg/L。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选高浓度2,4-D愈伤组织诱导培养基能够确保月季叶片组织愈伤组织化。

进一步，上述步骤(5)中，低浓度2,4-D胚性化诱导培养基的配方为：MS+2,4-D0.1-5.0mg/L。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明所选低浓度2,4-D愈伤组织诱导培养基能够确保月季愈伤组织胚性化，最终可以形成体胚。

进一步，上述步骤(6)中，簇状体胚包括3-5个体胚，体胚的大小为3-5mm。

进一步，上述步骤(7)中，单个子叶状体胚的大小为4-7mm；若需生根，则切取体胚后接种到MS固体培养基中进行光照培养，3周后获得月季生根苗。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明通过诱导月季体胚高频萌发的植株再生流程，方法简单，稳定；

2、本发明特别建立了高浓度2,4-D诱导愈伤组织，低浓度2,4-D诱导愈伤组织胚性化，去除2,4-D获得体胚的月季体胚发生流程稳定、可靠；

3、本发明通过成簇状培养体胚诱导体胚增殖，单个培养诱导体胚萌发的策略简单、易行；

4、本发明可为后续转基因受体的供应，提供充足中间材料；

5、本发明也可为后续获得转基因再生植株奠定高频植株再生体系。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

值得说明的是，本发明再生方法不仅可用于月季，也可用于其他类似品种或类似植物的高效再生，都属于本发明保护的范围。

实施例1

通过月季体胚诱导萌发的高效植株再生方法，具体包括以下步骤：

(1)无菌外植体的获得

选取5年生、无病虫害、个体健壮、具有品种典型性的月季‘坦尼克’植株作为供体母株，春季晴天上午10点，从供体母株上选取一年生、直径为4mm、具腋芽的健壮枝条作为外植体，然后将外植体在自来水下流水冲洗冲洗2h，使用解剖剪将枝条剪切为长度为1.8cm、带叶痕的茎段，先将茎段放入质量浓度为75％的酒精中浸泡30s，取出后放入质量浓度为0.1％的升汞中浸泡8min，期间不断震荡小烧杯，以保证每个外植体都消毒彻底，最后用无菌水冲洗3次，得到无菌外植体；

(2)无菌母株的获得

将无菌外植体按照形态学上下端接种到无菌母株筛选培养基(配方为：MS+BA0-3.0mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH为6.0)上，每瓶内接种一个无菌外植体，设置光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000Lx，光照培养10天，期间观察无菌外植体生长及污染情况，并丢掉污染和没有萌发的材料，得到无菌母株；

(3)无菌苗的增殖

切割无菌母株的无菌芽形成楔形基部的无菌苗，然后接种到全能培养基(配方为：MS+BA 1.5mg/L+IBA 1.0mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH为6.0)上进行光照培养，观察无菌苗增殖情况，4周后挑选出生长迅速、健壮、增殖明显的无菌苗单株确定为单芽无性系，之后每4周进行一次同配方继代培养，得到单芽无性系无菌苗；

(4)幼嫩愈伤组织的诱导

切下单芽无性系无菌苗的带1mm叶柄、尺寸为5mm×10mm的叶片，并沿每个叶片主脉的垂直方向切2刀，然后将叶背朝下接种到高浓度2,4-D愈伤组织诱导培养基(配方为：MS+2,4-D 10.0mg/L)上进行暗培养，1个月后观察到愈伤组织的形成，及时切下幼嫩愈伤组织；

(5)胚性愈伤组织的诱导

将幼嫩愈伤组织接种到低浓度2,4-D胚性化诱导培养基(配方为：MS+2,4-D0.1mg/L)上进行暗培养，每2周进行一次同配方继代培养，继代培养两次后观察到颗粒状体胚的形成，即刻接种到全能培养基中进行光照培养(用于体胚增殖诱导)，得到体胚；

(6)体胚的增殖

将体胚接种到全能培养基中进行同配方继代培养，适度切割4mm的体胚，4个体胚聚集成簇，得到簇状体胚；

(7)体胚的萌发

将簇状体胚分离，得到大小为4mm的单个子叶状体胚，然后接种到全能培养基中进行光照培养，3周后体胚萌发，切取体胚后接种到全能培养基中进行光照培养，3周后获得通过体胚萌发的月季再生植株。

实施例2

通过月季体胚诱导萌发的高效植株再生方法，具体包括以下步骤：

(1)无菌外植体的获得

选取4年生、无病虫害、个体健壮、具有品种典型性的月季‘珠美’植株作为供体母株，春季晴天上午9点，从供体母株上选取一年生、直径为3mm、具腋芽的健壮枝条作为外植体，然后将外植体在自来水下流水冲洗冲洗1h，使用解剖剪将枝条剪切为长度为1.5cm、带叶痕的茎段，先将茎段放入质量浓度为75％的酒精中浸泡30s，取出后放入质量浓度为0.1％的升汞中浸泡7min，期间不断震荡小烧杯，以保证每个外植体都消毒彻底，最后用无菌水冲洗3次，得到无菌外植体；

(2)无菌母株的获得

将无菌外植体按照形态学上下端接种到无菌母株筛选培养基(配方为：MS+BA0-3.0mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH为6.0)上，每瓶内接种一个无菌外植体，设置光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000Lx，光照培养10天，期间观察无菌外植体生长及污染情况，并丢掉污染和没有萌发的材料，得到无菌母株；

(3)无菌苗的增殖

切割无菌母株的无菌芽形成楔形基部的无菌苗，然后接种到全能培养基(配方为：MS+BA 0.1mg/L+IBA 0.1mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH为6.0)上进行光照培养，观察无菌苗增殖情况，4周后挑选出生长迅速、健壮、增殖明显的无菌苗单株确定为单芽无性系，之后每4周进行一次同配方继代培养，得到单芽无性系无菌苗；

(4)幼嫩愈伤组织的诱导

切下单芽无性系无菌苗的带1mm叶柄、尺寸为5mm×10mm的叶片，并沿每个叶片主脉的垂直方向切2刀，然后将叶背朝下接种到高浓度2,4-D愈伤组织诱导培养基(配方为：MS+2,4-D 1.0mg/L)上进行暗培养，1个月后观察到愈伤组织的形成，及时切下幼嫩愈伤组织；

(5)胚性愈伤组织的诱导

将幼嫩愈伤组织接种到低浓度2,4-D胚性化诱导培养基(配方为：MS+2,4-D0.1mg/L)上进行暗培养，每2周进行一次同配方继代培养，继代培养两次后观察到颗粒状体胚的形成，即刻接种到全能培养基中进行光照培养(用于体胚增殖诱导)，得到体胚；

(6)体胚的增殖

将体胚接种到全能培养基中进行同配方继代培养，适度切割3mm的体胚，5个体胚聚集成簇，得到簇状体胚；

(7)体胚的萌发

将簇状体胚分离，得到大小为4mm的单个子叶状体胚，然后接种到全能培养基中进行光照培养，3周后体胚萌发，切取体胚后接种到全能培养基中进行光照培养，3周后获得通过体胚萌发的月季再生植株。

实施例3

通过月季体胚诱导萌发的高效植株再生方法，具体包括以下步骤：

(1)无菌外植体的获得

选取5年生、无病虫害、个体健壮、具有品种典型性的月季‘肯尼迪’植株作为供体母株，春季晴天上午10点，从供体母株上选取一年生、直径为5mm、具腋芽的健壮枝条作为外植体，然后将外植体在自来水下流水冲洗冲洗2h，使用解剖剪将枝条剪切为长度为2cm、带叶痕的茎段，先将茎段放入质量浓度为75％的酒精中浸泡30s，取出后放入质量浓度为0.1％的升汞中浸泡9min，期间不断震荡小烧杯，以保证每个外植体都消毒彻底，最后用无菌水冲洗3次，得到无菌外植体；

(2)无菌母株的获得

将无菌外植体按照形态学上下端接种到无菌母株筛选培养基(配方为：MS+BA0-3.0mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH为6.0)上，每瓶内接种一个无菌外植体，设置光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000Lx，光照培养10天，期间观察无菌外植体生长及污染情况，并丢掉污染和没有萌发的材料，得到无菌母株；

(3)无菌苗的增殖

切割无菌母株的无菌芽形成楔形基部的无菌苗，然后接种到全能培养基(配方为：MS+BA 3.0mg/L+IBA2.0mg/L+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH为6.0)上进行光照培养，观察无菌苗增殖情况，4周后挑选出生长迅速、健壮、增殖明显的无菌苗单株确定为单芽无性系，之后每4周进行一次同配方继代培养，得到单芽无性系无菌苗；

(4)幼嫩愈伤组织的诱导

切下单芽无性系无菌苗的带1mm叶柄、尺寸为5mm×10mm的叶片，并沿每个叶片主脉的垂直方向切3刀，然后将叶背朝下接种到高浓度2,4-D愈伤组织诱导培养基(配方为：MS+2,4-D 10.0mg/L)上进行暗培养，1个月后观察到愈伤组织的形成，及时切下幼嫩愈伤组织；

(5)胚性愈伤组织的诱导

将幼嫩愈伤组织接种到低浓度2,4-D胚性化诱导培养基(配方为：MS+2,4-D5.0mg/L)上进行暗培养，每2周进行一次同配方继代培养，继代培养两次后观察到颗粒状体胚的形成，即刻接种到全能培养基中进行光照培养(用于体胚增殖诱导)，得到体胚；

(6)体胚的增殖

将体胚接种到全能培养基中进行同配方继代培养，适度切割5mm的体胚，3个体胚聚集成簇，得到簇状体胚；

(7)体胚的萌发

将簇状体胚分离，得到大小为7mm的单个子叶状体胚，然后接种到全能培养基中进行光照培养，3周后体胚萌发，切取体胚后接种到MS固体培养基中进行光照培养，3周后获得月季生根苗。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。