一种临床评估胰岛β细胞功能的分子标志物

技术领域

本发明涉及生物化学和医学领域，特别是涉及一种临床评估胰岛β细胞功能的分子标志物。

背景技术

胰岛β细胞在生物体内最主要的功能是分泌胰岛素，胰岛素是降低血糖的重要激素。胰岛β细胞功能和1型糖尿病，2型糖尿病及其他血糖代谢相关代谢综合症密切相关。1型糖尿病是一种自身免疫疾病，是由于自身抗体损伤胰岛β细胞而导致的胰岛素分泌绝对不足引起的。2型糖尿病的重要特点是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能降低，即胰岛素的靶器官无法响应胰岛素的作用降低血糖；而胰岛β细胞无法分泌过量的胰岛素来弥补胰岛素抵抗的效应，最终导致高血糖，形成2型糖尿病。随着病情的进展，胰岛β细胞持续下降，血糖持续增加。由此可见，胰岛β细胞功能障碍是导致糖尿病关键因素。已有报道，糖尿病确诊时，胰岛β细胞的功能已经下降50％以上。如果开发出一个可靠的指示胰岛β细胞功能的标志物，将为糖尿病的早期诊断提供可能。但是，目前没有便捷反映胰岛β细胞功能的生物标志物，仅能从某种程度上反映胰岛β细胞的功能。现有的衡量胰岛β细胞功能方法有高糖钳夹技术，胰岛素峰值与基础值的比值，糖负荷后胰岛素曲线下面积，第一时相胰岛素分泌等方法。其中高糖钳夹技术和糖负荷后胰岛素曲线下面积，表征的是胰岛素的分泌量，由于高糖钳夹技术对人体的伤害较大，应用不广泛。由于胰岛素峰值出现的时间不同，胰岛素峰值的测定误差较大，所以胰岛素峰值与基础值的比值的准确度不够。第一时相胰岛素分泌在晚期IGT和糖尿病患者中检测失效，在某些时候无法作为检测胰岛β细胞功能的生物标志物。并且，这些检测指标多为根据口服糖耐量结果进行计算，数据获取方式对病人也是一种负担。因此，需要找到一个简单的反映胰岛β细胞功能的标志物，以解决现有技术中衡量胰岛β细胞功能所存在的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种临床评估胰岛β细胞功能的分子标志物，以解决上述现有技术存在的问题，通过统计分析人血清中的β一半乳糖苷酶结合凝集素3(Galectin-3)和胰岛β细胞功能之间的关系，发现Galectin-3和多种胰岛β细胞功能的评估指标之间存在负相关性，说明Galectin-3可以作为评估胰岛β细胞功能的生物标志物。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供检测Galectin-3的试剂在制备临床评估胰岛β细胞功能用的产品中应用，所述Galectin-3为半乳糖苷结合蛋白。

优选的是，所述Galectin-3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

MHSKTPCGCFKPWKMADNFSLHDALSGSGNPNPQGWPGAWGNQP

AGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRMLITILGTVKPNANRIALDFQRGNDVAFHFNPRFNENNRRVIVCNTKLDNNWGREERQSVFPFESGKPFKIQVLVEPDHFKVAVNDAHLLQYNHRVKKLNEISKLGISGDIDLTSASYTMI(SEQ ID NO：1)

优选的是，所述产品包括用ELISA试剂盒或其他试剂盒检测Galectin-3水平的试剂。

优选的是，与健康人相比，所述Galectin-3与评估所述胰岛β细胞功能的指标呈负相关性。

优选的是，评估所述胰岛β细胞功能的指标包括胰岛素曲线下面积、胰岛素释放指数、糖负荷后胰岛素增值与血糖增值的比值、胰岛素总体处置指数以及HOMA-β功能指数。

优选的是，所述产品包括试剂盒。

本发明还提供一种Galectin-3蛋白在制备用于血糖代谢相关综合症治疗过程中临床评估胰岛β细胞功能的产品中的应用。

优选的是，编码所述Galectin-3蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

atggcagaca atttttcgct ccatgatgcg ttatctgggt ctggaaaccc aaaccctcaaggatggcctg gcgcatgggg gaaccagcct gctggggcag ggggctaccc aggggcttcc tatcctggggcctaccccgg gcaggcaccc ccaggggctt atcctggaca ggcacctcca ggcgcctacc ctggagcacctggagcttat cccggagcac ctgcacctgg agtctaccca gggccaccca gcggccctgg ggcctacccatcttctggac agccaagtgc caccggagcc taccctgcca ctggccccta tggcgcccct gctgggccactgattgtgcc ttataacctg cctttgcctg ggggagtggt gcctcgcatg ctgataacaa ttctgggcacggtgaagccc aatgcaaaca gaattgcttt agatttccaa agagggaatg atgttgcctt ccactttaacccacgcttca atgagaacaa caggagagtc attgtttgca atacaaagct ggataataac tggggaagggaagaaagaca gtcggttttc ccatttgaaa gtgggaaacc attcaaaata caagtactgg ttgaacctgaccacttcaag gttgcagtga atgatgctca cttgttgcag tacaatcatc gggttaaaaa actcaatgaaatcagcaaac tgggaatttc tggtgacata gacctcacca gtgcttcata taccatgatt taa(SEQ IDNO：2)

本发明公开了以下有益技术效果：

本发明通过统计分析人血清中的Galectin-3和胰岛β细胞功能之间的关系，发现Galectin-3和多种胰岛β细胞功能的评估指标之间存在负相关性。因此，Galectin-3可以作为胰岛β细胞功能的生物标志物。

本发明提供了检测Galectin-3的试剂在制备临床评估胰岛β细胞功能用的产品中应用，以及Galectin-3蛋白在制备用于糖代谢综合63048552症治疗过程中临床评估胰岛β细胞功能的产品中的应用，提供该蛋白能用于制备评估胰岛β细胞功能的分子标记，不受检测方法和时间的限制，能为胰岛β细胞功能的评估提供一种简单且准确的方法，对于临床上血糖代谢相关综合症诊断过程中胰岛β细胞功能的诊断提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1人血清Galectin-3浓度与30分钟胰岛素曲线下面积之间成负相关关系；

图2人血清Galectin-3浓度与120分钟胰岛素曲线下面积之间成负相关关系；

图3人血清Galectin-3浓度与30分钟胰岛素释放指数之间成负相关关系；

图4人血清Galectin-3浓度与120分钟胰岛素释放指数之间成负相关关系；

图5人血清Galectin-3浓度与胰岛素总体处置指数之间成负相关关系；

图6人血清Galectin-3浓度与糖负荷后胰岛素增值与血糖增值的比值之间成负相关关系；

图7人血清Galectin-3浓度与胰岛素功能指数HOMA-β之间成负相关关系；

图8糖尿病前期人血清Galectin-3浓度与胰岛素功能指数HOMA-β之间成负相关关系；

图9糖尿病前期人血清Galectin-3浓度与120分钟胰岛素释放指数之间成负相关关系；

图10为不同时间点的血清Galectin-3水平的变化情况。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1筛选临床评估胰岛β细胞功能的分子标志物

1、受试者口服糖耐量检测

受试者禁食过夜。清晨受试者空腹静脉采血，保留血样。然后一次服用75克无水葡萄糖，服糖后30分钟，60分钟和120分钟取静脉血。测量并记录血糖水平。将血液样本离心取上清，及得到血清样本。通过ELISA检测并记录血清中的胰岛素和Galectin-3水平。

本实验室自行开发了Galectin-3的ELISA检测试剂盒，具体方法为：

1)将标准品Galectin-3稀释至0.01M PBS+20％FBS的溶液中，制成终浓度为20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5ng/ml，1.25ng/ml，0.625ng/ml。血清样本推荐1：2稀释，稀释至PBS中。

2)在包被好捕获抗体的ELISA孔板内加入100ul样品稀释液后，分别加入50ul样品和标准品，在室温下反应3小时。

3)彻底清洗孔板，加入检测抗体混合液，并在室温下反应2小时。

4)彻底清洗孔板，加入显色液，通过荧光信号读值。

2、胰岛β细胞功能指标的计算

胰岛素曲线下面积：得到的口服糖耐量结果，以时间为横轴，胰岛素水平为纵轴做图，得到曲线下的面积记为胰岛素曲线下面积。30分钟胰岛素曲线下面积的计算公式为：(Ins

胰岛素释放指数：得到的口服糖耐量结果，以时间为横轴，血糖水平为纵轴做图，得到曲线下面积记为血糖曲线下面积。30分钟血糖曲线下面积的计算公式为(Glu

胰岛素处置指数：63048552

胰岛素释放指数×Matsuda指数。Matsuda指数的计算公式是：10000/sqrt(Glu

3、胰岛β细胞功能指标和Galectin-3的统计分析。

用R软件分析Galectin-3与胰岛β细胞功能指标的线性关系，并考察拟合得到的斜率是否具有统计学意义。结果如表1所示，Galectin-3与胰岛β细胞功能指标之间存在负相关关系，即血清中Galectin-3越高，胰岛β细胞功能指标越低，胰岛β细胞功能越差。

表1 Galectin-3与胰岛β细胞功能指标的线性关系分析结果

为了更具体的体现Galectin-3与胰岛β细胞功能指标之间的线性关系，本发明对不同时间点的胰岛β细胞功能指标与Galectin-3进行了更详尽的分析，同时还分析了现有技术单纯分析各项指标的缺陷。

(1)Galectin-3与胰岛素曲线下面积呈负相关关系。

对受试者进行了2小时口服糖耐量检测，提取了0分钟，30分钟，60分钟，120分钟的血清，并检测了血清中的血糖和胰岛素水平。胰岛素曲线下面积是表示胰岛β细胞功能的一个指标。在糖负荷后，机体产生的胰岛素量可以在一定程度上反映胰岛β细胞功能。缺点在于无法区分当曲线下面积相同但是达到峰值不同的健康人和2型糖尿病病人之间的区别。

受试者0分钟血清中的Galectin-3浓度由ELISA方法检测获得。胰岛素曲线下面积是指在口服糖耐量检测中，胰岛素变化的曲线下面积。从0分钟至30分钟的胰岛素曲线下面积记为AUCINS30，从0分钟至120分钟的胰岛素曲线下面积记为AUCINS120。

如图1和图2所示，通过分析Galectin-3和AUCINS30和AUCINS120之间的关系，发现Galectin-3和AUCINS30，AUCINS120之间都存在负相关关系。

(2)Galectin-3与胰岛素释放指数呈负相关关系

对受试者进行了2小时口服糖耐量检测，提取了0分钟，30分钟，60分钟，120分钟的血清，并检测了血清中的血糖和胰岛素水平。计算口服糖耐量检测中的血糖曲线下面积和胰岛素曲线下面积。胰岛素释放指数为胰岛素曲线下面积与血糖曲线下面积的比值。从0分钟至30分钟的胰岛素曲线下面积与血糖曲线下面积的比值记为INSR30。从0分钟至120分钟的胰岛素曲线下面积与血糖曲线下面积的比值记为INSR120。胰岛素释放指数是一个胰岛β细胞功能的检测指标。与胰岛素曲线下面积相比，胰岛素释放指数纠正了血糖因素。但是当患者由于胰岛素抵抗而产生代偿性胰岛素分泌过多时，胰岛素释放指数会认为其胰岛功能并未受损。

如图3和图4所示，通过分析Galectin-3和INSR30和INSR120之间的关系，发现Galectin-3和INSR30，INS120R之间都存在负相关关系。

(3)Galectin-3与胰岛素总体处置指数呈负相关关系

对受试者进行了2小时口服糖耐量检测，提取了0分钟，30分钟，60分钟，120分钟的血清，并检测了血清中的血糖和胰岛素水平。胰岛素总体处置指数(DI120)是指胰岛素释放指数(INSR120)×Matsuda参数。胰岛素总体处置指数越高，则胰岛β细胞功能越强。

如图5所示，通过分析Galectin-3和胰岛素总体处置指数之间的关系，发现Galectin-3和胰岛素总体处置指数之间存在负相关关系。

(4)Galectin-3与糖负荷后胰岛素增值与血糖增值的比值之间存在负相关关系

对受试者进行了2小时口服糖耐量检测，提取了0分钟和30分钟的血清，并检测了血清中的血糖和胰岛素水平。糖负荷后胰岛素增值与血糖增值的比值等于30分钟胰岛素和空腹胰岛素水平的增量与30分钟血糖和空腹血糖的增量之间的比值。这是一个公认的检测胰岛β细胞功能的指标，用于表示早期胰岛素分泌功能。但是对于胰岛素分泌曲线平缓的人群无法分析。

如图6所示，分析发现Galectin-3和糖负荷后胰岛素增值与血糖增值的比值成负相关关系。糖负荷后胰岛素增值于血糖增值的比值越大，Galectin-3水平越底。

(5)Galectin-3与HOMA-β之间存在负相关关系

HOMA-β功能指数的计算公式是：20×空腹胰岛素/(空腹血糖-3.5)。这是一个简单的胰岛β细胞功能指标。相比其他胰岛β细胞功能指标，HOMA-β仅需要零时的血液样本，不需进行口服糖耐量检测。缺点是受胰岛素抵抗干扰比较大，会判断胰岛素抵抗初期患者的胰岛功能优于健康人群。

如图7所示，通过分析Galectin-3和HOMA-β功能指数之间的关系，发现Galectin-3和HOMA-β功能指数之间存在负相关关系。

(6)糖尿病发病前期Galectin-3与胰岛β细胞功能指标存在负相关关系

糖尿病发病前期是指血糖在5.6～7.0mmol/L范围的时期。此时糖尿病患者的血糖情况已经开始异常，胰岛功能受损，但是尚未达到糖尿病阶段。目前尚缺少指示糖尿病前期的生物标志物。但是由于糖尿病前期进行干预有可能可以逆转血糖升高和胰岛功能受损等情况，糖尿病前期的筛查对糖尿病预防非常重要。

用R软件分析Galectin-3与胰岛β细胞功能指标的线性关系，并考察拟合得到的斜率是否具有统计学意义。结果如表2所示，Galectin-3与胰岛β细胞功能指标之间存在负相关关系，即血清中Galectin-3越高，胰岛β细胞功能指标越低，胰岛β细胞功能越差。

如图8和图9所示，分析糖尿病发病前期人群血清中的Galectin-3浓度与胰岛β细胞功能指标HOMA-β和120分钟胰岛素释放指数(INSR120)之间的关系，发现Galectin-3和这些胰岛β细胞功能指标之间存在负相关关系。说明在糖尿病发病前期，血清中Galectin-3的浓度可以指示胰岛β细胞功能。

表2糖尿病前期人胰岛β细胞功能指标和Galectin-3的统计分析

实施例2临床实例中通过Galectin-3判断胰岛β细胞功能

在医院进行的小样本临床实验中，通过Galectin-3判断胰岛β细胞功能。比较通过Galectin-3鉴定的的结果和医院诊断结果，判断Galectin-3作为胰岛β细胞功能生物标志物的敏感性和特异性。

实施方法：

通过医院组织小型流行病学调查，由医院对患者的血糖代谢异常情况进行诊断。由于目前临床诊断中，很难诊断胰岛β细胞功能，多用于诊断血糖的代谢情况。因此分析Galectin-3和血糖代谢之间的关系。

取血液样本检测其Galectin-3浓度。选择高Galectin-3浓度组(Galectin-3>15ng/ml)和低Galectin-3浓度组(Galectin-3＜5ng/ml)，统计组别中以下四种症状样本量：高Galectin-3且血糖代谢异常，高Galectin-3但血糖代谢正常，低Galectin-3且血糖代谢正常，低Galectin-3但血糖代谢异常。

敏感性计算公式为：高Galectin-3且血糖代谢异常/(高Galectin-3且血糖代谢异常+高Galectin-3但血糖代谢正常)。

特异性计算公式为：低Galectin-3且血糖代谢正常/(低Galectin-3且血糖代谢正常+低Galectin-3但血糖代谢异常)。

不同组别患者血糖代谢情况统计结果如表3所示结果：

表3不同组别患者血糖代谢情况统计结果

通过上述公式计算得到：敏感性为0.62，特异性为0.68。说明Galectin-3浓度对胰岛β细胞功能有一定的诊断效果。

在现有技术中，衡量病人的胰岛β细胞功能的检查中，多需要病63048552人空腹取血清检测血糖水平和胰岛素水平。并且为准确衡量胰岛β细胞功能，需要进行口服糖耐量检测，即需要多次取血。并且，由于人体胰岛素水平受多种因素影响，同一病人不同时间的检测之间的差异较大，更增加了诊断胰岛β细胞功能的难度。与之相比，在OGTT检测过程中，检测每个时间点的血清Galectin-3水平，发现Galectin-3的变化较小(如图10所示)，说明本发明提供的临床评估胰岛β细胞功能的分子标志物Galectin-3的水平较为稳定，适合作为分子标记使用；另外，通过Galectin-3检测胰岛β细胞功能，不受是否进食的影响，只需要取血样一次就能准确获取检测结果，对病人的伤害较小，而且检测简单易实施。可见，本发明提供的利用Galectin-3评估胰岛β细胞功能较现有技术OGTT检测评述血糖水平和胰岛素水平，具有明显的优势。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。