一种磁驱动铁锰相变纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及靶向药物技术领域，具体涉及一种磁驱动铁锰相变纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

高强度聚焦超声(High Intensity Focused Ultrasound,HIFU)因具有创伤小、疗效确切和可重复操作等优点，近年来在实体瘤的消融治疗领域展现了巨大的潜力。然而在实际应用中，HIFU疗效的发挥也面临着一些问题，如消融时间较长、消融不完全、周边正常组织损伤等。因此，设计和制备具有优良生物安全性和增效性能的HIFU增效剂，提高HIFU消融效率，对临床治疗实体瘤具有重要的意义。

现有的HIFU增效剂主要以主动靶向和被动靶向为递送策略，存在靶向效率较低的不足。主动靶向通过在增效剂表面修饰特异性识别肿瘤细胞表面受体的分子实现靶向性，但大部分增效剂在进入体内循环系统后被网状内皮系统吞噬，只有很少一部分最终能够到达靶向部位。被动靶向主要基于实体瘤的高通透性和滞留效应，但体内流体静力和物理屏障的阻碍限制了其对肿瘤组织的渗透，降低增效剂透过血管内皮间隙进入肿瘤实现显像和增效治疗的效率。

因此，本领域急需要一种靶向效率高的HIFU增效剂。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种具有磁驱动靶向富集能力的磁驱动铁锰相变纳米粒。

本申请之目的还在于提供上述磁驱动铁锰相变纳米粒的制备方法和应用。

为了实现本发明之目的，本申请提供以下技术方案。

在第一方面中，本申请提供一种磁驱动铁锰相变纳米粒，所述磁驱动铁锰相变纳米粒包括壳体和核体，其中，所述壳体包括端羧基聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)，且所述壳体的内侧添加有Fe

本申请的核体中添加有全氟己烷，全氟己烷在65℃下可发生液气相变，使纳泡膨胀为微泡，增加HIFU疗效。同时，本申请的核体中还添加有MnO

本申请将PLGA作为壳体，端羧基聚乳酸乙醇酸通常为线型的高分子嵌段共聚物，具有良好的成膜、成囊性，在生物体内外都能降解，在体内降解时表现出良好的生物相容性，最终降解产物为CO

另外，本发明主要是通过磁场驱动Fe

在第一方面的一种实施方式中，所述PLGA、Fe

在第一方面的一种实施方式中，所述Fe

在第一方面的一种实施方式中，所述磁驱动铁锰相变纳米粒的粒径为150～400nm。

在第二方面，本申请还提供一种如上所述磁驱动铁锰相变纳米粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将牛血清白蛋白溶于水，滴加KMnO

(2)将铁源、油酸以及油胺混合，在惰性环境下使其加热并进行反应，反应结束后冷却，然后多次洗涤及过滤，得到的沉淀物溶解于有机溶剂中，低温储存，得到油酸修饰的Fe

(3)将PLGA溶于有机溶剂中，然后加入步骤(1)制得的水溶性MnO

本发明中我们采用了水油水(W/OW)双乳化法制备纳米球，第一步先用将PLGA及油酸修饰的Fe

在第二方面的一种实施方式中，在步骤(1)中，所述制备方法包括如下至少一项：

11)所述KMnO

12)所述牛血清白蛋白与KMnO

13)所述搅拌的速率为400～600rpm；

14)所述反应的时间为3～5min；

15)所述离心使用10w分子量超滤管，离心参数为5000g，10min；

16)所述水溶性MnO

在第二方面的一种实施方式中，在步骤(2)中，所述制备方法包括如下至少一项：

21)所述铁源包括乙酰丙酮酸铁(III)；

22)所述铁源、油酸以及油胺的质量比为(1.2～1.6)：(7.5～10.5)：(7.0～9.5)；

23)反应温度为120～300℃；

24)所述洗涤包括如下操作：将反应物料置于乙醇中，离心分离出沉淀，然后将沉淀干燥后置于正己烷中，再次离心分离得到沉淀，完成1次洗涤，且步骤(2)中要经过至少3次洗涤；

25)所述有机溶剂为氯仿；

26)所述油酸修饰的Fe

在第二方面的一种实施方式中，在步骤(2)中，所述反应分阶段进行，包括如下阶段：

先以3～5℃/min的速率将混合物从室温升温至100～120℃，并恒温保持2～4h；然后以3～5℃/min的速率升温至200～220℃，再次恒温保持20～40min；然后以2～4℃/min的速率升温至280～300℃，再次恒温保持20～40min。

在第二方面的一种实施方式中，在步骤(3)中，所述制备方法包括如下至少一项：

31)所述有机溶剂为氯仿；

32)所述PLGA、步骤(1)制得的水溶性MnO

33)所述第一次超声乳化所使用的超声探头功率为120～160W，乳化时间为20～40s；

34)所述聚乙烯醇溶液中聚乙烯醇的质量体积比为5％～8％；

35)所述第二次超声乳化所使用的超声探头功率为120～160W，乳化时间为20～40s；

36)每次所述离心所用的转速为5000～8000rpm，离心时间为5～10min；

37)所述洗涤采用去离子水；

38)所述离心、洗涤的次数为至少3次。

在第三方面，本申请还提供一种如上所述磁驱动铁锰相变纳米粒的应用，所述磁驱动铁锰相变纳米粒用于制备治疗实体肿瘤的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1)本申请所提供的铁锰相变纳米粒，具有超声响应性，能够将声能转变为热能，由纳泡变为微泡，用于提高HIFU对病灶的消融效果；

2)本申请所提供的铁锰相变纳米粒，具有磁性，可受磁场控制，定向移动，有利于纳米粒在肿瘤部位的聚集；

3)本申请所提供的铁锰相变纳米粒，在肿瘤微酸环境中，可释放Mn

附图说明

图1a是实施例1中铁锰相变纳米粒的透射电镜照片。

图1b是实施例1中铁锰相变纳米粒的元素能谱分析图。

图2a是实施例1中铁锰相变纳米粒的扫描电子显微镜照片(100nm：1cm)。

图2b是实施例1中铁锰相变纳米粒的扫描电子显微镜照片(200nm：1cm)。

图3a是实施例1中铁锰相变纳米粒在未施加超声时发生液气相变的明场照片。

图3b是实施例1中铁锰相变纳米粒在施加0.5W/cm

图3c是实施例1中铁锰相变纳米粒在施加1.0W/cm

图3d是实施例1中铁锰相变纳米粒在施加1.5W/cm

图4是实施例1中铁锰相变纳米粒受磁场驱动的照片。

图5是实施例1中铁锰相变纳米粒HIFU治疗增效图。

图6a是实施例1中不同组对荷瘤小鼠的瘤体内cGAS-STING通路相关基因的表达结果。

图6b为实施例1中不同组对荷瘤小鼠的瘤体内I型干扰素IFN-β的表达水平。

图6c为实施例1中不同组对荷瘤小鼠的肿瘤区域DC细胞的活化结果。

图6d为实施例1中不同组对荷瘤小鼠的瘤体内CD8

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101,102等，以及所有的子范围，例如100到166,155到170,198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。还应指出，本文中的术语“第一”、“第二”等不限定先后顺序，只是为了区分不同结构的物质。

关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，除了对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

本发明的第一个目的是针对现有HIFU增效剂靶向效率低的不足，提供一种具有磁驱动靶向富集能力的HIFU增效剂。

本发明的第二个目的是针对HIFU治疗肿瘤易残留的问题，提供增效HIFU治疗还能通过激活cGAS-STING通路增强机体肿瘤免疫杀伤的铁锰相变颗粒，有利于消灭肿瘤残余病灶。

为实现上述两个目的，本发明提供了一种具有HIFU增效与免疫激活功能的磁驱动铁锰相变纳米粒，该纳米粒为壳核结构，外壳层由生物可降解的PLGA构成，外壳层内含油酸修饰的Fe

所述铁锰相变纳米粒的成分中，PLGA、Fe

所述铁锰相变纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备水溶性MnO

2)制备油酸修饰的Fe

3)称取PLGA 50mg置于50ml离心管中，用移液管吸取3ml氯仿加入上述离心管中溶解PLGA；

4)第1次乳化，将50～100μL Fe

5)将4)溶液倒入10mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5～8w/v％)中；

6)第2次乳化，将5)溶液使用功率140W超探头在冰浴中乳化混合30s；

7)将6)溶液加入15～20ml异丙醇中，置于冰浴中过夜稳定，萃取氯仿；

8)将7)溶液在9000rpm离心10min，用去离子水洗涤，重复4次，将最终纳米复合材料储存在4℃下以备将来使用。

本申请能产生的有益效果包括：

1)本申请所提供的铁锰相变纳米粒，具有超声响应性，能够将声能转变为热能，由纳泡变为微泡，用于提高HIFU对病灶的消融效果；

2)本申请所提供的铁锰相变纳米粒，具有磁性，可受磁场控制，定向移动，有利于纳米粒在肿瘤部位的聚集；

3)本申请所提供的铁锰相变纳米粒，在肿瘤微酸环境中，可释放Mn

在下述实施例及对比例中，PLGA购于山东岱罡生物科技有限公司，全氟己烷(PFH)购于上海阿达玛斯试剂有限公司，牛血清白蛋白(BSA)购于德国Sigma-Aldrich贸易有限公司，乙酰丙酮酸铁购于上海阿达玛斯试剂有限公司，其余物料均为市售常见物料，对其型号不做具体说明。

下面将对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种具有HIFU增效与免疫激活功能的磁驱动铁锰相变纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取PLGA 50mg置于50ml离心管中，用移液管吸取3ml氯仿加入上述离心管中溶解PLGA；

(2)第1次乳化，将100μL Fe3O4 NPs(26mg/mL)、200μL PFH、100μL MnO

(3)将(2)溶液倒入10mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5w/v％)中；

(4)第2次乳化，将(3)溶液使用功率140W超探头在冰浴中乳化混合30s；

(5)将(4)溶液加入15ml异丙醇中，置于冰浴中过夜稳定，萃取氯仿；

(6)将(5)溶液在9000rpm离心10min，用去离子水洗涤，重复4次，将最终纳米复合材料储存在4℃下以备将来使用。

实施例2

一种具有HIFU增效与免疫激活功能的磁驱动铁锰相变纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取PLGA 50mg置于50ml离心管中，用移液管吸取3ml氯仿加入上述离心管中溶解PLGA；

(2)第1次乳化，将75μL Fe3O4 NPs(26mg/mL)、150μL PFH、75μL MnO

(3)将(2)溶液倒入10mL聚乙烯醇(PVA)溶液(7w/v％)中；

(4)第2次乳化，将(3)溶液使用功率140W超探头在冰浴中乳化混合30s；

(5)将(4)溶液加入15ml异丙醇中，置于冰浴中过夜稳定，萃取氯仿；

(6)将(5)溶液在9000rpm离心10min，用去离子水洗涤，重复4次，将最终纳米复合材料储存在4℃下以备将来使用。

实施例3

一种具有HIFU增效与免疫激活功能的磁驱动铁锰相变纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取PLGA 50mg置于50ml离心管中，用移液管吸取3ml氯仿加入上述离心管中溶解PLGA；

(2)第1次乳化，将50μL Fe3O4 NPs(26mg/mL)、100μL PFH、50μL MnO

(3)将(2)溶液倒入10mL聚乙烯醇(PVA)溶液(10w/v％)中；

(4)第2次乳化，将(3)溶液使用功率140W超探头在冰浴中乳化混合30s；

(5)将(4)溶液加入20ml异丙醇中，置于冰浴中过夜稳定，萃取氯仿；

(6)将(5)溶液在9000rpm离心10min，用去离子水洗涤，重复4次，将最终纳米复合材料储存在4℃下以备将来使用。

对比例1

Fe相变纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取PLGA 50mg置于50ml离心管中，用移液管吸取3ml氯仿加入上述离心管中溶解PLGA；

(2)第1次乳化，将50μL Fe3O4 NPs(26mg/mL)、100μL PFH添加入(1)溶液中，使用功率为140W的超声探头在冰浴中乳化混合物30s；

(3)将(2)溶液倒入10mL聚乙烯醇(PVA)溶液(5w/v％)中；

(4)第2次乳化，将(3)溶液使用功率140W超探头在冰浴中乳化混合30s；

(5)将(4)溶液加入15ml异丙醇中，置于冰浴中过夜稳定，萃取氯仿；

(6)将(5)溶液在9000rpm离心10min，用去离子水洗涤，重复4次，将最终纳米复合材料储存在4℃下以备用。

测试实施例

将实施例1制备得到的铁锰相变纳米粒的去离子水溶液进行高分辨率透射电镜扫描，得到结果如图1a、图1b所示。从图中我们可见铁锰相变纳米粒为黑色颗粒，透射电镜示其粒径约为150nm，且有Fe元素和Mn元素的存在。

将实施例1制得的铁锰相变纳米粒在不同分辨率下进行扫描电镜测试，结果如图2a、图2b所示，图中可见该纳米粒外观为球形。

将实施例1～3制备得到的铁锰相变纳米粒进行ICP检测，测得Fe

将实施例1制得的铁锰相变纳米粒在不同功率(0、0.5、1.0、1.5W/cm

将实施例1制得的铁锰相变纳米粒置于可控的磁场中，使其进行不同的运动，如图4所示，证明该铁锰相变纳米粒可受磁驱动。

向猪瘦肉局部注射100μg/mL的由实施例1制备的铁锰相变纳米粒，另一组注射相同体积的生理盐水，分别用90W、120W和150W功率的HIFU作用，结果如图5所示，可以发现，随着HIFU功率的增加，消融灶的体积增加，且与对照组相比，铁锰相变纳米粒注射后，显著增加HIFU消融灶的体积(P＜0.01)，证明铁锰相变纳米粒具有良好的HIFU增效能力。

于6周大的雄性Balb/c小鼠皮下注射10

上述对实施例的描述是为了便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本申请。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其它实施例中而不必付出创造性的劳动。因此，本申请不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本申请披露的内容，在不脱离本申请范围和精神的情况下做出的改进和修改都在本申请的范围之内。