丝胶蛋白微支架的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，尤其涉及丝胶蛋白微支架的制备方法及应用。

背景技术

丝胶蛋白是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子蛋白。近年来，随着对丝胶蛋白生物学性能的深入研究，表明丝胶蛋白具有良好的生物相容性、生物可降解性、抗氧化性、细胞黏附性等，已经在生物医学领域得到广泛应用，尤其是组织工程和再生医学领域。

丝胶蛋白已经被制备成水凝胶、泡沫、纺丝纤维等组织工程支架，用于外周神经、心肌、皮肤、骨等损伤修复。支架微纳拓扑结构在细胞的生长、增殖、分化等方面发挥着重要作用，在特定组织中需要不同的微纳结构实现对细胞精准调控，促进组织再生。传统的支架成型方法(如铸模法、静电纺丝法、冻干法等)，这些支架成型方法难以对支架孔隙结构大小、贯通性、表面结构等微观结构实现精确控制。3D打印技术实现了对支架外形的可控制造，但常规的3D打印技术很难实现100微米以下的结构的精准控制，不能准确模拟细胞生长的微环境。

双光子飞秒激光直写技术是一种先进的3D打印技术，可以突破光衍射极限，实现纳米级的打印精度，理论上可以实现更加精细、复杂的微支架结构。因此，本发明为构建精确模拟细胞生长微环境的丝胶蛋白三维微支架，使用双光子飞秒激光直写技术对甲基丙烯酰化丝胶蛋白进行加工，证明其在组织工程领域的应用前景。

发明内容

针对上述问题，本发明提供丝胶蛋白微支架的制备方法及应用，主要解决了现有的丝胶蛋白无法直接通过3D打印技术进行打印，限制了丝胶蛋白在组织工程领域的应用。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

S1.丝胶蛋白光刻胶的制备

S11.提取丝胶蛋白：取去除水分的蚕茧，加入Na

S12.取丝胶蛋白粉末：溶解在酸性缓冲液中，配制丝胶蛋白溶液，加入甲基丙烯酸酐，反应完成后透析，冻干后得到甲基丙烯酰化丝胶蛋白粉，

S13.取甲基丙烯酰化丝胶蛋白，溶解在磷酸盐缓冲液或去离子水中，配制丝胶蛋白溶液，加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐，得到丝胶蛋白光刻胶备用；

S2.双光子直写丝胶蛋白微支架：通过双光子飞秒激光直写技术将丝胶蛋白光刻胶打印成丝胶蛋白微支架，其中，激光强度为10-40mW，扫描速度为100-1000μm/s，飞秒激光器的波长为700-1000nm。

将丝胶蛋白用于3D直写制备微支架，制备的丝胶蛋白支架具有高度可控性和可重复性，可以制备出预先设计的不同结构。且使用基于双光子聚合的3D直写技术，制备的丝胶蛋白支架具有高度可控的精度，单线精度可达几百纳米，能够制备具有多孔的三维微支架。使用丝胶蛋白作为光刻胶，在打印出高精度的微支架的同时，基于丝胶蛋白本身具有的良好生物相容性、细胞粘附性，可以支持细胞黏附生长，其在组织工程领域潜在的应用前景。

其中，所述双光子飞秒激光直写技术通过飞秒激光双光子直写平台实施，所述飞秒激光双光子直写平台包括飞秒激光脉冲系统、亚微米级精度运动平台、光路系统、CCD监控系统、控制电脑。

在一些情况中，所述双光子飞秒激光直写技术的操作步骤为通过设计软件设计不同的三维模型，导出为stl文件导入到打印机中，获得建模数据；取洁净玻片，通过真空等离子清洗机和硅氧烷处理玻片表面备用；取适量光刻胶到处理后的玻片上，然后放置到打印机载物台上，打印生物支架；打印完成后，将玻片浸没到去离子水中去除多余没有固化的材料，得到打印的丝胶蛋白微支架。

在一些情况中，在步骤S12中，缓冲液的pH为8.5(±1误差可接受)，丝胶蛋白溶液浓度为1％(w/v)；

步骤S13中，丝胶蛋白溶液浓度为15％(w/v)，加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐后终浓度为0.1％。

在一些情况中，步骤S12中，加入甲基丙烯酸酐后在35-37℃反应；缓冲液为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲。

其中，具体而言，所述应用方法为将丝胶蛋白微支架经环氧乙烷消毒灭菌后，在微支架上接种了施万细胞(接种方式参考现有)，体外培养。

在一些情况中，所述施万细胞为人施万细胞GFP-RSC96，或与人施万细胞GFP-RSC96类似的施万细胞。

本发明的有益效果是：

该方法实现了将丝胶蛋白用于制备3D打印光刻胶，且该方法稳定，可以形成任意微纳结构；丝胶蛋白微支架可以更好的模拟体内细胞外基质的微观结构，用于体外调控细胞行为、组织工程等研究。

附图说明

图1为不同pH条件下反应体系的图片；

图2为丝胶蛋白光刻胶和飞秒激光三维直写平台的组成；

图3为不同激光功率打印丝胶蛋白成型情况；

图4为不同激光条件下丝胶蛋白三维成型情况；

图5为打印的丝胶蛋白微支架；

图6为施万细胞在丝胶蛋白微支架上的生长情况；

图7为不同时间点施万细胞在丝胶蛋白微支架上的生长情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步说明。

1.丝胶蛋白光刻胶的制备：

(1)甲基丙烯酰化丝胶蛋白的制备：

提取丝胶蛋白：称取5g蚕茧(丝素缺陷型蚕茧)，剪碎用水洗净，去除水分；按每克蚕茧加入40mL 0.02mol/LNa

(2)甲基丙烯酰化丝胶蛋白制备：

称取上述丝胶蛋白粉末，溶解在pH8.5的磷酸盐缓冲液中，得到1％(w/v)丝胶蛋白溶液；按每克丝胶蛋白加入0.6g的甲基丙烯酸酐，于35℃反应24小时；反应完成后转移到透析袋(Mw＝3500Da)中，去离子水透析3天，冻干后得到甲基丙烯酰化丝胶蛋白粉。图1展示了不同pH条件下反应体系的图片，中性和酸性条件下丝胶蛋白会变性沉淀，冻干后产物难以溶解。

(3)丝胶蛋白光刻胶制备：

称取上述得到的甲基丙烯酰化丝胶蛋白，溶解在磷酸盐缓冲液或去离子水中，配置15％(w/v)的丝胶蛋白溶液，加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)，终浓度为0.1％，得到丝胶蛋白光刻胶备用。

2.双光子直写丝胶蛋白微支架：

(1)飞秒激光双光子直写平台搭建：实例图2展示了平台组成，包括飞秒激光脉冲系统、亚微米级精度运动平台、光路系统、CCD监控系统、控制电脑。

(2)丝胶蛋白三维微支架的双光子聚合直写方法过程为：预制模型、激光直写、显影。

通过Solidworks、CAD等软件，设计不同的三维模型，导出为stl文件导入到打印机中，获得建模数据；取洁净玻片，通过真空等离子清洗机和硅氧烷处理玻片表面备用；取适量光刻胶到处理后的玻片上，然后放置到打印机载物台上，打印生物支架；打印完成后，将玻片浸没到去离子水中30分钟后取出，去除多余没有固化的材料，得到打印的丝胶蛋白微支架。图3展示了不同激光功率下直写成型情况，在激光功率2-20mW范围内均能成型，打印线宽可达几百纳米。进一步的，选取了几个激光功率进行三维成型能力测试，使用不同激光功率打印30×30×5微米的块状结构，如图4所示，双光子直写甲基丙烯酰化丝胶蛋白具有较好的三维成型能力。

为了使本方案可以制备更加复杂的微结构，设计了不同的打印模型，如图5，可以打印出预先设计的各种三维结构。本发明可以通过对不同组织微环境进行分析建模，打印出特定的丝胶蛋白微支架，用于不同细胞调控、组织工程应用等。

3.丝胶蛋白微支架用于施万细胞培养

基于上述打印的丝胶蛋白曲线结构，经环氧乙烷消毒灭菌后，在微支架上接种了绿色荧光蛋白标记的人施万细胞(GFP-RSC96)，体外培养三天，观察细胞的生长情况如图6所示。本实施例中，图7展示了施万细胞可以在支架上黏附生长，具有沿着线条生长的趋势。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。