一种白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法

技术领域

本发明属于食品和保健品技术领域，具体涉及到一种白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法及酒饮品。

背景技术

中国白酒文化源远流长、博大精深，蕴涵了文化和精神的要求。随着人们健康意识的增强，白酒的饮用舒适度和饮用健康越来越受到消费者的关注和重视。饮用白酒既要满足美好的享受，又要饮后不影响工作和不影响健康。白酒的饮用舒适度一般分为3个层次：饮前舒适、饮中舒适、饮后舒适。其中，饮后舒适是指饮后产生的一系列生理反应，尤其是对神经系统和消化系统的影响，舒适度好的酒具体表现为饮后不上头、不头痛、不口干、醒酒快等。目前，饮前及饮中饮用舒适度的评价主观性较强，由个体差异带来的影响较大。而饮后舒适度的评价，因饮用者会产生一系列生理反应，评价指标更加客观，同时也与酒的饮用健康密切相关。所以，白酒的饮后舒适度能够比较准确、可靠地反映出白酒的品质。

国内外对于饮用舒适度的评价，早期多采用问卷调查形式，就饮用舒适度/宿醉(国外多采用“hangover/宿醉”来表示饮用体验)的一系列体征进行评分后综合判断。近年来，随着生命科学研究手段的不断发展，动物行为学评价方法有望能成为白酒饮后舒适的一种可行的、相对比较客观的评价方法。但现有的动物行为学的评价方法还不够全面、不够系统，没有精准把握动物饮后体内关键参数变化规律，未能找准可表征舒适度的关键生理生化指标及其分析检测方法；未能基于白酒饮后舒适的作用机制(上头、口干)，结合动物行为学特征，多维度、多指标综合评价白酒饮后舒适度。所以，迫切需要构建动物水平综合评价白酒饮后舒适度的科学、客观、可量化的评价方法。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

本发明的其中一个目的是提供白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法，利用适宜的统计分析方法获得饮后舒适度综合分值来评价产品舒适度，形成了一套比较科学、全面、稳定、可靠的白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法，该方法以宿醉小鼠的小脑组织乙醛脱氢酶的酶活、宿醉小鼠的海马体中5-羟色胺含量、宿醉小鼠的脑组织小胶质细胞数量、宿醉小鼠的血清中FGF21蛋白含量、宿醉小鼠的肝组织过氧化氢酶的酶活、肝组织丙二醛的含量、肝组织TNF-α的含量、肝组织谷丙转氨酶的酶活、肝组织乙醛脱氢酶的酶活作为指标。

作为本发明白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法的一种优选方案，其中：：包括测定宿醉小鼠的小脑组织乙醛脱氢酶的酶活、宿醉小鼠的海马体中5-羟色胺含量、宿醉小鼠的脑组织小胶质细胞数量、宿醉小鼠的血清中FGF21蛋白含量、宿醉小鼠的肝组织过氧化氢酶的酶活、宿醉小鼠的肝组织丙二醛的含量、宿醉小鼠的肝组织TNF-α含量、宿醉小鼠的肝组织谷丙转氨酶的酶活、宿醉小鼠的肝组织乙醛脱氢酶的酶活、的工序。

作为本发明白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法的一种优选方案，其中：：所述测定宿醉小鼠的小脑组织乙醛脱氢酶的酶活，分离宿醉小鼠小脑并制成匀浆，按照ALDH检测试剂盒测定ALDH酶活；

所述测定宿醉小鼠的海马体中5-羟色胺含量，收集宿醉小鼠脑组织海马体并制成匀浆，按照5-羟色胺ELISA试剂盒测定5-HT含量；

所述测定宿醉小鼠的脑组织小胶质细胞数量，制作宿醉小鼠脑组织的病理切片，通过IbA计算小胶质细胞数量。

作为本发明白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法的一种优选方案，其中：所述测定宿醉小鼠的血清中FGF21蛋白含量，收集宿醉小鼠血清，按照FGF21 ELISA试剂盒测定FGF21含量。

作为本发明白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法的一种优选方案，其中：：所述测定宿醉小鼠的肝组织乙醛脱氢酶的酶活，取醉酒小鼠肝脏，匀浆后提取蛋白，按照ALDH检测试剂盒测定ALDH酶活；

所述测定宿醉小鼠的肝组织谷丙转氨酶的酶活，取醉酒小鼠肝脏，匀浆后提取蛋白，按照谷丙转氨酶检测试剂盒测定谷丙转氨酶酶活；

所述测定宿醉小鼠的肝组织过氧化氢酶的酶活，取醉酒小鼠肝脏，匀浆后提取蛋白，按照CAT检测试剂盒测定CAT酶活；

所述测定宿醉小鼠的肝组织丙二醛含量，取醉酒小鼠肝脏，匀浆后提取蛋白，按照MDA检测试剂盒测定MDA含量；

所述测定宿醉小鼠的肝组织中TNF-α含量，收集醉酒小鼠肝脏组织，匀浆后提取蛋白，按照ELISA检测试剂盒测定炎症因子TNF-α的表达水平。

作为本发明白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法的一种优选方案，其中：对测定宿醉小鼠的小脑组织乙醛脱氢酶的酶活、宿醉小鼠的海马体中5-羟色胺含量、宿醉小鼠的脑组织小胶质细胞数量、宿醉小鼠的血清中FGF21蛋白含量、宿醉小鼠的肝组织过氧化氢酶的酶活、宿醉小鼠的肝组织丙二醛的含量、宿醉小鼠的肝组织TNF-α含量、宿醉小鼠的肝组织谷丙转氨酶的酶活、宿醉小鼠的肝组织乙醛脱氢酶的酶活进行统计分析，综合分值越高表明酒品饮后舒适度越好

作为本发明白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法的一种优选方案，其中：所述进行统计分析，包括，

对各指标数据进行主成分分析；

利用主成分分析方法计算各个主成分的得分，计算公式为：

F

式中，W

计算综合得分，计算公式为：

F＝α

式中，α

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明解决目前未能立足白酒饮后上头、口干作用机制，缺乏从多维度、多指标进行动物水平综合评价白酒饮后舒适度的方法这一问题，本发明建立了白酒饮酒后舒适度在动物小鼠水平的评价方法。利用适宜的统计分析方法获得饮后舒适度综合分值来评价产品舒适度，形成了一套比较科学、全面、稳定、可靠的白酒饮后舒适度的动物水平综合评价方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例2中小鼠翻正反射实验结果；

图2为本发明实施例2中小鼠转棒实验结果；

图3为本发明实施例2中小鼠饮水实验结果；

图4为本发明实施例3中“上头”情况考察实验结果；

图5为本发明实施例4中“口干”生物标志物含量测定结果；

图6为本发明实施例5中炎症损伤的实验结果；

图7为本发明实施例5中氧化损伤的实验结果；

图8为本发明实施例5中小鼠体内乙醇的代谢速率的实验结果；

图9为本发明实施例6中综合评分1、2、3、4之间的对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

如无特别说明，实施例中所采用的原料均为商业购买。

洋河酒厂人群感官品评认为，M3系列白酒饮后舒适度与出厂年份存在如下关系：年份越久，舒适度越高。根据出厂时间的不同将5个酒样分别标记为M3-1(7年)、M3-2(5年)、M3-3(3年)、M3-4(1年)、M3-5(0年)。

实施例1确定样品致动物小鼠醉酒的剂量和时间等条件

酒样：不同年份M3洋河酒，根据存放时间的不同分别标记为M3-1(7年)、M3-2(5年)、M3-3(3年)、M3-4(1年)、M3-5(0年)。

取32只健康清洁级雌性Balb/c小鼠(6-8周龄，体重18-22g，由维通利华实验动物中心提供)于21±2℃饲养，正常饲料，自由取食，自由饮水，12h昼夜交替条件下饲养。组别设置分为正常对照组；酒精组；实验组。

用灌胃法给小鼠服用不同量的酒样，最低灌胃剂量下的小鼠会呈现的轻微喝醉状态，而最高灌胃剂量下的小鼠会呈现完全醉酒的状态。标准剂量设定为第三个灌胃剂量，在该灌胃剂量下小鼠不会完全醉死。按照文献(张梦妍,郑露,党好,等.浓香型白酒醉酒度评价动物模型的建立[J].现代预防医学,2010,37(19):3.)中已建立的醉度评价模型，对小鼠进行翻正反射、跑滚筒和游泳测试，计算醉度。结果表明，酒精组小鼠灌胃40.8％(v/v)酒精0.13ml/10g，实验组小鼠灌胃相同酒精含量的样品，正常组小鼠灌胃相应体积的PBS。

实施例2动物小鼠饮用不同年份M3醉酒后行为学的考察

(1)翻正反射

24只SPF级小鼠Balb/c雄性小鼠，由维通利华实验动物中心提供，体重18～22g，6～8周龄。随机分为正常组、酒精组、酒样组每组8只。酒精组小鼠灌胃40.8％(v/v)酒精0.13ml/10g，实验组小鼠灌胃相同酒精含量的样品，正常组小鼠灌胃相应体积的PBS。观察小鼠翻正反射情况，记录翻正反射恢复的时间。小鼠的醉酒时间或醒酒时间并不能代表小鼠的醉酒度，因此我们根据上述文献中的公式来计算小鼠的醉酒度。如图1所示，白酒组的醉酒度显著低于乙醇组，且白酒组的醉酒度顺序为M3-1

(2)转棒实验

在翻正反射实验之后，观察小鼠转棒情况，记录小鼠的有效攀爬时间。

如图2所示，乙醇组小鼠在转轴上的时间是186.25±40s，M3-1组小鼠在转轴上的时间是229±25.7s，是乙醇组的1.23倍。M3-2、M3-3、M3-4组小鼠在转轴上的时间与乙醇组相当，M3-5组小鼠在转轴上的时间甚至低于乙醇组，白酒组的掉落时间顺序为M3-1>M3-2>M3-3>M3-4>M3-5。

(3)饮水实验

在小鼠翻正反射恢复后给予饮水。每隔1h检测小鼠饮水量。

如图3所示，在小鼠醉酒后的6h后，M3-5和乙醇组小鼠的饮水量最高，M3-1组小鼠的饮水量最低。白酒组的饮水量顺序为M3-1

通过上述实验可以看出，年份越长的白酒，小鼠醉酒度越低，醒酒越快，运动协调能力受到的干扰越小，越不容易口干。

实施例3小鼠饮用不同年份M3酒样后“上头”情况考察

6h后处死小鼠，分离实验小鼠小脑并制成匀浆，按照ALDH检测试剂盒操作流程测定ALDH；收集实验小鼠脑组织海马体并制成匀浆，按照5-羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒操作流程测定5-HT含量、按照γ-GABA的ELISA试剂盒操作流程测定γ-GABA含量。

如图4所示，饮酒后小鼠的小脑ALDH酶活和γ-GABA含量会升高，5-HT含量会降低，而白酒组中，ALDH酶活和γ-GABA含量的顺序为：M3-1M3-2>M3-3>M3-4>M3-5。

实施例4白酒饮后“口干”生物标志物含量测定

6h后处死小鼠，在冰上取下各组小鼠的下丘脑。按1:9加入RIPA蛋白裂解液进行研磨，5000rpm离心10min，取上清。利用FGF21试剂盒检测各组小鼠下丘脑中FGF21含量。

如图5所示，乙醇组小鼠血清的FGF21含量显著高于对照组，白酒组的FGF21含量的顺序为：M3-1

实施例5试验小鼠饮用不同年份M3后血液、肝组织、脑组织等部位的炎症损伤、氧化损伤等主要生理生化指标的测定

炎症损伤：6h后处死小鼠，制作实验小鼠脑组织的病理切片，通过IbA和CD68双染计算小胶质细胞数量，评价脑部炎症情况；

图6中IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的实验方法：取肝脏组织研磨后，3000rpm 4℃离心10min，吸取上清液，根据ELISA检测试剂盒分别检测小鼠肝脏组织中的IL-1β和TNF-α的含量；研磨并裂解脑组织，提取mRNA，反转录得到cDNA，用iNOS引物进行PCR，于核酸成像仪中拍照并对iNOS条带做灰度分析得到其mRNA相对表达量。

如图6所示，对小鼠脑组织以及肝脏组织的炎症损伤情况进行检测，我们可以得出白酒组小鼠炎症损伤情况为：M3-1

氧化损伤：6h后处死小鼠，取实验小鼠的肝组织并制成匀浆，依据不同检测试剂盒的说明，按需测定代谢酶(ALT、AST、CAT、MDA、GSH、SOD)的表达/活性。

如图7所示，通过对小鼠肝脏损伤标志物以及肝脏抗氧化酶的检测，我们可以得出白酒组小鼠肝脏氧化损伤程度的顺序为：M3-1

ADH/ALDH/CYP2E1酶活检测：取醉酒小鼠肝脏，匀浆后提取蛋白，按照ADH、ALDH、CYP2E1酶活检测试剂盒的说明书进行检验。

如图8所示，通过对小鼠肝脏中乙醇代谢关键酶ADH、ALDH的酶活进行检测，我们可以得出白酒组小鼠体内乙醇的代谢速率顺序为：M3-1>M3-2>M3-3>M3-4>M3-5。

通过对小鼠肝脏中乙醇代谢关键酶CYP2E1 mRNA表达进行检测，我们可以得出白酒组小鼠体内乙醇的代谢速率顺序为：M3-3>M3-4>M3-5>M3-2>M3-1。

实施例6样品饮后舒适度各项评价指标的统计分析及综合分值的计算

通过SPSS软件和最小二乘法对样品各项评价指标的数据进行统计分析，获得待测样品的饮后舒适度综合评分。

①根据实施例3～5中的结果，对五组不同类型实验数据进行综合分析。

②对样品的各指标数据进行PCA分析，提取2个公共因子，可以反映原变量91.035％的方差。

③利用主成分分析方法计算各个主成分的得分，计算公式为：

F

公式(1)中，

④计算综合得分，计算公式为：

F＝α

⑤对实施例中所用不同年份洋河梦3酒(M3-1、M3-2、M3-3、M3-4、M3-5)样品的各项评价指标的数据进行标准化处理后代入公式(2)、(3)、(5)并作统计分析。

首先对实施例3～5所有结果进行SPSS得分计算，得到综合评分1。

将与综合评分1规律不一致的两个指标(小鼠脑组织iNOS mRNA表达和CYP2E1mRNA表达)去掉，得到综合评分2。

分别选取了“上头”指标中的小鼠小脑ALDH酶活和小鼠海马体GABA含量，“口干”指标中的血清FGF21含量，氧化指标中的CAT和GSH、炎症指标小鼠脑组织小胶质细胞数量和肝脏TNF-α含量、肝损指标ALT以及乙醇代谢指标中肝脏ALDH酶活，统计分析得到综合评分3。

分别选取了“上头”指标中的小鼠小脑ALDH酶活和小鼠海马体5-HT含量，“口干”指标中的血清FGF21含量，氧化指标中的CAT和MDA、炎症指标小鼠脑组织小胶质细胞数量和肝脏TNF-α含量、肝损指标ALT以及乙醇代谢指标中肝脏ALDH酶活，统计分析得到综合评分4。

统计结果如表1所示。

表1

结果表明，上述4套方法评价的梦3系列白酒的饮后舒适度顺序均为：M3-1>M3-2>M3-3>M3-4>M3-5，该结果与人群感官品评结果一致，表明所建立的白酒饮后舒适度动物水平评价方法适具有可行性。分别计算EtOH和5个酒样综合评分与Ctrl组的差值，然后将EtOH组的差值定义为1，绘制相对差值的柱状图，如图9所示。结果表明，综合评分4既简便，又能够以较合理且具有区分度的形式反映年份酒与饮后舒适度的关系。

实施例7评价方法的验证

在本实验室的前期研究中，发现橄榄苦苷是提高酒饮后舒适度的优选天然活性物质，选用橄榄苦苷验证评价方法的可靠性。

按照实施例3～5的方法，将小鼠随机分为生理盐水对照组、酒精组、橄榄苦苷组每组8只，并以公认的会降低白酒饮后舒适度的异戊醇作对照。橄榄苦苷组提前30min灌胃50mg/kg橄榄苦苷溶液，异戊醇组提前30min灌胃浓度0.0065％异戊醇溶液，其余组给予生理盐水。酒精组、橄榄苦苷组、异戊醇组均灌胃42％(v/v)酒精0.12mL/10g。

按照综合评分4的标准对生理盐水对照组、酒精组、橄榄苦苷组、异戊醇组的综合得分进行计算，计算结果如表2所示。

表2

可以看出，酒精组小鼠评分远低于生理盐水对照组，证明白酒饮后舒适度降低；而作为白酒中公认的对饮后舒适度不利的异戊醇，其综合评分则低于单纯酒精；与酒精组相比，橄榄苦苷可以有效缓解白酒饮后舒适度，实验结果进一步说明了综合评分4的评价方法的可靠性或有效性。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。