一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法

技术领域

本发明涉及尿路感染技术领域，更具体地说，本发明涉及一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法。

背景技术

尿路致病性大肠杆菌(UPEC)是尿路感染(UTI)的主要致病病原体，尿路感染也是全世界常见的细菌感染病之一，在先天免疫系统中，上皮细胞和巨噬细胞是最重要的组成部分，在防御UPEC入侵中起着关键作用，但是上皮细胞和巨噬细胞之间的通讯途径并未完全了解，外泌体是一种微细胞器或小囊泡，它们存在于细胞内，将细胞内的信号分子、蛋白质和RNA包裹在小囊泡内传递给其他细胞，从而调控免疫反应、细胞增殖以及凋亡，利用外泌体将废物分子释放到细胞外部，以维持细胞内环境的稳定，外泌体在细胞间通信中扮演着重要角色，帮助不同类型细胞互相作用，并协调生物体的生理活动，目前还没有明确的试验方法用于揭示被称为外泌体的膜结合纳米囊泡在UPEC感染期间介导细胞间通讯中的作用，无法知晓外泌体对于尿路致病性大肠杆菌调控尿路感染的调控机制，没有对上皮细胞和巨噬细胞之间相互通讯进行明确的数据分析。为了解决上述问题，现提供一种技术方案。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法，提出明确的试验方法揭示被称为外泌体的膜结合纳米囊泡在UPEC感染期间介导细胞间通讯中的作用，获取外泌体对于尿路致病性大肠杆菌调控尿路感染的调控机制，对上皮细胞和巨噬细胞之间相互通讯进行明确的数据分析。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法，包括如下步骤：

步骤一，制备MB49-Exo和MB49-U-Exo样品，在体内和体外分别进行三次独立实验，观察小鼠巨噬细胞对MB49-Exo和MB49-U-Exo样品的摄取情况；

步骤二，MB49-U-Exo加重UPEC诱导的膀胱炎：小鼠接受膀胱内注射外泌体，1天后经尿道膀胱内注射UPEC，使用流式细胞仪分析感染2天后小鼠膀胱内F4/80

步骤三，MB49-U-Exo诱导巨噬细胞分泌促炎细胞因子：将BMDMs分别与MB49-Exo、MB49-U-Exo共孵育，通过转录组测序分析基因表达谱，外泌体刺激后对BMDMs进行细胞因子阵列检测，检测各处理组BMDMs中Tnfα的相对表达及BMDMs中TNFα的相对表达；

步骤四，MB49-U-Exo通过激活MAPK/ERK、MAPK/JNK通路诱导巨噬细胞产生TNFα：获取MB49-U-Exo和MB49-Exo分别处理后BMDMs中ERK、P38、JNK、P65磷酸化和总蛋白表达水平，PBS、PD98059、MB49-U-Exo、PD98059联合MB49-U-Exo处理后BMDMs中ERK磷酸化和总蛋白表达水平，以及PBS、SP600125、MB49-U-Exo、SP600125联合MB49-U-Exo处理后BMDMs中JNK磷酸化和总蛋白表达水平，用PBS、MB49-U-Exo或PD98059、SP600125刺激BMDMs后收集上清，测定TNFα的水平；

步骤五，MB49-U-Exo抑制巨噬细胞吞噬能力：用MB49-Exo或MB49-U-Exo处理BMDMs24小时后与FITC-E.coli共孵育1小时，获取数据分析结果，用MB49-Exo或MB49-U-Exo处理BMDMs 24小时后与EGFP-UPEC共孵育，获取数据分析结果；

步骤六，MB49-U-Exo通过诱导巨噬细胞产生TNFα导致其凋亡：获取PBS、MB49-Exo或MB49-U-Exo处理后的BMDMs中凋亡细胞占比，同时PBS、MB49-U-Exo、TNFα中和抗体或TNFα中和抗体联合MB49-U-Exo处理后的BMDMs中凋亡细胞占比；

步骤七，抑制MB49-U-Exo介导的TNFα产生改善UPEC诱导的膀胱炎：使用PBS、GW4869、TNFα中和抗体分别治疗UPEC诱导的膀胱炎小鼠，膀胱内注射等体积PBS的小鼠作为膀胱炎小鼠的对照，获取小鼠膀胱中F4/80

步骤八，MB49-U-Exo通过递送miR-18a-5p诱导JNK活化和TNFα产生：收集MB49-Exo和MB49-U-Exo，使用小鼠miRNA微阵列分析芯片进行差异表达miRNA分析。

作为本发明进一步的方案，在步骤一中，制备MB49-Exo和MB49-U-Exo样品的具体流程包括：

步骤a1：选取尿路致病性大肠杆菌在培养皿中培养，感染MB49细胞；

步骤a2：通过离心方法分离培养皿中的上清液，使用差速离心法分离上清液，获取MB49-Exo和MB49-U-Exo样品；

步骤a3：使用电子显微镜获取MB49-Exo和MB49-U-Exo样品的代表性透射电子显微图像，比例尺为100nm，使用纳米粒度电位仪测量MB49-Exo和MB49-U-Exo的粒径分布，利用蛋白免疫印迹显示外泌体标记蛋白CD63和HSP90在外泌体或MB49细胞中的表达情况，利用BCA法检测两种MB49-Exo和MB49-U-Exo的蛋白浓度。

作为本发明进一步的方案，在步骤一中，在体内和体外分别进行三次独立实验，观察小鼠巨噬细胞对样品的摄取情况的具体方法为：使用流式细胞学分析小鼠接受荧光染料叠氮花菁-Cy5.5标记外泌体膀胱内注射12小时后，CD45

作为本发明进一步的方案，在步骤二中，小鼠接受膀胱内注射外泌体的剂量为1μg，经尿道膀胱内注射UPEC的剂量为1.0×10

作为本发明进一步的方案，在步骤三中，将BMDMs与MB49-Exo、MB49-U-Exo共孵育的时间为3小时，外泌体刺激后对BMDMs进行细胞因子阵列检测，使用双因素方差分析进行统计学分析，用RT-PCR检测不同处理组BMDMs中Tnfα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析，用ELISA检测不同处理组BMDMs中TNFα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析。

作为本发明进一步的方案，在步骤四中，MB49-U-Exo和MB49-Exo分别处理的实验均重复三次，PBS、PD98059、MB49-U-Exo、PD98059联合MB49-U-Exo处理实验中，PD98059的剂量为20μM，PBS、SP600125、MB49-U-Exo、SP600125联合MB49-U-Exo处理实验中，SP600125的剂量为40nM，用PBS、MB49-U-Exo或PD98059、SP600125刺激BMDMs后处理，以上实验均重复三次，且使用单因素方差分析进行统计学分析。

作为本发明进一步的方案，在步骤五中，用MB49-Exo或MB49-U-Exo的剂量为10μg/mL，处理BMDMs 24小时后与FITC-E.coli的孵育剂量为50μg/mL，孵育时长为1小时，获取数据分析结果的方式均为共聚焦显微成像技术和流式细胞分析技术，均使用t检验进行统计学分析。

作为本发明进一步的方案，在步骤六中，获取的数据使用单因素方差分析进行统计学分析，PBS、MB49-U-Exo、TNFα中和抗体或TNFα中和抗体联合MB49-U-Exo处理实验中TNFα中和抗体的浓度为100ng/mL。

作为本发明进一步的方案，在步骤七中，使用PBS、GW4869、TNFα中和抗体分别治疗UPEC诱导的膀胱炎小鼠的GW4869剂量为2.5μg/g，TNFα中和抗体的剂量为0.2μg/g，治疗膀胱炎小鼠的时长为3天，小鼠膀胱切片HE染色图像的比例尺为100μm，进行不同处理组组织病理学评分比较的数据，使用单因素方差分析进行统计学分析，平板菌落计数法显示不同处理组中小鼠膀胱UPEC细菌负荷中，以log CFU/膀胱表示，使用单因素方差分析进行统计学分析。

作为本发明进一步的方案，在步骤八中，使用小鼠miRNA微阵列分析芯片进行差异表达miRNA分析的具体方法包括：

步骤b1：预测miR-130a-3p、miR-21a-5p和miR-18a-5p与PTEN基因3'UTR的结合位点；

步骤b2：利用蛋白免疫印迹显示转染miRNA模拟物6小时后的BMDMs中PTEN、JNK磷酸化和总蛋白表达水平；

步骤b3：用RT-PCR检测miRNA模拟物转染后BMDMs中Tnfα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析；

步骤b4：使用差速离心法分别从急性膀胱炎患者和健康志愿者的尿液中提取外泌体，并用RT-PCR检测尿液外泌体中miR-18a-5p的表达水平，使用t检验进行统计学分析。

本发明一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法的技术效果和优点：本发明通过提出的试验方法说明了UPEC感染后膀胱上皮细胞来源的外泌体能够诱导巨噬细胞产生过量的TNFα，导致巨噬细胞凋亡，并抑制其吞噬功能，使用外泌体分泌抑制剂GW4869或TNFα中和抗体都能通过减少巨噬细胞和中性粒细胞浸润，促进UPEC清除从而显著改善UPEC诱导的膀胱炎的病理状态，提出UPEC感染时膀胱上皮细胞和巨噬细胞之间以外泌体的形式实现交互并调节宿主的免疫反应，揭示了UPEC调节尿路感染的潜在机制。

附图说明

图1为UPEC感染诱导膀胱上皮细胞释放外泌体的分析组图，其中，A图为MB49-Exo和MB49-U-Exo的代表性透射电子显微镜图像，B图为外泌体粒径分布图，C图为外泌体标记蛋白CD63和HSP90在外泌体或MB49细胞中的表达情况示意图，D图为MB49-Exo和MB49-U-Exo两种外泌体的蛋白浓度t检验统计学分析图；

图2为巨噬细胞在体内摄取膀胱上皮细胞来源外泌体的分析组图，其中，A图为小鼠接受荧光染料叠氮花菁-Cy5.5标记外泌体膀胱内注射12小时后，CD45

图3为BMDMs在体外摄取膀胱上皮细胞来源外泌体的分析组图，其中，A，图为Cy5.5标记的外泌体或PBS对照处理后BMDMs中Cy5.5的平均荧光强度(MFI)图，B图为三次独立实验结果的柱状统计图，C图为CD11b

图4为MB49-U-Exo增加膀胱炎时巨噬细胞和中性粒细胞浸润分析组图，其中，A图为UPEC诱导小鼠膀胱炎实验中MB49-Exo和MB49-U-Exo预处理的示意图，其中Exosomes为外泌体，Organ collection为器官采集，B图为小鼠膀胱内免疫细胞数量时的画门策略示意图，FCS-A为前向散射范围，C图为感染2天后小鼠膀胱内F4/80

图5为MB49-U-Exo加重膀胱炎时组织损伤的分析组图，其中，A图为不同处理组中具有代表性的小鼠膀胱切片HE染色图像，B图为不同处理组的组织病理学评分比较的单因素方差分析统计图；

图6为MB49-U-Exo诱导巨噬细胞分泌促炎因子的分析组图，其中，A图为MB49-Exo处理的BMDMs以及MB49-U-Exo处理后BMDMs中基因表达的差异大小和显著性火山图，B图为PBS或外泌体处理后BMDMs中炎症相关基因表达的热图，C图为外泌体刺激后对BMDMs进行细胞因子阵列检测的双因素方差分析统计分析图，D图为用RT-PCR检测不同处理组BMDMs中Tnfα相对表达的单因素方差分析统计图，E图为用ELISA检测不同处理组BMDMs中TNFα相对表达的单因素方差分析统计图；

图7为MB49-U-Exo通过激活MAPK/ERK/JNK通路诱导巨噬细胞产生TNFα的分析组图，其中，A图为MB49-U-Exo处理后BMDMs中ERK、P38、JNK、P65磷酸化和总蛋白表达水平图，B图为MB49-Exo处理后BMDMs中ERK、P38、JNK、P65磷酸化和总蛋白表达水平图；

图8为抑制巨噬细胞MAPK/ERK/JNK通路的激活能够减少其释放TNFα的分析组图，其中，A图为PBS、PD98059(20μM)、MB49-U-Exo、PD98059联合MB49-U-Exo处理后BMDMs中ERK磷酸化和总蛋白表达水平图，B图为PBS、SP600125(40nM)、MB49-U-Exo、SP600125联合MB49-U-Exo处理后BMDMs中JNK磷酸化和总蛋白表达水平图，C图为用PBS、MB49-U-Exo和/或PD98059、SP600125刺激BMDMs后收集上清用ELISA法测定TNFα水平的分析图；

图9为MB49-U-Exo通过诱导巨噬细胞产生TNFα导致其凋亡的分析组图，其中，A图为PBS、MB49-Exo或MB49-U-Exo处理后的BMDMs中凋亡细胞占比图，B图为PBS、MB49-U-Exo、TNFα中和抗体(100ng/mL)或TNFα中和抗体联合MB49-U-Exo处理后的BMDMs中凋亡细胞占比图；

图10为MB49-U-Exo抑制巨噬细胞吞噬能力的分析组图，其中，A图为BMDMs吞噬FITC-E.coli(绿色)的代表性图像，B图为BMDMs中FITC的平均荧光强度t检验统计分析图，C图为BMDMs吞噬EGFP-UPEC(绿色)的代表性图像，D图为BMDMs中EGFP

图11为外泌体抑制剂或TNFα中和抗体减少膀胱炎时巨噬细胞和中性粒细胞浸润的分析组图，其中，A图为膀胱炎小鼠治疗示意图，B图为不同处理组小鼠膀胱中F4/80

图12为抑制MB49-U-Exo介导的TNFα产生改善UPEC诱导的膀胱炎时外泌体抑制剂或TNFα中和抗体降低膀胱炎时组织病理学评分及细菌负荷的分析组图，其中，A图为不同处理组中具有代表性的小鼠膀胱切片HE染色图像，B图为不同处理组的组织病理学评分比较的单因素方差分析统计分析图，C图为不同处理组中小鼠膀胱UPEC细菌负荷示意图；

图13为MB49-U-Exo通过递送miR-18a-5p诱导JNK活化和TNFα产生时外泌体抑制剂或TNFα中和抗体降低膀胱炎时组织病理学评分及细菌负荷的分析组图，其中，A图为与MB49-Exo相比，MB49-U-Exo中miRNA表达的差异大小和显著性火山图，B图为MB49-Exo/MB49-U-Exo差异miRNA的靶基因GO富集分析结果气泡图，C图为预测miR-130a-3p、miR-21a-5p和miR-18a-5p与PTEN基因3'UTR的结合位点(标记为红色)示意图，D图为转染miRNA模拟物6小时后的BMDMs中PTEN、JNK磷酸化和总蛋白表达水平图，E图为用RT-PCR检测miRNA模拟物转染后BMDMs中Tnfα的相对表达图，F图为急性膀胱炎患者和健康志愿者的尿液中提取外泌体中miR-18a-5p的表达水平图；

图14为UPEC感染后膀胱上皮细胞释放外泌体并损害巨噬细胞功能的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的技术方案仅仅是本发明一部分不是全部。基于本发明中的内容，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他技术方案，都属于本发明保护的范围。

如图1－图14所示，一种用于尿路致病性大肠杆菌调控外泌体的试验方法，包括如下步骤：

步骤一，制备MB49-Exo和MB49-U-Exo样品，在体内和体外分别进行三次独立实验，观察小鼠巨噬细胞对MB49-Exo和MB49-U-Exo样品的摄取情况；

步骤二，MB49-U-Exo加重UPEC诱导的膀胱炎：小鼠接受膀胱内注射外泌体，1天后经尿道膀胱内注射UPEC，使用流式细胞仪分析感染2天后小鼠膀胱内F4/80

步骤三，MB49-U-Exo诱导巨噬细胞分泌促炎细胞因子：将BMDMs分别与MB49-Exo、MB49-U-Exo共孵育，通过转录组测序分析基因表达谱，外泌体刺激后对BMDMs进行细胞因子阵列检测，检测各处理组BMDMs中Tnfα的相对表达及BMDMs中TNFα的相对表达；

步骤四，MB49-U-Exo通过激活MAPK/ERK、MAPK/JNK通路诱导巨噬细胞产生TNFα：获取MB49-U-Exo和MB49-Exo分别处理后BMDMs中ERK、P38、JNK、P65磷酸化和总蛋白表达水平，PBS、PD98059、MB49-U-Exo、PD98059联合MB49-U-Exo处理后BMDMs中ERK磷酸化和总蛋白表达水平，以及PBS、SP600125、MB49-U-Exo、SP600125联合MB49-U-Exo处理后BMDMs中JNK磷酸化和总蛋白表达水平，用PBS、MB49-U-Exo或PD98059、SP600125刺激BMDMs后收集上清，测定TNFα的水平；

步骤五，MB49-U-Exo抑制巨噬细胞吞噬能力：用MB49-Exo或MB49-U-Exo处理BMDMs24小时后与FITC-E.coli共孵育1小时，获取数据分析结果，用MB49-Exo或MB49-U-Exo处理BMDMs 24小时后与EGFP-UPEC共孵育，获取数据分析结果；

步骤六，MB49-U-Exo通过诱导巨噬细胞产生TNFα导致其凋亡：获取PBS、MB49-Exo或MB49-U-Exo处理后的BMDMs中凋亡细胞占比，同时PBS、MB49-U-Exo、TNFα中和抗体或TNFα中和抗体联合MB49-U-Exo处理后的BMDMs中凋亡细胞占比；

步骤七，抑制MB49-U-Exo介导的TNFα产生改善UPEC诱导的膀胱炎：使用PBS、GW4869、TNFα中和抗体分别治疗UPEC诱导的膀胱炎小鼠，膀胱内注射等体积PBS的小鼠作为膀胱炎小鼠的对照，获取小鼠膀胱中F4/80

步骤八，MB49-U-Exo通过递送miR-18a-5p诱导JNK活化和TNFα产生：收集MB49-Exo和MB49-U-Exo，使用小鼠miRNA微阵列分析芯片进行差异表达miRNA分析。

需要说明的是，在步骤一中，制备MB49-Exo和MB49-U-Exo样品的具体流程包括：

步骤a1：选取尿路致病性大肠杆菌在培养皿中培养，感染MB49细胞；

步骤a2：通过离心方法分离培养皿中的上清液，使用差速离心法分离上清液，获取MB49-Exo和MB49-U-Exo样品；

步骤a3：如图1所示，在A图中使用电子显微镜获取MB49-Exo和MB49-U-Exo样品的代表性透射电子显微图像，比例尺为100nm，其中左侧图和右侧图分别为MB49-Exo和MB49-U-Exo样品的代表性透射电子显微图像，在B图中，使用纳米粒度电位仪测量MB49-Exo和MB49-U-Exo的粒径分布，其中蓝色和红色的分布曲线分别为MB49-Exo和MB49-U-Exo的粒径分布曲线，Intensity为质荷比(m/z)与离子丰度，也叫强度，由图显示MB49-Exo比MB49-U-Exo的粒径荷质比高，在C图中，利用蛋白免疫印迹显示外泌体标记蛋白CD63和HSP90在外泌体或MB49细胞中的表达情况，其中外泌体标记蛋白CD63为43kDa，而图中从左至右依次显示其在MB49-Exo、MB49 cell以及MB49-U-Exo中的表达水平，外泌体标记蛋白HSP90为90kDa，从中从左至右依次显示其在MB49-Exo、MB49 cell以及MB49-U-Exo中的表达水平，在图D中，利用BCA法检测两种MB49-Exo和MB49-U-Exo的蛋白浓度，其中total exosomal Protein inconditional media为条件培养基中的总外泌体蛋白，使用t检验进行统计学分析，***P＜0.001。

需要具体说明的是，如图2所示，在步骤一中，在体内和体外分别进行三次独立实验，观察小鼠巨噬细胞对样品的摄取情况的具体方法为：使用流式细胞学观察感染和处理后的小鼠反应的具体方法为：如图3所示，其中A图所示，使用流失细胞学分析小鼠接受荧光染料叠氮花菁-Cy5.5标记外泌体膀胱内注射12小时后，CD45

需要说明的是，如图4所示，在步骤二中，A图显示UPEC诱导小鼠膀胱炎实验中MB49-Exo和MB49-U-Exo预处理，小鼠接受膀胱内注射外泌体的剂量为1μg，经尿道膀胱内注射UPEC的剂量为1.0×10

需要说明的是，如图6所示，步骤三中，如图B所示，将BMDMs与MB49-Exo、MB49-U-Exo共孵育的时间为3小时，如图A所示，火山图显示了与MB49-Exo处理的BMDMs相比，MB49-U-Exo处理后BMDMs中基因表达的差异大小和显著性，其中红点表示上调，绿点表示下调，通过转录组测序分析基因表达谱，如图C所示，外泌体刺激后对BMDMs进行细胞因子阵列检测，使用双因素方差分析进行统计学分析，*P＜0.05，***P＜0.001，如图D所示，用RT-PCR检测不同处理组BMDMs中Tnfα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析，***P＜0.001，如图E所示，用ELISA检测不同处理组BMDMs中TNFα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析，***P＜0.001。

需要说明的是，如图7所示，在步骤四中，图A使用免疫印迹显示MB49-U-Exo处理后BMDMs中ERK、P38、JNK、P65磷酸化和总蛋白表达水平，图B使用蛋白免疫印迹显示MB49-Exo处理后BMDMs中ERK、P38、JNK、P65磷酸化和总蛋白表达水平，MB49-U-Exo和MB49-Exo分别处理的实验均重复三次，如图8所示，A图使用蛋白免疫印迹显示PBS、PD98059、MB49-U-Exo、PD98059联合MB49-U-Exo处理后BMDMs中ERK磷酸化和总蛋白表达水平，B图使用蛋白免疫印迹显示PBS、SP600125、MB49-U-Exo、SP600125联合MB49-U-Exo处理后BMDMs中JNK磷酸化和总蛋白表达水平，C图使用PBS、MB49-U-Exo和/或PD98059、SP600125刺激BMDMs后收集上清，用ELISA法测定TNFα的水平，其中PBS、PD98059、MB49-U-Exo、PD98059联合MB49-U-Exo处理实验中，PD98059的剂量为20μM，PBS、SP600125、MB49-U-Exo、SP600125联合MB49-U-Exo处理实验中，SP600125的剂量为40nM，用PBS、MB49-U-Exo或PD98059、SP600125刺激BMDMs后处理，以上实验均重复三次，且使用单因素方差分析进行统计学分析，ns：无显著性差异，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

需要说明的是，如图9所示，在步骤六中，如图A，使用流式细胞分析仪显示PBS、MB49-Exo或MB49-U-Exo处理后的BMDMs中凋亡细胞占比，凋亡率由Annexin V

需要说明的是，如图10所示，在步骤五中，A.共聚焦显微镜成像显示BMDMs吞噬FITC-E.coli(绿色)的代表性图像，比例尺＝20μm，B图中利用MB49-Exo或MB49-U-Exo处理BMDMs 24小时后与FITC-E.coli孵育，MB49-Exo或MB49-U-Exo的剂量为10μg/mL，处理BMDMs24小时后与FITC-E.coli的孵育剂量为50μg/mL，孵育时长为1小时，用MB49-Exo或MB49-U-Exo的剂量为10μg/mL，流式细胞学分析显示BMDMs中FITC的平均荧光强度，使用t检验进行统计学分析，**P＜0.01，C图为共聚焦显微镜成像显示BMDMs吞噬EGFP-UPEC(绿色)的代表性图像，比例尺＝50μm，D图为用MB49-Exo或MB49-U-Exo处理BMDMs 24小时后与EGFP-UPEC共孵育，流式细胞学分析显示BMDMs中EGFP

需要说明的是，如图11所示，在步骤七中，如A图所示，为膀胱炎小鼠治疗示意图，使用PBS、GW4869、TNFα中和抗体分别治疗UPEC诱导的膀胱炎小鼠，膀胱内注射等体积PBS的小鼠作为膀胱炎小鼠的对照，使用PBS、GW4869、TNFα中和抗体分别治疗UPEC诱导的膀胱炎小鼠的GW4869剂量为2.5μg/g，TNFα中和抗体的剂量为0.2μg/g，治疗膀胱炎小鼠的时长为3天，图B和图C分别使用流式细胞学分析显示小鼠膀胱中F4/80

需要说明的是，如图13所示，在步骤八中，在A图中，火山图显示了与MB49-Exo相比，MB49-U-Exo中miRNA表达的差异大小和显著性，其中红点表示上调，蓝点表示下调，在B图中，气泡图显示MB49-Exo/MB49-U-Exo差异miRNA的靶基因GO富集分析结果，收集MB49-Exo和MB49-U-Exo两种外泌体，使用小鼠miRNA微阵列分析芯片进行差异表达miRNA分析，其中，MAPK signaling pathway为MAPK信号通路，Axon guidance为轴突引导，Endocytosis为内吞作用，Proteoglycans in cancer为蛋白多糖在癌症中的作用，Pathways in cancer为癌症相关通路，ErbB signaling pathway为ErbB信号通路，MicroRNAs in cancer为癌症中的微小RNA，Endocrine resistance为内分泌抵抗，Signaling pathways regulatingpluripotency of stem cells为调节干细胞多能性的信号通路，FoxO signaling pathway为FoxO信号通路，mTOR signaling pathway为mTOR信号通路，Focal adhesion为粘着斑，PI3K-Akt signaling pathway为PI3K-Akt信号通路，Breast cancer为乳腺癌，Melanogenesis为黑色素生成，AGE-RAGE signaling pathway in diabeticcomplications为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，Relaxin signaling pathway为Relaxin信号通路，Wnt signaling pathway为Wnt信号通路，Glutamatergic synapse为谷氨酸突触，Cushing's syndrome为库欣综合征，Morphine addiction为吗啡成瘾，Sphingolipid signaling pathway为鞘脂信号通路，Human papillomavirus infection为人乳头瘤病毒感染，GnRH signaling pathway为GnRH信号通路，Choline metabolismincancer为癌症中的胆碱代谢，Hepatocellular carcinoma为肝细胞癌，Glioma为神经胶质瘤，Long-term depression为长期抑郁，Adrenergic signaling in cardiomyocytes为心肌细胞中的肾上腺素信号传导，Prostate cancer为前列腺癌，使用小鼠miRNA微阵列分析芯片进行差异表达miRNA分析的具体方法包括：

步骤b1：如图C所示，预测miR-130a-3p、miR-21a-5p和miR-18a-5p与PTEN基因3'UTR的结合位点(标记为红色)；

步骤b2：如图D所示，利用蛋白免疫印迹显示转染miRNA模拟物6小时后的BMDMs中PTEN、JNK磷酸化和总蛋白表达水平；

步骤b3：如图E所示，用RT-PCR检测miRNA模拟物转染后BMDMs中Tnfα的相对表达，使用单因素方差分析进行统计学分析，**P＜0.01，***P＜0.001；

步骤b4：如图F所示，使用差速离心法分别从急性膀胱炎患者和健康志愿者的尿液中提取外泌体，并用RT-PCR检测尿液外泌体中miR-18a-5p的表达水平，使用t检验进行统计学分析，*P＜0.05。

如图14所示，膀胱上皮细胞感染UPEC后释放的外泌体被巨噬细胞所吸收，激活JNK信号通路并产生过量的TNFα，最终导致巨噬细胞凋亡和吞噬能力降低，使用GW4869抑制外泌体分泌或TNFα中和抗体能通过减少巨噬细胞和中性粒细胞聚集并加速UPEC清除，从而减轻UPEC介导的膀胱炎，图中，neutralizing antibody为中和抗体，apoptosis为细胞凋亡，phagocytosis为吞噬作用，macrophage为巨噬细胞，PTEN为磷酸酶基因，JNK为蛋白激酶，本发明通过提出的试验方法说明了UPEC感染后膀胱上皮细胞来源的外泌体能够诱导巨噬细胞产生过量的TNFα，导致巨噬细胞凋亡，并抑制其吞噬功能，使用外泌体分泌抑制剂GW4869或TNFα中和抗体都能通过减少巨噬细胞和中性粒细胞浸润，促进UPEC清除从而显著改善UPEC诱导的膀胱炎的病理状态，提出UPEC感染时膀胱上皮细胞和巨噬细胞之间以外泌体的形式实现交互并调节宿主的免疫反应，揭示了UPEC调节尿路感染的潜在机制。

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

最后：以上所述仅为本发明的优选方案而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。