用于磁共振成像的造影剂

发明领域

本发明涉及用于磁共振成像的造影剂的技术领域。

发明背景

造影剂是从外部给予身体以便在医学成像期间增加体内组织和液体的对比度的化学物质。造影剂通常被用于成像，诸如荧光镜检查、计算机断层扫描和磁共振，以增加血管和器官(胃、肠等)、肿瘤和炎症组织的可见性。医学成像中所使用的造影剂可以根据其使用的成像方法大致分类。

磁共振成像(MRI)是用于使用其中氢原子的自旋在磁场中驰豫的现象来获取作为图像的关于身体的解剖学、生理学和生物化学信息的方法。MRI是用于活体人和动物的身体器官的实时成像的当前的无创性诊断工具之一。由于其在生物科学和医学领域的多样性和精确性用途，通过将外来材料引入体内以增加图像的对比度来进行MRI。这些材料被称为造影剂。使用超顺磁性和顺磁性材料作为造影剂以对来自身体部位的对比信号进行MRI成像，使得可以将身体部位与其周围环境清晰区分。由于组织中的不同驰豫，MRI图像上的组织之间产生对比度。驰豫是其中组织中水分子的核自旋恢复到平衡状态的现象。造影剂影响驰豫以使组织之间的驰豫程度产生大的差异，并且诱导MRI信号的变化以使组织之间的对比度更清晰。

使用造影剂增强对比度提高或降低特定活体器官和组织相对于其周围环境的图像信号强度，以提供器官和组织的更清晰成像。阳性造影剂(或T1造影剂)是指提高来自身体部位的图像信号的强度以便通过MRI相对于周围环境进行成像的造影剂。阴性造影剂(或T2造影剂)是指降低来自身体部位的图像信号的强度以便通过MRI相对于周围环境进行成像的造影剂。更具体地，MRI造影剂被分成使用顺磁材料的高自旋的T1造影剂和使用铁磁或超顺磁材料周围的磁不均匀性的T2造影剂。

静脉注射钆(Gd)螯合物，诸如钆布醇和钆特酸(gadotheric acid)，目前被用作MRI的T1造影剂。众所周知，在许多需要在其中无法充分实现组织可区分性的未增强成像中可视化肿瘤、感染和血管的情况下，在认为必要的情况下使用钆螯合物顺磁性产品用于病变和诊断性评价。这些钆衍生物通常被用于疾病的诊断和随访。每年大约3000万剂量的钆螯合物被用于诊断目的。虽然含有钆的造影剂可以呈螯合物形式摄入，但如果Gd

无论与其给药相关的副作用和风险如何，钆螯合物仍然是目前用于MRI的主要造影剂。

因此，仍然需要用于磁共振成像、特别是用于胃和肠检查的无害造影剂。

发明概述

因此，本发明的目的是提供用于磁共振成像的造影剂组合物，其中所述组合物含有水和一种或多种化学上不同的甜菜色素(betalain)。

本文还要求保护和描述了用于制造本文所描述的造影剂组合物的方法，其中所述方法含有以下步骤：

a)将甜菜(Beta vulgaris)植株、优选地源自艾登(Aydin)地区(土耳其)的甜菜植株脱皮和切片；

b)将甜菜植株制浆以提供浆状物；

c)将步骤b)中所获得的浆状物与水混合；

d)将在步骤c)中所获得的混合物煮沸；

e)冷却后，将混合物排干以分离液体；和

f)向步骤e)中所获得的液体中添加含有甜菜苷和/或仙人掌黄质(vulgaxanthin)的水性溶液，以及由所述方法所获得的造影剂组合物。当添加在一起时，甜菜苷与仙人掌黄质的重量比优选地是3:1。

根据本发明的另外的方面涉及获取受试者的对比度增强的磁共振图像的方法，所述方法包括

-向所述受试者施用本文所描述的造影剂组合物；和

-获取所述受试者的所述磁共振图像。

附图说明

图1示出根据本发明的造影剂组合物的制造方法的概述：(10)：用水洗涤；(20)：切片；(30)：制浆；(40)：煮沸；(50)：冷却；(60)：排干；(70)：分离液体部分；(80)：添加风味增强剂。

图2示出根据本发明的造影剂组合物的制造方法的概述：(10)：用水洗涤；(20)：切片；(30)：制浆；(40)：煮沸；(50)：冷却；(60)：排干；(70)：分离液体部分；(80)：添加风味增强剂；(90)：获得提取物；(100)：添加到混合物中。

图3示出根据本发明的造影剂组合物CA1和CA2的测量的T1弛豫曲线和对比钆螯合物组合物(C1)的对比示意图(x轴：重复的时间(TR)/ms；y轴：在所选择的感兴趣的区域上的T1平均图像信号强度)。根据本发明的造影剂组合物CA1和CA2展现出与当前所使用的钆螯合物组合物C1相当的自旋回波T1。因此，造影剂组合物CA1和CA2适合被用作体内磁共振成像的造影剂。

图4比较了分别用根据本发明的造影剂组合物CA3(左上)、对比钆螯合物溶液C1(右上)、水作为参照(左下)和橄榄油(右下)在体外所获得的和在麻醉下在大鼠体内所获得的自旋回波T1加权图像(中间)之间的磁共振对比度。如由图4所示出的，造影剂组合物CA3示出比对比钆螯合物组合物C1、水、橄榄油和在麻醉下的大鼠组织显著更高的信号强度。

图5示出在直肠施用造影剂组合物CA3后的大鼠上所获得的自旋回波T1加权图像(图像a和b)，与示出大鼠肠解剖结构的图像(图像c和d)一起给出。如由图a和b所示出的，造影剂组合物CA3在直肠给药后在肠腔中示出明亮的MRI对比度并且能够更好地描绘肠腔。因此，造影剂组合物CA3特别适用于下胃肠道成像。

图6示出在口服施用造影剂组合物CA2后的大鼠上所获得的连续自旋回波T1加权图像。如由图6所示出的，造影剂组合物CA2在口服给药后在胃中示出明亮的MRI对比度并且能够更好地描绘胃腔。因此，造影剂组合物CA2特别适用于胃食管成像。胃中察觉到的黑色部分无实质对应。

图7A)示出在根据本发明的造影剂组合物CA2的口服给药之后的大鼠上所获得的早期(给药后第一分钟之后获取)自旋回波T1加权图像(图像a)、早期(给药后第一分钟之后获取)脂肪饱和T2加权成像(图像b)和早期(给药后第一分钟之后获取)连续梯度回波T1加权图像(图像c和d)和晚期(给药后三小时之后获取)自旋回波T1加权图像(图像e)。如从图7A)可以看出的，造影剂组合物CA2能够在口服给药后的早期描绘小肠并且在晚期描绘肝脏和肾脏，并且对于早期的上胃肠道成像和晚期的实质成像特别有用。

B)示出在口服施用对比钆螯合物组合物(C1)之后的大鼠上所获得的早期(给药后第一分钟之后获取)自旋回波T1加权图像(图像a和b)和早期(给药后第一分钟之后获取)连续梯度回波T1加权图像(图像c)。

图7A和7B中所描绘的结果的比较证明，根据本发明的造影剂组合物示出比当前所使用的钆螯合物组合物(C1)尤其在连续梯度回波T1加权成像中更好的小肠腔的扩张和描绘。这是特别有利的，因为梯度回波T1加权图像的测量比如LAVA ASPIR MRI序列上所示出的自旋回波T1加权图像的测量更方便。

图8示出本发明人的腹部的先前(图8a：左图像：轴向同相梯度回波(GRE)T1加权图像(WI)；右图像：冠状同相GRE T1 WI)和口服给药新鲜压制的甜菜根汁之后(图8b：左图像：轴向异相GRE T1 WI，右图像：冠状GRE T2 WI)的体内MRI图像。如由图8所示出的，在口服给药后，新鲜压制的甜菜根汁使得能够更好地描绘人胃腔和胃壁，并且对于胃成像特别有用。

图9比较了用根据本发明的造影剂组合物CA5、根据本发明的造影剂组合物CA6、对比钆螯合物溶液C1和水作为参照在体外所获得的自旋回波T1加权图像之间的磁共振对比度。如由图9所示出的，造影剂组合物CA5示出与对比钆螯合物组合物C1相当的T1信号强度。此外，造影剂组合物CA6示出比对比钆螯合物组合物C1显著更高的T1信号强度。

图10示出手动尾部注射根据本发明的造影剂组合物CA4后的早期(手动注射后第一分钟之后获取)大鼠减影血管造影成像(图像a)、晚期(手动注射后第二分钟之后获取)大鼠减影血管造影成像(图像b)和晚期(手动注射后第三分钟之后获取)大鼠减影腹部成像(图像c)。图10示出静脉相和实质相(肝脏)，并且证明组合物CA4对于静脉内给药后的血管和实质成像特别有用。

图11A)示出来自口服给药根据本发明的造影剂组合物CA2持续四个连续天后的实验大鼠的肠的组织学样品的显微图像。

B)示出来自口服施用根据本发明的造影剂组合物CA2持续四个连续天后的实验大鼠的胃的组织学样品的显微图像。

由图11所显示的结果证明，口服施用1mL的剂量的根据本发明的造影剂组合物CA2持续四个连续天没有相关的毒性效应。

图12示出以0-60μM的浓度施用根据本发明的造影剂组合物(CA2)之后人体健康成纤维细胞(HFB)中的细胞增殖水平(x轴：所施用的CA2的浓度，y轴：在分光光度测定装置(TECAN Sunrise)中所测量的吸光度值)：在温育24小时之后，所施用的0-60μM的CA2在人体健康成纤维细胞(HFB)中对细胞活力的作用。在应用XTT测试之后，分光光度法确定细胞增殖水平。未观察到统计学上显著的差异。

发明详述

本发明的目的是解决该需要。目的通过由权利要求1所述的造影剂组合物和根据权利要求11所述的造影剂组合物以及根据权利要求12获取受试者的对比度增强的磁共振图像的方法来实现。本说明书和从属权利要求中公开了优选实施方案。

以下将更详细地描述本发明。

在本说明书提及“优选的”实施方案/特征的情况下，只要“优选的”实施方案/特征的特定组合是技术上有意义的，这些“优选的”实施方案/特征的组合也被认为是公开的。

除非另有说明，否则以下

如本文所使用的，在本发明的上下文中使用的术语“一个/种(a/an)”、“该/所述(the)”和类似术语(尤其是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。

如本文所使用的，术语“和/或”意指可以存在所述组的要素中的所有或仅一个/种。例如，“A和/或B”意指“仅A、或仅B、或A和B两者”。在“仅A”的情况下，术语还涵盖B不存在的可能性，即“仅A但无B”。

如本文所使用的，术语“包括(including)”、“含有(containing)”和“包含/包括(comprising)”在本文中以其开放式、非限制性意义使用。应理解，各种实施方案、优选和范围可以任意组合。因此，例如，包含化合物A的溶液可以包括除了A之外的其他化合物。然而，作为其具体实施方案，术语“包含/包括(comprising)”还涵盖“基本上由...组成”和“由...组成”的更具限制性的含义，使得例如“包含A、B和任选地C的溶液”也可以(基本上)由A和B组成、或(基本上)由A、B和C组成。如本文所使用的，过渡短语“基本上由...组成”(和语法变体)应被解释为包括所述材料或步骤“以及不实质性影响所要求保护的本发明的基本和新颖特征的材料或步骤。因此，术语“基本上由...组成”不应当被解释为等同于“包含/包括(comprising)”。

如本文所使用的，术语“约”意指所讨论的量或值可以是所指定的特定值或其邻域中的某种其他值。通常，表示某个值的术语“约”旨在表示该值的±5％内的范围。作为一个实例，短语“约100”表示100±5的范围，即95至105的范围。优选地，由术语“约”表示的范围表示该值的±3％、更优选地±1％内的范围。通常，当使用术语“约”时，可以预期可以在所指示值的±5％的范围内获得根据本发明的类似结果或效应。

甜菜色素是通常分离自甜菜根(Beta vulgaris)的无毒、环境友好型天然颜料。甜菜色素已经被广泛用作食品产品中的着色剂。甜菜色素的抗氧化活性是文献中已知的(Egypt.J.Agric.Res.91(3),2013)。Udonkang等人(Biomed Hub 2018,3,492828)描述了甜菜根的水性提取物和乙醇提取物用于染色基本组织学组织结构的用途及其作为苏木精和伊红的环境友好型替代物的用途。

出人意料地，已经发现含有以下的组合物

i)水，和

ii)一种或多种化学上不同的甜菜色素，可用作用于磁共振成像的造影剂。本文所描述的组合物可以口服、直肠或肠胃外施用，并且允许获取受试者的食管、胃肠道、肝脏、肾脏、静脉系统和/或动脉系统的磁共振图像。用本文所描述的组合物获得的MRI对比度与用可商购钆螯合物

优选地，该一种或多种化学上不同的甜菜色素选自通式(I)的化合物

其中在通式(I)中

要么

R

要么

R

其中在通式(III)中，

R

前提是R

其中R

术语“盐”包括用相对无毒的酸或碱制备的甜菜色素盐。盐可以通过使甜菜色素与碱和/或酸在合适的惰性溶剂中接触来获得。通过用碱处理甜菜色素所获得的盐包括钠、钾、钙、铵和镁盐。通过用酸处理甜菜色素所获得的盐包括衍生自无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硝酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸和硫酸的盐，以及衍生自相对无毒的有机酸诸如乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、马来酸、苹果酸等的盐。术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和低等动物的组织接触而无不当毒性、刺激、过敏响应等并且与合理益处/风险比相称的那些盐。

在优选实施方案中，该一种或多种化学上不同的甜菜色素包含通式(IV)的化合物，其药学上可接受的盐和/或其互变异构体

其中R

通式(V)的化合物，其药学上可接受的盐和/或其互变异构体

其中在通式(V)中R

在替代性的另外的优选实施方案中，该一种或多种化学上不同的甜菜色素选自通式(IV)的化合物，其药学上可接受的盐及其互变异构体

其中R

优选地，在通式(IV)中，R

在优选实施方案中，通式(IV)的化合物是具有化学结构IV-a的甜菜苷、或具有化学结构IV-b的甜菜苷。

优选地，式(IV)、(IV-a)或(IV-b)的化合物以约2g/kg组合物(2g/kg)至约10g/kg组合物(10g/kg)的量存在于组合物中，如由高压液相色谱法(HPLC)所确定的。

有利地，本文所描述的组合物是完全天然的产品。在优选实施方案中，组合物是甜菜汁或甜菜根汁。优选地，汁获得自源自艾登地区(土耳其)的甜菜根。在另一个优选实施方案中，组合物通过含有以下步骤的方法获得：

a)将甜菜植株、优选地源自艾登地区(土耳其)的甜菜植株脱皮和切片；

b)将甜菜植株制浆以提供浆状物；

c)将步骤b)中所获得的浆状物与水混合；

d)将在步骤c)中所获得的混合物煮沸；

e)冷却后，将混合物排干以分离液体；和任选地

f)向步骤e)中所获得的液体中添加含有甜菜苷和/或仙人掌黄质的水性溶液。在步骤f)中所添加的水性溶液优选地含有甜菜苷和仙人掌黄质。当添加在一起时，甜菜苷与仙人掌黄质的重量比优选地是3:1。

本文所描述的组合物可以口服施用用于获得受试者的食管、胃肠道、肝脏、和/或肾脏的磁共振图像，或肠胃外、优选地静脉内，或腹膜内、更优选地静脉内。

肠胃外给药能够获取受试者的动脉系统和/或静脉系统的磁共振图像。当肠胃外施用时，本文所描述的组合物可以进一步含有等渗剂。等渗剂的实例包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸钠、右旋糖及其混合物。优选地，等渗剂是氯化钠、右旋糖，或氯化钠、氯化钾、氯化钙和碳酸氢钠的混合物。

用于口服给药的组合物可以进一步含有调味剂以改进其适口性。调味剂的实例包括大蒜、藏红花和香菜。如果用含有步骤a)至e)或a)至f)的制备方法获得组合物，则可以将调味剂添加至在步骤e)中所获得的液体中或添加至在步骤f)中所获得的液体中。为了提高其粘膜粘附特性，组合物可以含有粘附增强物质。此类组合物对于获取胃肠道的磁共振图像特别有用。合适的粘附增强物质的实例包括但不限于硫糖铝(sucralfate)、胶体铋、甘珀酸钠盐、明胶、果胶、海藻酸钠、黄芪胶和角叉菜胶。粘附增强物质可以以微球形式提供，包括微胶囊和微粒。

本文所描述的组合物可以进一步含有高达50体积％的橄榄油、优选地10体积％至50体积％的橄榄油。可以使橄榄油经受臭氧化。此种组合物对于直肠给药特别有用并且能够获取受试者的胃肠道的磁共振图像。因此，根据本发明的优选实施方案涉及含有以下的组合物作为用于磁共振成像的造影剂的用途

i)水，

ii)如本文所描述的一种或多种化学上不同的甜菜色素，

iii)高达50体积％、优选地10体积％至50体积％的橄榄油。此种组合物可以经由含有如本文所描述的步骤a)-e)或如本文所描述的步骤a)-f)以及另外地优选地在步骤e)或步骤f)之后进行的步骤g)的制备方法获得：

g)将高达50体积％、优选地10体积％至50体积％的橄榄油添加至在步骤e)或f)中所获得的液体中。

旨在用于直肠给药的组合物可以另外含有如本文所描述的粘附增强物质。

在优选实施方案中，使本文所描述的组合物经受臭氧化。

根据本发明的另外的方面涉及用于制造本文所描述的造影剂组合物的方法，其中所述方法含有以下步骤：

a)将甜菜植株、优选地源自艾登地区(土耳其)的甜菜植株脱皮和切片；

b)将甜菜植株制浆以提供浆状物；

c)将步骤b)中所获得的浆状物与水混合；

d)将在步骤c)中所获得的混合物煮沸；

e)冷却后，将混合物排干以分离液体；和

f)向步骤e)中所获得的液体中添加含有甜菜苷和/或仙人掌黄质的水性溶液。在步骤f)中所添加的水性溶液优选地含有甜菜苷和仙人掌黄质。当添加在一起时，甜菜苷与仙人掌黄质的重量比优选地是3:1。

该方法可以进一步含有在步骤e)或f)和/或步骤h)之后进行的步骤g)：

g)将高达50体积％、优选地10体积％至50体积％的橄榄油添加至在步骤e)或f)中所获得的液体中；

h)使组合物经受臭氧化。

根据本发明的另外的方面涉及由本文所要求保护和描述的方法获得的用于磁共振成像的造影剂组合物。

本发明进一步提供了获取受试者的对比度增强的磁共振图像的方法，所述方法包括

-向所述受试者施用本文所描述的组合物；和

-获取所述受试者的所述磁共振图像。

所施用的组合物的实际体积以及给药的速率和时间历程将取决于组合物、待成像的目标区域和受试者。造影剂的处方(例如关于剂量的决定)在放射科医生和其他医疗服务提供者的普通技能范围内，并且典型地考虑受试者的待成像疾病和体重。

在优选实施方案中，口服施用造影剂组合物。在替代性实施方案中，直肠施用造影剂组合物。根据本发明的组合物的直肠和口服给药特别适用于经由磁共振成像使受试者的食管、胃肠道、肝脏、和/或肾脏可见。

在替代性优选实施方案中，将组合物肠胃外、优选地静脉内或腹膜内施用。本文所要求保护和描述的组合物的肠胃外给药能够获得受试者的静脉系统和/或动脉系统的图像。

在优选实施方案中，造影剂组合物通过方法的以下步骤获得：用水洗涤500克的甜菜(BV)植株(10)，将其脱皮并且切片(20)，将其制浆(30)，将其煮沸(40)，将其冷却(50)，将其排干(60)，分离材料的液体部分(70)，在150ml液体上添加大蒜、4-5个藏红花和香菜枝以增强风味(80)，通过乙醇提取方法由甜菜(BV)的颗粒获得甜菜苷和仙人掌黄质提取物(90)，并且将甜菜苷(3/4)和仙人掌黄质(1/4)呈30ml提取物形式添加到150ml液体(80)上(100)。(图1，图2)。如果目的是直肠给药使用其并且观察上胃肠道系统，可以以％10-50的比率向其上添加臭氧化的橄榄油。(图1，图2)。通过以％10-50的比率添加臭氧化的橄榄油，稠度和顺磁效应将被增强，并且可以实现直肠使用并且可以观察上胃肠道系统。

本发明的主题以其基本化学特征而用于胃肠道目的，并且也可以被认为是作为静脉内MR造影剂而开发的。所进行的动物测试已经表明，本发明还有助于观察泌尿系统(MR尿路造影术)。通过纳米技术方法添加硫糖铝或粘附增强物质，其在理论上也可以被用作胃和肠中的高度粘膜粘附性产品。

在更优选的实施方案中，造影剂组合物通过方法的以下步骤获得：用水洗涤500克的甜菜(BV)植株(10)，将其脱皮并且切片(20)，将其制浆(30)，将其煮沸(40)，将其冷却(50)，将其排干(60)，分离材料的液体部分(70)，在150ml液体上添加大蒜、4-5个藏红花和香菜枝以增强风味(80)，通过乙醇提取方法由甜菜(BV)的颗粒获得甜菜苷和仙人掌黄质提取物(90)，并且将甜菜苷(3/4)和仙人掌黄质(1/4)呈30ml提取物形式添加到150ml液体(80)上(100)。(图1，图2)。如果目的是直肠给药使用其并且观察上胃肠道系统，可以以％10-50的比率向其上添加臭氧化的橄榄油。(图1，图2)。本发明的主题以其基本化学特征而可以被用作胃肠道和静脉内MR造影剂。通过纳米技术方法添加硫糖铝或粘附增强物质，其将被用作胃和肠中的高度粘膜粘附性产品。通过以％10-50的比率添加臭氧化的橄榄油，稠度和顺磁效应被增强，并且可以实现直肠使用或可以观察上胃肠道系统。

众所周知，甜菜提取物含有高量的一氧化氮。还检验所获得的物质的基本分析和食品分析。

本发明可以通过参考以下条款#1-#4来进一步总结：

#1.本发明是含有甜菜色素的用于磁共振成像(MRI)中并且增强T1和T2对比度质量的植物化学试剂，并且其特征是通过以下方法步骤所获得的特征；

-用水洗涤500克的甜菜(BV)植株(10)，

-将其脱皮并且切片(20)，

-将其制浆(30)，

-将其煮沸(40)，

-将其冷却(50)，

-将其排干(60)，

-分离材料的液体部分(70)，

-在150ml液体上添加大蒜、4-5个藏红花和香菜枝以增强风味(80)，

-通过乙醇提取方法由甜菜(BV)的颗粒获得甜菜苷和仙人掌黄质提取物(90)，和

-将甜菜苷(3/4)和仙人掌黄质(1/4)呈30ml提取物形式添加到150ml液体(80)上(100)。

#2.权利要求1中所提及的内容是含有甜菜色素的用于磁共振成像(MRI)中并且增强T1和T2对比度质量的植物化学试剂，并且其特征在于：通过以％10-50的比率添加臭氧化的橄榄油，稠度和顺磁效应被增强并且实现直肠使用或观察上胃肠道系统。

#3.权利要求1中所提及的内容是含有甜菜色素的用于磁共振成像(MRI)中并且增强T1和T2对比度质量的植物化学试剂，并且其特征在于：以其基本化学-物理特征和食品化学-物理特征而被用作胃肠道和静脉内MR造影剂。

#4.权利要求1中所提及的内容是含有甜菜色素的用于磁共振成像(MRI)中并且增强T1和T2对比度质量的植物化学试剂，并且其特征在于：通过纳米技术方法添加硫糖铝或粘附增强物质而被用作胃和肠中的高度粘膜粘附性产品。

为了进一步说明本发明，提供以下

I.根据本发明的造影剂组合物的制备

I.1.根据本发明的造影剂组合物(CA1)的制备将500g的源自艾登地区(土耳其)的甜菜(BV)植株用水洗涤(10)，脱皮并且切片(20)，制浆(30)，与500mL水混合并且煮沸持续2小时(40)。冷却(50)和排干(60)后，获得150mL的液体提取物(CA1)(70)。液体提取物(CA1)可以直接被用作用于磁共振成像的造影剂。组合物CA1特别适用于口服给药和上胃肠道的成像。对于口服给药，可以将大蒜和/或藏红花枝和/或香菜枝添加至液体提取物中以增强风味(80)。制备方法由图1总结。

I.2.根据本发明的造影剂组合物(CA2、CA6)的制备

将27.75g(30ml)的可商购甜菜根红颜料(CAS号：7659-95-2，土耳其食品添加剂编号：E162；供应商：Smart Kimya Tic.ve Dan.Ltd.

制备方法总结在图2中。

将0.5ml的CA2与1.5ml的水混合以提供根据本发明的造影剂组合物(CA6)，其具有大约231mg/100g的甜菜苷浓度。

I.3.根据本发明的造影剂组合物(CA3)的制备

将如实施例2中所描述的获得的50mL的组合物(CA2)与50mL的橄榄油混合。将所获得的混合物臭氧化三小时以提供可以直接被用作用于磁共振成像的造影剂的乳液(CA3)。组合物(CA3)特别适用于直肠给药。

I.4.根据本发明的造影剂(CA4、CA5)的制备

通过将500mg(CA4)和250mg(CA5)的可商购甜菜苷(用糊精稀释的红甜菜提取物，CAS号：7659.95-2；供应商：Sigma Aldrich Chemie)溶解在1mL的1M盐水中制备溶液CA4和溶液CA5。两种溶液均可以被用作用于磁共振成像的造影剂。组合物CA4和CA5特别可用于口服、腹膜内和静脉内给药。可以将组合物与橄榄油以约9:1至约1:1的体积比混合并且臭氧化以提供特别适用于直肠给药的乳液。

I.5.出于对比目的的钆螯合物溶液(C1)的制备

将1mL的

II.根据本发明的组合物的MRI对比度特性的体外评价

将造影剂组合物CA1、CA2、CA5和CA6在3T MR扫描仪上测试，与钆螯合物溶液C1、油(特级初榨橄榄油)和水进行比较。T1驰豫图是基于多个TR和TE值生成的。通过按照Magnetic Resonance in Medicine 46:1099-1106(2001)中所描述的既定程序测量T1和T2。简言之，将样品(CA1、CA2、CA5、CA6、C1、水和油)直接倒入圆锥形和圆柱形塑料容器中。将支架插入仅头部体积线圈中，并且用3T扫描仪(GE Pioneer,3T)在冠状面和轴面上成像。TE＝10ms时，针对不同TR值(75、150、300、600、1000、2000和4000ms)执行标准自旋回波序列，TR＝4000ms时针对不同TE值(10、40、80和120ms)执行标准自旋回波序列。图9是获取的图层(slice)之一，其中每个圆盘表示样品CA5、CA6、C1和水之一。样品之间的对比度变化指示不同的T1信号强度。

将感兴趣的区域置于每个样品上，并且将强度的平均读数记录在表格中。图3示出根据本发明的造影剂组合物CA1和CA2的测量的T1弛豫曲线和对比钆螯合物组合物(C1)的对比示意图(x轴：重复的时间(TR)/ms；y轴：在所选择的感兴趣的区域上的T1平均图像信号强度)。根据本发明的造影剂组合物CA1和CA2展现出与当前所使用的钆螯合物组合物C1相当的自旋回波T1。因此，造影剂组合物CA1和CA2适合被用作体内磁共振成像的造影剂。

III.根据本发明的组合物的MRI对比度特性的体内评价

III.1用于在大鼠上测量MRI信号的一般程序

在克他命(50mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉下，使用柔性腕线圈和3T MRI扫描仪对大鼠进行成像。在冠状面上用参数(TR＝75，TE＝10，图层厚度＝10，FOV＝24)获取T1加权图像。

III.2用于在人体上磁共振成像的一般程序

在施用新鲜压榨的甜菜根汁之前和之后，用1.5特斯拉扫描仪(Philips Achieva，埃因霍温，荷兰)进行腹部研究。获得了屏气(Breathold)扰相梯度回波(GRE)轴向和冠状同相(coronal in-phase)梯度回波(GRE)(TE：4.2ms，TR：8.5，FA：10，图层厚度：10mm)、同相和异相T1图像。在T1图像后，使用TE：80ms，TR：556，FA：90，图层厚度：7mm)生成轴向和冠状T2加权快速自旋回波图像，用于胃成像。

III.3在大鼠上的MRI

实验在当地动物实验伦理委员会批准之后开始(批准编号：64583101/2021/067)。使用10只体重250-300g的Wistar白化大鼠进行动物研究持续12周(对照组，n＝5，MRI组n＝5)。在实验研究期间，将大鼠饲养在22±2℃的温度和12/12的明/暗条件下。随意施用饲料和水。

III.3.1根据本发明的造影剂组合物的口服给药

给药前，将大鼠禁食12小时，然后测量MRI信号。然后，将根据本发明的造影剂组合物(CA2)和对比钆螯合物溶液(C1)用口服管饲法(Harward装置，22G)以3ml的剂量施用。将要MRI成像之前，施用克他命(Ketasol％10

用造影剂组合物CA2所获得的MRI结果示出于图6中。如从图6可以看出的，造影剂组合物CA2在口服给药后在胃中示出明亮的MRI对比度，能够描绘胃腔并且特别适合用于胃食管成像。胃中察觉到的黑色部分无实质对应。

用造影剂组合物CA2所获得的MRI结果示出于图7A)中：早期(给药后第一分钟之后获取)自旋回波T1加权图像(图像a)、早期(给药后第一分钟之后获取)脂肪饱和T2加权成像(图像b)和早期(给药后第一分钟之后获取)连续梯度回波T1加权图像(图像c和d)和晚期(给药后三小时之后获取)自旋回波T1加权图像(图像e)。如从图7A)可以看出的，造影剂组合物CA2能够在口服给药后的早期描绘小肠并且在晚期描绘肝脏和肾脏，并且对于上胃肠道成像和实质成像特别有用。

用对比钆螯合物溶液C1所获得的MRI结果示出于图7B)中：早期(给药后第一分钟之后获取)自旋回波T1加权图像(图像a和b)和早期(给药后第一分钟之后获取)连续梯度回波T1加权图像(图像c)。

由图7A和7B所描绘的结果的比较证明，根据本发明的造影剂组合物CA2示出比当前所使用的钆螯合物组合物(C1)尤其在连续梯度回波T1加权成像中更好的小肠腔的扩张和描绘。这是特别有利的，因为在LAVA ASPIR MRI序列T1加权图像上测量梯度回波比自旋回波T1加权图像更方便。

III.3.2根据本发明的造影剂组合物的直肠给药

给药前，将大鼠禁食12小时，然后测量MRI信号。然后，将根据本发明的造影剂组合物(CA3-图5)以1ml的剂量直肠施用。将要MRI成像之前，施用克他命(Ketasol％10

用造影剂组合物CA3所获得的结果描绘于图5中。如由图5的图像a和b所示出的，造影剂组合物CA3在直肠给药后在肠中示出明亮的MRI对比度，能够描绘肠腔并且特别适合用于下胃肠道成像。

III.3.3根据本发明的造影剂组合物的静脉内给药

经由尾静脉手动施用1.5mL的造影剂组合物CA4。将要MRI成像之前，施用克他命(Ketasol％10

用造影剂组合物CA4所获得的结果描绘于图10中：早期(手动注射后第一分钟之后获取)大鼠减影血管造影成像(图像a)、晚期(手动注射后第二分钟之后获取)大鼠减影血管造影成像(图像b)和晚期(手动注射后第二分钟之后获取)大鼠减影腹部成像(图像c)成像。图10示出静脉期和实质期(肝脏)，并且证明组合物CA4对于静脉内给药后的血管和实质成像特别有用。

III.4急性喂食研究

为了研究造影剂组合物CA2的可能的急性毒性效应，进行喂食试验持续2天和4天。出于该目的，将15只大鼠分为3组，为对照(n＝5)、48小时组(n＝5)和96小时组(n＝5)。当对照组施用等渗盐水时，向喂食组口服施用3ml的造影剂组合物CA2持续2个和4个连续天。心内采集血液样品。由血清样品中评价ALT(丙氨酸氨基转移酶)和AST(天冬氨酸氨基转移酶)、尿素和肌酸值、TAS(总抗氧化状态)和TOS(总氧化状态)水平(Clin Biochem,38(12):1103-1111,2005)。在喂食试验结束时，在麻醉下(克他命和Ksilazin)通过颈椎脱位使大鼠安乐死。

总氧化状态(TOS)的测量

使用Clin Biochem,38(12):1103-1111,2005中所描述的新颖自动测量方法确定血清的TOS。样品中存在的氧化剂使亚铁离子-邻联茴香胺络合物氧化成铁离子。大量存在于反应介质中的甘油分子增强了氧化反应。铁离子在酸性介质中与二甲酚橙形成有色络合物。可以采用分光光度法测量的颜色强度与样品中存在的氧化剂分子的总量有关。测定用过氧化氢校准，并且结果以微摩尔H

总抗氧化状态(TAS)的测量

使用Clin Biochem,37(2):112119,2004中所描述的自动测量方法确定血清的TAS。该方法基于抗氧化剂对更稳定的2,2'-次偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)自由基阳离子的特征颜色的漂白。结果以mmol Trolox当量/L表示。

血液分析的结果总结在表1中。如由TAS值所示出的，造影剂组合物CA2呈现抗氧化活性。在施用造影剂组合物CA2后，未观察到肾或肝毒性。

表1：用口服植物化学提取物喂食持续2天和4天的大鼠的血液生化值

取肝脏和肾脏组织，置于10％甲醛溶液中并且在可能的效果方面进行组织病理学评价。

组织学程序

取肝脏和肾脏组织，置于10％甲醛溶液中并且在可能的效果方面进行组织病理学评价。在所研究的组织上未曾观察到病理学。

将胃和肠组织置于10％福尔马林溶液中持续24小时，然后进行处理并且包埋在石蜡中。将石蜡包埋的组织切成4μm、制备并且用苏木精-伊红(HE)染色，并且在光学显微镜下检查(Olympus BX50；Olympus Corp.，东京，日本)。通过盲法观察对组织样本进行光学双显微镜分析。图11A)示出来自口服给药根据本发明的造影剂组合物CA2持续四个连续天后的实验大鼠的肠的组织学样品的显微图像。图11B)示出来自口服施用根据本发明的造影剂组合物CA2持续四个连续天后的实验大鼠的胃的组织学样品的显微图像。由图11所显示的结果证明，口服施用1mL的剂量的根据本发明的造影剂组合物CA2持续四个连续天没有相关的毒性效应。

III.5人体上的磁共振成像

本发明人在喝下400ml的新鲜压榨的甜菜根汁之前，饿了12小时。MRI结果由图8显示：本发明人在口服施用新鲜压榨的甜菜根汁之前(图8a：左图像：轴向梯度回波T1加权图像；右图像：冠状梯度回波T1加权图像)和之后(图8b：左图像：轴向梯度回波T1加权图像(异相)；右图像：冠状梯度回波T2加权图像)的腹部MRI图像。如图8中所看出的，在口服给药后，新鲜压制的甜菜根汁使得能够更好地描绘人胃腔和胃壁，并且对于胃成像特别有用。

III.6对人正常成纤维细胞培养物的分子分析

在人健康成纤维细胞培养物中测试了CA2，并且未示出抗增殖效应并且未示出对细胞活力率的影响。

将人、新生儿，健康原代真皮成纤维细胞(HFB，

细胞增殖测定：

根据制造商的说明，用基于XTT的试剂盒(Biological Industries，目录号：20-300-1000)研究细胞增殖，并且在CA2给药之后24h用TECAN Sunrise仪器在450/670nm下采用分光光度法测量三次。

图12示出以0-60μM的浓度施用根据本发明的造影剂组合物(CA2)之后人体健康成纤维细胞(HFB)中的细胞增殖水平(x轴：所施用的CA2的浓度，y轴：在分光光度测定装置(TECAN Sunrise)中所测量的吸光度值)：在温育24小时之后，所施用的0-60μM的CA2在人体健康成纤维细胞(HFB)中对细胞活力的作用。未观察到统计学上显著的差异。