地椒挥发油在制备抗抑郁药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及地椒挥发油在制备抗抑郁药物中的应用。

背景技术

抑郁症是一种常见而复杂的心理健康障碍，其特征包括长期的低落情绪、失眠、疲劳和对生活失去兴趣等。现有的抑郁症治疗方法主要包括药物治疗和心理治疗，然而，一些患者可能对药物产生耐受性或出现副作用，而心理治疗则可能需要较长时间的持续性应用。多种天然药物(高晓霞等(2019).中国药理学通报,35(6),781-785)、植物精油(李美玲等.(2020).中国心理卫生杂志,34(5),444-448.)及成分(孙小玲等.(2018).中华精神科杂志,51(3),176-181.)通过不同的作用机制具有显著的抗抑郁效果。地椒挥发油因其天然成分，被广泛应用于芳香疗法。地椒，又称地椒，系唇形科地椒属植物，全草药用，有祛风解表、止咳、降压的功效，可提挥发油，制作香料。地椒挥发油具有舒缓神经、缓解焦虑和改善情绪的潜在功效。然而，迄今为止，还没有专门针对使用地椒挥发油治疗抑郁症的专利方案。因此，现有的治疗方法尚未充分解决抑郁症治疗的所有方面，尤其是在提供更为自然、无副作用的替代方法方面存在一定不足。本发明旨在克服这些问题，提供一种使用地椒挥发油治疗抑郁症的新方法，以有效缓解抑郁症患者的症状，提高其生活质量。通过深入研究地椒挥发油的药理作用和对抑郁症患者的治疗效果，我们提出了一种创新性、自然疗法的发明，旨在为抑郁症患者提供一种更安全、更有效的治疗选择。

发明内容

为了解决上述背景所提出的技术问题，本发明通过深入研究地椒挥发油的药理作用和对抑郁症患者的治疗效果，证实了地椒挥发油能够有效缓解抑郁症患者的症状，提高其生活质量，可为抑郁症患者提供一种更安全、更有效的治疗选择。

为达到上述的设计目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明目的是提供地椒挥发油在制备抗抑郁药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种抗抑郁药物。所述的药物是以地椒挥发油作为唯一活性成分，或以包含地椒挥发油的药物组合物作为活性成分。所述的药物添加药学上可接受的辅料制成临床应用的药物制剂。

进一步地，所述的药物制剂包括口服制剂或注射制剂。所述的口服剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或混悬剂等。所述的注射制剂包括输液、注射剂等。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次分析了地椒挥发油的药理作用和对抑郁症患者的治疗效果，证实了地椒挥发油能够有效缓解抑郁症患者的症状，提高其生活质量，可为抑郁症患者提供一种更安全、更有效的治疗选择。

附图说明

图1为地椒挥发油缓解抑郁模型小鼠悬尾静止时间对比图；

图2为地椒挥发油缓解抑郁模型小鼠糖水偏好度对比图；

图3为地椒挥发油缓解抑郁模型小鼠新奇抑制摄食行为潜伏期对比图；

图4为地椒挥发油缓解抑郁模型小鼠血清皮质酮激素水平对比图。

图5为地椒挥发油促进小鼠海马DG区神经干细胞增殖对比图。

图6为地椒挥发油促进小鼠海马DG区神经干细胞迁移对比图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1、实验材料

1.1实验动物

昆明小鼠，雄性，8周龄,40±5g，购自陕西新程隆远生物科技有限公司。

1.2实验试剂

地椒挥发油的制备：取300kg地椒草清洗去杂后，于DJ-SM-6T多功能提取罐中加纯净水4500L，浸泡30分钟，加热并保持96-100℃，罐内压力0.1-0.15Mpa，蒸馏提取4-5h，收集挥发油约375mL-525mL。

白藜芦醇(阿拉丁，CAS#:501-36-0)，大豆油(阿拉丁，CAS#:8001-22-7)

2、实验方法

2.1抑郁模型的建立

将昆明小鼠，雄性，8周龄，饲养条件为水食自由摄取，24h正常昼夜节律。随机分为对照组和抑郁模型组，抑郁模型组55只，对照组5只。抑郁模型组采用慢性轻度刺激建立抑郁模型。具体操作如下：每天下午两点，将小鼠关进开洞的50mL离心管中，并置于黑暗环境中倾斜45度放置。每天持续3h，3h中有半个小时维持90分贝以上的噪音，持续建模14天[10]。

2.2药物处理

抑郁模型建立成功之后，将抑郁小鼠随机分为7组，每组5只，以腹腔注射的方式给药，分别给予每只小鼠0.1mL 50mg/kg地椒挥发油、0.1mL大豆油(对照组)、0.1mL 50mg/kg用10％酒精配制的白藜芦醇处理，共14天。

2.3行为学检测

药物处理结束之后，立即进行糖水偏好实验、悬尾实验、新奇抑制摄食实验，采用糖水偏好指数、悬尾静止时间、摄食潜伏期作为评价药物抗抑郁作用的指标。

2.3.1糖水偏好实验

通过观察小鼠对糖水和普通饮用水的喜好程度来评估其愉悦感受。通常认为，如果小鼠对糖水的偏好程度高于普通饮用水，则说明小鼠有愉悦感受。蔗糖偏好实验包括两个部分：适应训练部分和测试部分。

训练阶段：在训练阶段，小鼠每笼放入两瓶2％的蔗糖溶液，在前24h持续提供给小鼠。在24h后，将其中一瓶蔗糖溶液换成纯水，这样小鼠将有一个蔗糖溶液和一个纯水瓶子。在36h后，交替瓶子的位置，以防止由于瓶子位置产生的任何偏差。完成适应训练后，小鼠禁食禁水24h，为后续的测试做准备。

测试阶段：在测试阶段，将小鼠置于单笼条件下，只能选择事先称重好的两个瓶子。一个瓶子中是2％的蔗糖溶液，另一个瓶子中是纯水。小鼠禁食后，进行24h的测试。测试结束后，取走两个瓶子并进行称重，记录小鼠的总液体消耗量、蔗糖溶液的消耗量和纯水的消耗量。使用糖水偏好指数作为评价药物抗抑郁作用的指标。

糖水偏好指数％＝糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)

2.3.2悬尾实验

将小鼠被悬挂在一个适当高度的水平杆子上，通常是使用胶带将小鼠的尾巴固定在杆子上。小鼠无法逃脱，也无法保持平衡，因此会出现一段时间的运动无力和无助感，表现出一种抑郁状态。实验中通常记录小鼠挣扎和运动无力的时间，作为评估小鼠抑郁行为的指标。一般来说，记录小鼠挣扎和运动无力的时间越长，说明小鼠的抑郁状态越严重。

将小鼠尾巴轻轻提起，用夹子夹在尾巴适当位置，挂在悬尾箱上部支架上，使小鼠头部向下倒立悬挂，头部尖端距地面20cm，不能逃脱或接触地面或任何其他表面。悬挂时间为6min，使小鼠适应环境1min之后，记录5min内小鼠静止不动的时间。使用静止时间作为药物抗抑郁指标。

2.3.3新奇抑制摄食实验

新奇抑制摄食实验是一种用于评估小鼠压力反应和抑郁症状的行为学实验。在新奇抑制摄食实验中，通常会将小鼠单独放置在一个新的环境中，并给予小鼠一个固定的时间适应环境。然后，给小鼠提供一个熟悉的食物，例如正常饲料或糖水。此时开始计时，并记录小鼠进食的时间。如果小鼠在进食前持续不吃食物的时间超过正常范围，那么可以认为小鼠表现出了抑郁症状，这种情况下摄食潜伏期将会被延长。

使用顶部开放的透明或白色不透明树脂测试箱，提供足够的空间供动物活动和观察。在测试箱底部铺满约2cm厚的垫料，提供动物的舒适性和隔离，并在测试箱中央摆放一定数量的饲料颗粒，作为动物进行摄食的刺激物。在实验前一定时间内，对实验动物进行禁食，通常为24h。确保动物禁食期间无法获得额外的食物。将禁食后的小鼠从同一个角落放入测试箱中，并开始计时。以开始咀嚼食物为标准，记录小鼠摄食潜伏期的时间。如果在5min内未进食，则将摄食潜伏期记录为5min。整个实验的测试时间通常为5min，此期间记录动物的食物摄入情况和行为，用摄食潜伏期作为评价药物抗抑郁作用的指标。

2.4样品取材

小鼠行为学实验结束之后，处死小鼠并收集脑组织和血液进一步进行生化分析评估药物抗抑郁作用，取出的脑组织泡入4％多聚甲醛通用型组织固定液中，放入－80℃冰箱。

提取的血液进行酶联免疫检测实验，测定皮质酮激素的含量，具体操作严格按照试剂盒说明进行。脑组织切片之后使用免疫荧光(BrdU、DCX)检测海马中神经干细胞增殖与迁移情况来评估药物的抗抑郁效果。

2.5皮质酮激素含量测定实验原理：试剂盒提供的微孔板表面涂层有特异性的抗体，这些抗体能够与皮质酮分子结合。将预处理后的样品加入到涂层的微孔中，其中的皮质酮与涂层抗体结合形成抗原-抗体复合物。将与酶(如辣根过氧化物酶，HRP)标记的二抗加入到微孔中，该二抗能与皮质酮结合形成二抗-抗原-抗体复合物。经过充分洗涤，以去除未结合的物质。加入底物(如TMB)进行酶催化反应。底物在HRP酶的催化下发生氧化反应，生成可测量的信号。通过加入反应停止液，终止底物反应，停止信号的生成。使用酶标仪测量反应终止后溶液的吸光度或发光度。吸光度或发光度的强度与样品中的皮质酮浓度呈正相关。通过与已知浓度的标准曲线进行比较，可以计算出待测样品中皮质酮的浓度。

实验步骤实验按照凡科维的试剂盒说明书严格进行，主要步骤包括：

(1)准备试剂、样品和标准品

(2)加入准备好的样品和标准品，37℃反应30min。

(3)洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应30min。

(4)洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色30min。

(5)加入终止液，并在15min内读取OD值。

(6)计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程。按曲线方程计算各样本浓度值。最终样本浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。

2.6免疫荧光检测

(1)PBS缓冲液清洗：使用PBS缓冲液对脑切片进行3次洗涤，每次持续5min。

(2)HCl处理：将脑切片置于37℃水中孵育20min，使用HCl试剂。

(3)硼酸钠缓冲液清洗：对脑切片进行两次硼酸钠缓冲液清洗，每次持续5min，确保pH值为8.5。

(4)PBS缓冲液清洗：使用PBS缓冲液对脑切片进行3次洗涤，每次持续5min。

(5)牛血清封闭：将脑切片封闭在含有5％牛血清稀释液的PBS中，封闭时间为1至2h。

(6)一抗混合液孵育：制备一抗混合液，包括MouseAnti-Brdu(稀释比例1∶500)和Rabbit Anti-Dcx(稀释比例1∶500)，添加2％牛血清。将脑切片浸泡在一抗混合液中，在4℃条件下孵育过夜，使用平板摇床进行慢摇。(7)脑切片回温：将脑切片从4℃取出，并回温1h。

(8)PBS缓冲液清洗：使用PBS缓冲液对脑切片进行3次洗涤，每次持续5min。

(9)二抗混合液孵育：制备二抗混合液，包括D-R555和D-M488(稀释比例1∶500)。在常温和慢摇条件下，全程避光，孵育3h。(从此步骤之后需要全程避光)

(10)PBS缓冲液清洗：使用PBS缓冲液对脑切片进行3次洗涤，每次持续5min。

(11)抗荧光淬灭封片剂封片：使用抗荧光淬灭封片剂对脑切片进行封片处理，注意避光。封片后，可以在20℃冰箱中避光保存。(短期观察可放置4℃)

(12)镜检：使用细胞共聚焦显微镜观察并记录脑切片海马区中神经干细胞的增殖与迁移情况。

免疫荧光实验染色脑切片时选择范围为80片全海马组织切片中随机选取20片。脑组织切片拍摄时选择海马区域进行拍摄，使用LSM800倒置荧光显微镜完成，主要图像放大倍数为100倍，统计每张切片上整个DG区的BrdU和DCX阳性细胞总数。

BrdU的工作原理：在实验中，BrdU通常以溶液形式添加到细胞培养基或动物体内。细胞或动物通过摄取培养基或经血液分布到不同组织中，BrdU会进入细胞。一旦BrdU进入细胞，它会替代正常的脱氧尿嘧啶(dU)成为新合成的DNA链的一部分。BrdU的化学结构类似于dU，但其中的氢原子被溴原子所取代。为了使BrdU标记的DNA能够被检测，细胞需要被固定并进行一系列处理步骤。这些处理步骤可能包括使用化学物质(如乙酸、甲醛等)对细胞进行固定，以及使用蛋白酶等酶对细胞进行处理，使DNA可访问。通过使用特异性的抗BrdU抗体，可以对固定的细胞或组织进行染色，并识别BrdU标记的DNA。这通常使用免疫荧光染色或免疫组织化学方法进行。通过显微镜观察样本，可以确定BrdU标记的细胞或组织的位置和数量。通过定量分析和图像处理技术，可以评估细胞增殖和DNA合成的程度。

DCX工作原理：在神经系统的发育过程中，神经前体细胞需要迁移到特定的位置，以形成正确的脑结构。DCX蛋白参与调节神经前体细胞的迁移。它与微管结合，并调节微管的动态稳定性,通过与微管相关蛋白和蛋白复合物相互作用，DCX促进神经前体细胞的运动和迁移，使其能够到达目标区域。这对于神经系统的正常发育和功能至关重要。

2.7数据统计分析

行为学实验的实验数据使用Graphpad Prism 9.0进行组间差异分析，分析方法为Student's t-test，当P值＜0.05时认定所比较数据组间具有显著差异。

3、结论

由图1结果可以看出给与昆明小鼠连续14天腹腔注射地椒挥发油后，可以显著减少抑郁模型小鼠悬尾的静止时间，与已明确报道有抗抑郁效果的白藜芦醇的处理效果处于相同水平，说明地椒挥发油处理有效缓解了小鼠的抑郁样行为。

由图2结果可以看出给与昆明小鼠连续14天腹腔注射地椒挥发油后，可以显著增加抑郁模型小鼠的糖水偏好度，与已明确报道有抗抑郁效果的白藜芦醇的处理效果处于相同水平，说明地椒挥发油处理有效缓解了小鼠的抑郁样行为。

由图3结果可以看出给与昆明小鼠连续14天腹腔注射地椒挥发油后，可以显著减少抑郁模型小鼠的新奇抑制摄食的潜伏期，说明地椒挥发油处理有效缓解了小鼠的抑郁样行为。

由图4结果可以看出给与昆明小鼠连续14天腹腔注射地椒挥发油后，可以显著抑制抑郁模型小鼠血清中的皮质酮激素水平，与已明确报道有抗抑郁效果的白藜芦醇的处理效果处于相同水平，前人文献报道，慢性束缚应激抑郁模型小鼠血清中皮质酮的水平显著升高，地椒挥发油处理可以显著小鼠血清中的皮质酮水平，说明地椒挥发油处理能有效缓解了小鼠的抑郁症状，且其可能与皮质酮的清楚有关。

前人文献报道，小鼠海马脑区干细胞的增殖分化与抑郁样行为的发生和发展密切相关。由图5结果可以看出，地椒挥发油处理可以有效促进抑郁模型小鼠海马DG区神经干细胞的增殖(Brdu)，说明地椒挥发油处理对小鼠抑郁样行为的缓解可能与其促进小鼠海马DG区神经干细胞的增殖有关。

由图6结果可以看出，地椒挥发油处理可以有效促进抑郁模型小鼠海马DG区神经干细胞的迁移(DCX)，说明地椒挥发油处理对小鼠抑郁样行为的缓解可能与其促进小鼠海马DG区神经干细胞的增殖有关。

以上内容是结合具体的优选实施方案对本发明所做的进一步详细说明，便于该技术领域的技术人员能理解和应用本发明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示,对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。