具有缓冲层的纳米粒子

技术领域

本发明属于放射疗法领域。特别是本发明涉及一种纳米粒子，用于疗法及体内成像的一种纳米粒子，以及制备一纳米粒子的一种方法。

背景技术

放射疗法，也被称为放疗，通常用于治疗癌症、肿瘤或其他恶性肿瘤。在放疗中，电离辐射被用来杀死恶性细胞或通过破坏这些细胞的DNA来减缓其生长。

另一种杀死或减缓恶性细胞生长的方法是光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)。通常，在光动力疗法中，光敏剂被电磁辐射激活，产生细胞毒性部分，损害或杀死接触这些部分的细胞。如果由这种光敏剂组成的化合物在靠近恶性细胞的地方被激活，这种细胞毒性可被用来杀死恶性细胞，如癌细胞。

放射疗法主要通过损害DNA来损害细胞，而光动力疗法中产生的细胞毒性物种也可以损害细胞的其他部分，如细胞膜。因此，放疗及光动力疗法可以相互补充使用。取决于使用的是哪种光敏剂，所述光敏剂的激活可以使用与放疗相同的辐射，或使用不同类型或波长的辐射。

传统上，用于光动力疗法的光敏剂是由波长在紫外线或可见光区域的电磁辐射激活的。例如在EP1100366中就使用了这样的波长。使用紫外线(UV)或可见光(vis)的缺点是这些类型的辐射的渗透深度有限，通常限制了紫外线或可见光辐射的PDT用于浅层病变(例如皮肤癌)。

在US20160271251、US20130158336及Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,1770 -1774中，描述了包括一发光化合物及一光敏剂的材料。当发光化合物被高能辐射激活时，光敏剂可以吸收由发光化合物发出的光。使用这种材料，可以为PDT实现更深的穿透深度。然而，这种从发光化合物向光敏剂的辐射能量转移的一个缺点是效率不高。

与放疗及光动力疗法有关的另一个问题是，靠近恶性细胞的健康细胞也会暴露在有害的辐射及/或细胞毒性中。为了确保在放疗过程中所有的恶性细胞都得到治疗，通常是对比恶性肿瘤稍大的区域进行照射。如果这个区域太大，可能会导致大量健康细胞受损，这可能对患者产生严重的负面影响。因此，理想的做法是尽量减少需要照射的区域，并使健康细胞尽可能少地暴露在有害的辐射中。实现这一目标的方法之一是将放射治疗与成像技术相结合。如果能非常准确地确定恶性细胞的位置，就意味着需要照射的恶性肿瘤周围的安全范围可以变小，从而使健康细胞受到的破坏性辐射更少。

为此，使用既能作为治疗剂(如光动力疗法)，又能作为成像剂的粒子可以是有益的。在US20160271251中，描述了用于光动力疗法的包含磁共振成像(Magnetic ResonanceImaging,MRI)造影剂的粒子。在J.Am.Chem.Soc.2013,135,6494-6503中，公开具有上转换纳米粒子核心及多孔硅壳的粒子。所述粒子可以向肿瘤输送一化疗药物，且所述上转换纳米粒子核心可以用于成像。

然而，将同一粒子用于成像及疗法所关联的一个问题是，这两种功能会相互产生负面影响。例如，如果为了成像而用电磁辐射照射粒子，在成像过程中吸收的一些本应转化为另一波长的电磁辐射的能量也可能被转移到粒子中负责治疗功能的部分。这种能量转移过程可能会导致几个问题。例如，成像可能变得不那么准确或不那么有效，因为这种非故意的能量转移到粒子的其他部分，导致为成像目的而转换的吸收的能量减少。另一个负面影响可能是，当粒子用于成像以准确确定组织中的哪个区域应该被治疗时，能量向用于治疗的粒子区域转移可能导致治疗的激活，例如在不希望的位置通过细胞毒性破坏细胞。

本发明的一个目的是解决与放射治疗相关的一个或多个问题。具体而言，本发明的一个目的是提供一种可能性，有效地结合放射疗法、光动力疗法及/或成像，同时限制这些应用之间的不希望的干扰。

在Zhu等人，Advanced Science，2019，6，1901358中，讨论了几种稀土掺杂的上转换纳米粒子。限制用于不同应用的纳米粒子的不同部分之间的不希望的干扰，在D1中没有公开。

在Fischer等人，Nano Letters 2019,19,3878-3885中，描述了由一核心及一单一外壳组成的多个纳米粒子，并研究了改变外壳厚度的效应。

在US2019210886中，描述了具有一核心/外壳/壳体结构的多个纳米粒子，所述结构有利于纳米粒子中的能量转移。

Ding等人，Journal of Materials Chemistry C，2016，4，2432描述了活性核/发光壳/活性壳纳米粒子。D4的纳米粒子的发光内壳促进了纳米粒子的不同部分之间的能量转移。

CN109481680描述了包含一光敏剂的核/壳纳米粒子，可用于成像引导的光动力疗法。限制成像及光动力疗法之间的不希望的干扰没有被讨论。

在CN110478483中，公开了多色上转换纳米探针，其包括上转换粒子及光敏剂。在这些纳米探针中，光动力疗法是由上转换粒子发射的辐射激活的，这意味着上转换粒子与光敏剂的干扰对于D6的纳米探针是必要的，不应被避免。

WO2013181076描述了具有CaF

发明内容

根据本发明，提供一种纳米粒子，包括：

-一核心；

-一外层；以及

-一缓冲层，位于所述核心及所述外层之间；

其中，所述缓冲层防止所述核心及所述外层之间的能量转移。

所述缓冲层防止能量从所述核心向所述外层转移，及/或从所述外层向所述核心转移。通过防止这些能量转移过程，所述粒子的所述核心及/或所述外层可以有效地用于医学成像及治疗等应用。

在本发明的另一方面，提供如本文所述的用于疗法的一种纳米粒子，根据如本文所述的用于一肿瘤的治疗的一种纳米粒子，以及如本文所述的用于体内成像的一种纳米粒子。

根据本发明的另一方面，提供一种方法，用于生产如本文所述的纳米粒子，包括步骤：

-加热一溶液，所述溶液包括多个核心前驱物，然后

-注入一分散体，所述分散体包括多个缓冲层前驱物，然后

-注入一分散体，所述分散体包括多个外层前驱物。

本发明的另一方面是一种方法，用于一人类或动物的体内成像或治疗或两者，包括步骤：

-向一患者施用多个如本文所述的纳米粒子；以及

-用一种或多种类型的辐射照射所述患者的身体的至少部分。

根据本发明的另一方面，提供了如本文所述的一纳米粒子用于疗法、体内成像或两者的用途。

附图说明

图1是根据本发明一实施例的纳米粒子的设计及合成，以及上转换成像及联合放疗及X射线介导的光动力疗法的机制的示意图。

图2显示根据一实施例的纳米粒子的电子显微镜图像：(a)核心NaErF

图3显示(a)NPs分别在808纳米、980纳米及1530纳米的激光激发下的UCL光谱；(b)X射线照射下的一纳米粒子的发射光谱；(c)根据本发明一实施例的一纳米粒子在受到近红外光或X射线照射时的能量转移相互作用示意图；(d)根据本发明一实施例的纳米粒子在980纳米激光激发下的缓冲层厚度相关的上转换发光(所述缓冲层NaYF

图4显示(a)直径，(b)Zeta电位，(c)根据本发明多个实施例的多个纳米粒子的FTIR光谱，(d)多个纳米粒子在254纳米激发下的发光光谱，(e)多个纳米粒子及孟加拉玫瑰红(Rose Bengal,RB)在378纳米激发下的发射的动态曲线，(f)多个纳米粒子使用不同照射波长的相对二苯基异苯呋喃(DPBF)消耗。

图5显示(a)根据本发明的一实施例，用50微克/毫升(μg/mL)、100微克/毫升(μg/mL)及200微克/毫升(μg/mL)的纳米粒子培养的MCF-7细胞的共聚焦图像，其中细胞核用DAPI染色。UCL图像是在980纳米激光照射下用650纳米UCL拍摄的。RB图像是在540纳米的激光照射下用590纳米的发射器拍摄的；(b)根据本发明的一实施例，用纳米粒子培养的MCF-7细胞的不同过道共聚焦图像。UCL-Red、UCL-Green及UCL-RB图像是在980纳米的照射下，分别用650纳米、540纳米及590纳米的UCL拍摄。

图6显示(a)用不同浓度的UIRPPs加近红外激光(808纳米、980纳米或1530纳米照射)培养的细胞的活力。(b)不同群组的细胞活力，包括用生理盐水、不同浓度的RB、NPs或UIRPPs加X射线照射的群组；(c)MCF-7细胞的凋亡，包括用生理盐水、UIRPPs、UIRPPS+980纳米照射、仅在980纳米激光照射下、NPs+X射线、不同浓度UIRPPs(50、100或200μg/mL)+X射线照射的。MCF-7细胞被膜联蛋白(Annexin)V-FITC染色并通过FAC扫描进行分析。

图7显示核心NaErF

图8显示Er@Y@Gd/Tb NPs在紫外光(254纳米)或近红外光(980纳米)激发下的发光光谱以及RB的吸收光谱。

图9显示Er@Y@Gd/Tb NPs在(a)808纳米或(b)1530纳米激光激发下的UCL光谱，缓冲层的厚度不同(缓冲层NaYF

图10显示UIRPPs制备后十天的UCL光谱轨迹。

图11显示含有DPBF的溶液与(a)0.1毫克/毫升(mg/mL)RB及(b-d)2毫克/毫升(mg/mL)UIRPPs培养的紫外线-可见光吸收光谱。(b-d)分别在808纳米、980纳米或1530纳米的激光照射下。照射时间的长短在附图中标出。

图12显示含有DPBF的溶液与(a)1.5毫克/毫升(mg/mL)UIRPPs、(b)2.5毫克/毫升(mg/mL)UIRPPs及(c)5毫克/毫升(mg/mL)UIRPPs培养并经过X射线照射的紫外线-可见光吸收光谱，其时间的长短在附图中标出。

图13显示用不同浓度的UIRPPs(50、100、200或400微克/毫升(μg/mL))培养的MCF-7的细胞活力，以及经近红外激光照射(808纳米、980纳米或1530纳米)后的细胞活力。

图14显示用100微克/毫升(μg/mL)UIRPPs培养的MCF-7细胞的共聚焦图像，细胞核用DAPI染色；UCL图像的照射为808纳米或980纳米，发射分別为650纳米(红色)或绿色(540纳米)。

图15显示用100微克/毫升(μg/mL)UIRPPs培养的MCF-7细胞的Z-扫描共聚焦图像，细胞核用DAPI染色；UCL图像以980纳米激光及650纳米发射照射；RB圖像以540纳米及590纳米发射照射。

具体实施方式

根据本发明，提供一种纳米粒子，包括：

-一核心，

-一外层，以及

-一缓冲层，位于所述核心及所述外层之间，

其中，所述缓冲层防止所述核心及所述外层之间的能量转移。

所述缓冲层通过防止能量从所述核心转移到所述外层，及/或从所述外层转移到所述核心来防止所述核心与所述外层之间的能量转移。通过防止这些能量转移过程，所述粒子的所述核心及/或所述外层可以有效地用于医学成像及治疗等应用。

本文所用的能量转移是指电子的能量转移，即能量从一电子地激发的供体向一受体的辐射性或非辐射性转移。本文所用的能量转移并不是指能量从一个系统转移到另一个系统的其他类型的过程，如机械能量转移或振动能量转移。

放射疗法(RT)，或放疗，是指使用电离辐射治疗癌症、肿瘤或其他恶性肿瘤。

本文所用的放射增敏剂是指与电离辐射(即粒子辐射，如质子辐射，或光子能量大于10电子伏特(eV)的电磁辐射，如X射线或γ射线)结合使用时，能增强电离辐射对细胞造成的损害的任何化合物。

本文所用的光敏剂是指与非电离辐射(即光子能量为10电子伏特(eV)或更低的电磁辐射，包括紫外线、可见光、近红外及红外辐射)结合使用时，能增强非电离电磁辐射对细胞造成的损伤的任何化合物。

在某些情况下，某个化合物既可以作为一光敏剂，又可以作为放射增敏剂，这取决于多个条件。这种化合物的一个例子是孟加拉玫瑰红(RB)。当用绿光照射时，孟加拉玫瑰红可以作为一种光敏剂。然而，在X射线照射的影响下，孟加拉玫瑰红也可以作为一种放射增敏剂，或者直接被X射线激活，或者通过从另一种被X射线激活的化合物的能量转移间接地激活。

应用光敏剂及/或放射增敏剂的一种特殊类型的疗法是光动力疗法(PDT)。在这种疗法中，光敏剂及/或放射增敏剂被辐射激活，使其产生氧自由基及/或单线态氧，从而在光敏剂及/或放射增敏剂的直接附近引起细胞毒性。一般来说，光动力疗法指的是光敏剂在被非电离电磁辐射激活时提供细胞毒性作用的疗法。然而，光动力疗法也可以包括放射增敏剂在被电离辐射激活时提供细胞毒性作用的疗法。在后一种情况下，所述疗法有时也被称为X射线诱导或X射线介导的光动力疗法，或X-PDT。

在纳米粒子具有治疗功能的情况下，优选是由所述外层提供治疗功能，因为诸如细胞毒性的治疗效果通常只发生在非常局部。

所述核心、所述外层及所述缓冲层可以有各种各样的组成物。这些组成物可以根据所述核心及所述外层的所需功能来选择。这些功能包括成像技术，如磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、荧光成像技术及上转换发光(UCL)成像，以及治疗功能，如光动力疗法的功能、药物输送、肿瘤细胞靶向。这些功能中的每一个都需要所述核心及/或所述外层的不同组成物。因此，所述缓冲层的组成物可以基于所述核心及/或所述外层的功能以及与此功能相关的组成物来选择。

为了选择一种能有效防止能量从所述核心的一激发态转移到所述外层及/或从所述外层的一激发态转移到所述核心的一缓冲层，可以选择一种缓冲层组成物，其中的能量水平与缓冲层与所述核心及/或所述缓冲层与所述外层之间的任何辐射性或非辐射性能量转移的条件不一致。如此一来，能量从所述核心转移到所述外层及/或从所述外层转移到所述核心不能通过所述缓冲层进行。

为了避免能量从所述核心到所述外层及/或从所述外层到所述核心的直接转移(即缓冲层不参与的能量转移)，所述缓冲层的厚度应该足够高，因为能量转移过程在很大程度上取决于能量转移的材料之间的距离。所述缓冲层的优选厚度可能取决于所述核心、所述缓冲层及所述外层的具体材料。优选地，所述缓冲层的厚度为1纳米或更多，更优选地2纳米或更多，甚至更优选地3纳米或更多。所述缓冲层的所述厚度可高达30纳米，但优选地更低，如5-20纳米或3-10纳米。例如，本发明人表明，一厚度为2.6纳米或更大的NaYF

确定核心、缓冲层及外层组成物的某种组合是否可用于根据本发明的纳米粒子的另一种方法是合成包括一核心、一缓冲层及一外层的一粒子，并测试通过辐射激发外层是否导致对核心功能的干扰，及/或反之。例如，如果纳米粒子的核心具有适合使用近红外(NIR)辐射的上转换发光成像的组成物，而外层具有适合X-PDT的组成物，那么在外层被X射线激发的情况下，缓冲层应该防止干扰核心的成像功能，而X-PDT功能不应该被近红外辐射激发的核心激活。例如，这可以通过测量近红外辐射照射时纳米粒子的细胞毒性来评估，或者通过测试及比较有无X射线照射的成像精度及效率来评估。

优选的是，所述核心、所述外层及所述缓冲层是结晶的，因为这通常会使所述核心及所述外层的功能效率更高，如辐射诱导的成像及疗法。另一个优点是，在所述核心、所述缓冲层及所述外层是结晶的情况下，所述纳米粒子的所述核心及不同层之间的分离更加明显。

优选地，所述核心、所述缓冲层及所述外层具有实质上相同的晶体结构，如六方晶体结构。如果所述核心层、所述缓冲层及所述外层具有实质上相同的晶体结构，那么在不同层之间的界面上存在的缺陷就会减少。这导致纳米粒子的功能更有效。核心层、缓冲层及外层具有基本相同的晶体结构的其他优点是，这可能导致粒子具有更大的机械强度。另外，它可能对粒子的合成产生积极影响，特别是在纳米粒子的合成包括晶体生长的情况下。

如果所述核心、所述缓冲层及所述外层具有实质上相同的晶体结构，所述缓冲层及所述核心之间以及所述缓冲层及所述外层之间的晶格失配就足够小，以容纳层的生长。如果晶格失配过大，会导致层之间缺陷的增加，并对层的结晶度产生不利影响。优选地，晶格失配为25％或更少，更优选地10％或更少，例如5％或更少。

在一优选实施例中，本文所述的纳米粒子的核心包括一或多个稀土元素。这使得本发明的纳米粒子可以用于成像。含有稀土元素的纳米粒子，例如上转换纳米粒子，可以有利地用于组织深层的成像，通过使用近红外辐射来激发材料，从而引起近红外及/或深红色光谱区的发射，而没有成像技术的不利影响，例如使用X射线的计算机断层扫描(CT)。在一优选实施例中，本文所述的纳米粒子的所述核心包括一上转换材料。

在实施例中，纳米粒子的所述核心是一上转换粒子，意味着核心包括一上转换材料。这并不一定意味着上转换材料必须构成纳米粒子的绝对最内层。例如，上转换粒子，即所述纳米粒子的所述核心，可以由一内核组成，所述内核提供由一上转换壳包围的结构完整性，反之亦然。

优选地，所述核心、所述缓冲层及/或所述外层包括一种或多种稀土元素的一氧化物或氟化物材料。这种材料的例子包括CaO-X

在纳米粒子用于成像的情况下，稀土元素的选择会影响发光的波长。例如，当用波长为980纳米的近红外辐射照射时，掺入Er

优选地，根据本发明的纳米粒子的外层可以作为放射增敏剂，及/或作为X射线诱导的光动力疗法的基底。因此，优选地，所述外层包括放射增敏剂，优选地适用于X射线诱导的及/或X射线介导的光动力疗法(X-PDT)。如果所述外层用于X射线诱导的光动力疗法，可以选择所述外层中的稀土元素，使所述外层的能级方案有利于向可能固定在粒子表面的增敏剂进行有效的能量转移。例如，外层可以包括掺有Tb

对于稀土掺杂的NaXF

根据本发明的一实施例，本文所述的纳米粒子还包括附着到所述外层的一或多个光敏剂、放射增敏剂及/或肿瘤靶向部分。光敏剂及/或放射增敏剂可由非电离及/或电离辐射直接激活，或通过所述外层中被非电离及/或电离辐射激发的辐射敏化离子间接激活。光敏剂及/或放射增敏剂的这种间接激活可以由外层中受激原子的非辐射及/或辐射能量转移引起。优选地，光敏剂及/或放射增敏剂的间接激活是通过非辐射能量转移进行的，例如通过福斯特共振能量转移(

优选地，光敏剂、放射增敏剂及/或肿瘤靶向部分通过官能化基团，如聚烯丙基胺基团固定在所述外层。

各种各样的光敏剂、放射增敏剂及/或肿瘤靶向部分可以被固定在纳米粒子的所述外层。它们可以根据纳米粒子的预期功能来选择。可以使用的光敏剂及/或放射增敏剂包括提拉帕胺(Tirapazamine,TPZ)；孟加拉玫瑰红(Rose Bengal,RB)；卟啉衍生物，如卟啉钠、血卟啉(Hematoporphyrin,HP)、原卟啉IX(Protoporphyrin IX,PpIX)；酞菁(Phthalocyanine,Pc)衍生物，如ZnPc、AlC

一般来说，纳米粒子的外层不应该被额外的层所包围，特别是当外层必须与周围环境直接接触以达到其预期效果时。例如，在外层被用于X-PDT的情况下，外层应与要治疗的组织接触。然而，在某些情况下，外层可以由附加层包围，只要这些附加层不妨碍外层与纳米粒子周围(例如组织)的接触。这种不妨碍这种接触的层的例子是多孔层。

本发明的另一方面是本文所述的用于疗法的纳米粒子。如本文所述的纳米粒子的所述核心及/或所述外层可具有为纳米粒子提供治疗功能，如药物的运输及传递，以及细胞毒性。

本发明的另一方面是如本文所述的纳米粒子用于一肿瘤的治疗。在纳米粒子表现出细胞毒性的情况下，它可用于例如杀死肿瘤细胞或减慢肿瘤的生长。另外，纳米粒子可以运输对治疗恶性肿瘤有效的药物，并在恶性细胞附近特别传递这些药物。

本发明的另一方面是本发明所述的纳米粒子用于体内成像。优选地，在纳米粒子的所述核心及/或所述外层包括可用于使用例如近红外辐射在深红或近红外光谱区成像的纳米粒子的情况下，所述纳米粒子可用于在深层组织中成像，例如对癌症、肿瘤或其他恶性肿瘤进行成像，而无需将健康细胞暴露于电离辐射。有利地，当根据本发明的纳米粒子被用于成像以及肿瘤的治疗时，成像功能可以使用电离辐射对肿瘤进行更有针对性的治疗，从而限制健康细胞接触的有害辐射量。

本发明的另一方面是一种方法，用于生产本文所述的纳米粒子，包括步骤：

-加热一溶液，所述溶液包括多个核心前驱物，然后

-添加多个缓冲层前驱物，然后

-添加多个外层前驱物。

例如，缓冲层前驱物及/或外层前驱物的添加可以通过注射包含所述多个前驱物的分散体来完成。

优选地，为了溶解及/或分解缓冲层前驱物及外层前驱物，以及为了实现纳米粒子或纳米粒子的不同层的结晶，将溶液加热到200℃或更高的温度，优选地250℃或更高，例如300℃或更高。

为了防止污染及/或不希望的反应，纳米粒子的生产优选地是在生产纳米粒子的反应条件下的惰性气体气氛中进行。例如，纳米粒子的生产可以在N

由于溶解及/或分解所述多个前驱物及/或通过结晶形成纳米粒子可能需要高温，因此优选的是使用一种或多种具有高沸点的溶剂及/或在高温下不分解的溶剂。优选地，一种或多种溶剂的沸点为150℃或更高，更优选地200℃或更高，例如250℃或更高。例如，脂肪酸、长链(例如C10+)脂肪族碳氢化合物及其混合物可以作为溶剂使用。油酸及十八碳烯的混合物特别适合于生产纳米粒子。

在某些情况下，特别地在纳米粒子包括氟化物的情况下(例如NaYF

为了防止不希望的OH

在实施例中，按溶液的总重量计算，所述溶液包含少于200ppm的水，优选地少于100ppm。更优选地，所述溶液实质上不含水。在缓冲层前驱物及/或外层前驱物以溶液及/或分散体的形式加入的情况下，这些溶液及/或分散体按溶液或分散体的总重量计算也优选地含有少于200ppm的水，优选地少于100ppm。优选地，包含所述缓冲层前驱物及/或所述外层前驱物的溶液及/或分散体实质上不含水。

为了从溶液及/或分散体中除去任何微量的水，可以加入与水反应的一反应物。优选地，所述反应物与水反应的反应速率高于反向反应的反应速率，以使水从溶液中适当地被移除。例如，可以加入酸酐，如醋酸酐，导致与水反应后形成羧酸。之后，剩余的酸酐及羧酸可以从溶液及/或分散体中移除，例如通过蒸发。

优选地，所述与水反应的反应物是在低于发生结晶的温度下添加的。例如，当纳米粒子的结晶发生在200℃以上的温度时，可首先将溶液加热到约100℃，在该温度下可加入与水反应的反应剂。随后，反应产物及剩余的反应物(如果使用酸酐作为反应物：羧酸及剩余的酸酐)可以在约100℃的温度下通过排空除去。之后，可将溶液进一步加热至发生结晶的温度。

通过使用合适的反应物(如酸酐)从溶液或分散体中除去水分，也可以对一般的纳米粒子生产有利，而不仅仅是对具有核心、外层及缓冲层的纳米粒子的生产有利。因此，还提供了一种生产纳米粒子的方法，包括：提供包括纳米粒子前驱物的一溶液；使用与水反应的一反应物，优选地一酸酐，从所述溶液中除去水分；以及加热所述溶液。优选的与水反应的所述反应物、温度及溶剂与上面讨论的相同。

为了将官能团附着到根据本发明的纳米粒子的所述外层，所述方法可还包括外层的表面的官能化的步骤。表面官能化可以使用配体交换进行。用于所述外层的所述表面的官能化的优选分子是聚烯丙基胺，以及PEG衍生物，如聚丙烯酰胺(PAAm)或聚丙烯酸(PAA)。

外层表面官能化后，官能团，如光敏剂、放射增敏剂、肿瘤靶向部分及/或化疗药物可以结合到官能化纳米粒子上。这些官能团可以通过共价键及/或物理吸附结合到纳米粒子上。优选地，这些官能团与官能化外层共价结合，因为这使得官能团及纳米粒子之间的结合更加稳定。

本发明的另一方面是一种方法，用于一人类或动物的体内成像或治疗或两者的方法，包括步骤：

-向一患者施用本文所述的纳米粒子；以及

-用一种或多种类型的辐射照射所述患者的身体的至少部分。

根据本发明的另一方面，提供如本文所述的纳米粒子用于疗法、体内成像或两者的用途。

示例

试剂

Y(CH

·示例1-干核心β-NaErF

将10毫升1-十八烯及10毫升油酸加热到100℃，并在真空下保持60分钟。然后在氮气流中加入0.995毫摩尔(mmol)Er(CH

·示例2-α-NaYF

将160毫升油酸及160毫升ODE在500毫升三颈瓶中加热至100℃，并在真空下保持60分钟。然后在氮气流中加入20毫摩尔(mmol)Y(CH

·示例3-α-NaGdF

α-NaGdF

·示例4-合成β-NaErF

将0.5毫摩尔(mmol)核心β-NaErF

透射电子显微镜(TEM)图像指示，在示例1中制备的核心纳米粒子是球形的、单分散的，平均直径为约9纳米(图2a)。NaYF

图3a显示纳米粒子的上转换发光光谱。在808纳米、980纳米或1530纳米的激发下，出现了650纳米左右的单色红色发射，这来自于掺杂在NaErF

·示例5-Er@Y@Gd/Tb NPs的表面官能化

为了使纳米粒子进一步官能化以用于X射线介导的PDT应用，将合成的油酸封端的纳米粒子(NPs)用聚烯丙基胺(PAAm)涂覆，通过配体交换形成NPs-NH

如图4a及4b所示，动态光散射得到的纳米粒子直径及Zeta电位在氨基基团修饰后分别从约26纳米增加到约52纳米及从+5.5mV增加到+30mV。这些变化指出，胺基被成功地连接在纳米粒子的表面。随后，RB及癌症靶向部分-叶酸(FA)与NPs-NH

在疗法方面，多层UIRPP结构使有效的非辐射能量从纳米粒子外层的供体原子转移到表面固定的光敏剂。X射线活性Tb

·示例6-单线态氧检测(

用近红外激光或X射线激活的PDT在溶液中的功效是通过使用单线态氧检测器二苯基异苯呋喃(DPBF)来评估

如图4f、11及12所示，在0.7瓦/平方厘米(W/cm

·示例7-UCL成像及RT&X-PDT在体外的应用

为了评估在癌症治疗学中的应用，在体外对UIRPPs的UCL成像及RT&X-PDT的协同效应进行了测试。乳腺癌MCF-7细胞在杜尔贝科改良鹰培养基(Dulbecco's modifiedEagle medium,DMEM)中，在5％的二氧化碳气氛下，在37℃下维持。将细胞在一个特殊的共聚焦孔板(每个孔1×10

为了评估UIRPPs及激光的毒性，MCF-7细胞在96孔板(每孔1×10

图13是乳腺癌系(MCF-7)接受治疗后的生存能力。无论是用UIRPPs培养的MCF-7细胞，即使浓度高达400微克/毫升，还是在近红外激光照射下(808纳米、980纳米或1530纳米)都没有明显的细胞毒性。正如预期的那样，MCF-7细胞与UIRPPs(100微克/毫升)培养8小时后，在980或808纳米的激光照射下，细胞核周围发出了明亮的红色UCL信号(图14)。值得注意的是，没有绿色的UCL，保证了成像所需的单色红色UCL。纳米粒子被叶酸(FA)修饰，以通过FA受体介导的内吞作用提高细胞的摄取效率。如图5a所示，正向定位是成功的，UCL信号随着UIRPPs的浓度急剧增加。UCL成像在UIRPPs的浓度从50到200微克/毫升的范围内保持高分辨率。为了突出UCL成像的优势，与540纳米激光照射下使用RB发射的荧光成像进行了比较(参见图5a)。虽然RB辅助成像也随着RB浓度的增加而急剧增加，但图像变得越来越模糊，主要是由于照射光的散射。图15是Z-扫描的共焦图像，显示了内吞作用及UCL成像的精细分辨率。评估了近红外激光照射下RB的光活性(参见图5b)，既没有观察到UCL的绿色信号，也没有观察到RB的信号，支持生物官能化的UIRPPs适用于特定的单色红色UCL成像，没有严重的光损伤。

关于UIRPPs的PDT效果，在96孔板上将细胞分成8组(G1至G8)，G1及G5用生理盐水培养，G2、G3,G4及G8用不同浓度的UIRPPs(0、50、100、200、400微克/毫升)培养，G6用12％RB(0、6、12、24、48微克/毫升)培养，G7用Er@Y@Gd/Tb NPs培养。培养8小时后，所有组都用PBS清洗。将生理盐水(G1及G5)作为对照组，G2、G3及G4用近红外激光(800纳米、980纳米或1530纳米)照射15分钟，功率为0.7瓦/平方厘米(W/cm

MTS检测被用来评估UIRPPs的无损伤的UCL成像及RT&X-PDT的协同作用。如图6a所示，近红外激光(808纳米，980纳米或1530纳米)的照射没有诱导统计MCF-7细胞死亡，显然没有足够的自由基氧(ROS)生成。相反，在低剂量的X射线照射(80kV，1.5Gy)下，观察到细胞活力的明显下降，如图6b所示。对于UIRPPs+X-射线组，细胞死亡的数量随着UIRPPs浓度的增加而增加，当与400微克/毫升UIRPPs培养时，协同RT&X-PDT导致了约80％的细胞死亡。

●示例8-流式细胞仪

流式细胞仪分析用于描述经历协同RT&X-PDT的MCF-7细胞的凋亡特征。对于流式细胞仪的分析，细胞被胰蛋白酶化并被膜联蛋白V-FITC及碘化丙啶(膜联蛋白V-FITC凋亡染色/检测试剂盒)染色以测量细胞的凋亡。

根据制造商的说明，使用膜联蛋白V-FITC/PI试剂盒(BD)进行膜联蛋白V-异硫氰酸酯(FITC)及碘化丙啶(PI)染色。简而言之，MCF-7细胞在6孔板中培养，然后用不同的试剂处理(G1：生理盐水，G2：生理盐水，G3：100微克/毫升UIRPPs，G4：100微克/毫升，G5：100微克/毫升Er@Y@Gd/Tb NPs，G6：50微克/毫升，UIRPPs，G7：100微克/毫升UIRPPs，G8：100微克/毫升UIRPPs)处理8小时，每个有3个平行。用生理盐水处理的细胞(G1)为对照。对于G2及G4，细胞被暴露在980纳米的激光下15分钟，功率为0.7瓦/平方厘米(W/cm

从图6c可以看出，膜联蛋白V-FITC染色是指凋亡细胞，碘化丙啶(PI)染色是指坏死细胞。用生理盐水、UIRPPs培养的MCF-7细胞，仅仅在980纳米激光照射后，或用UIRPPs加980纳米激光照射培养的MCF-7细胞，都保持了非常高的存活率。然而，在X射线照射下，MCF-7细胞明显发生凋亡。在“NPs+X-射线”组中，纳米粒子没有与光敏剂结合，X-射线辐射效应导致约30％的细胞死亡。在“UIRPPs”组中，不同浓度的UIRPPs(50微克/毫升、100微克/毫升或200微克/毫升)对应的X射线照射后只有38.3％、26.5％或15.6％的活细胞。细胞的死亡比例高达84.4％，充分显示了RT&X-PDT的协同作用。这些数据显示，根据本发明的一实施例，使用纳米粒子进行无损伤的UCL成像及协同的高效RT&X-PDT。