一种皮肤衰老蛋白标志物—APOA1蛋白及其无创性提取方法

技术领域

本发明涉及一种皮肤衰老蛋白标志物—APOA1蛋白及其无创性提取方法，属于分子生物学领域。

背景技术

人类的皮肤随年龄增长自然老化或随着环境刺激而衰老，导致皮肤衰老。自然老化为内源性老化，表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等，环境刺激为外源性老化，如日晒所致的光老化。如果皮肤得不到良好的保养或随着年龄增长而衰退，死皮就会附着在皮肤表面而不脱落，因而造成一系列问题，严重影响美容。

载脂蛋白是血浆脂蛋白部分各类脂蛋中均含有一种和几种不同特异性载脂蛋白。目前已经发现的载脂蛋白有20余种。其中主要有aPOA1、AⅡ、B-100、B48、CⅠ、CⅡ、 CⅢ、D、E等。APOA1(ApoAⅠ，aPOA1)是ApoA族最多的一种组分，是HDL中的主要载脂蛋白。Shore等于1968年首先从人HDL中分离纯化得到ApoAⅠ。1970年代中期Brewer阐明了ApoAⅠ的氨基酸序列，并预测了其二级结构的要点。在分子生物学兴起的80年代，Karathanasis等人相继报道了人ApoAⅠcDNA和染色体DNA序列。人成熟的ApoAⅠ的由243氨基酸残基组成，是单一多肽链，分子量为28300D。人及大鼠、猴、兔、牛、鸭、树鼷等动物的ApoAⅠ已分离纯化。人和其他种属的ApoAⅠ的氨基末端为Asp，羧基末端为Gln，其分子中不含半胱氨酸和异亮氨酸。经等点聚焦电泳证实人和动物的ApoAⅠ都是不均一的，有10种不同的亚组分，至少有六种多态性。经等电聚焦和双相电泳中的系统命名，ApoAⅠ多肽性依次称为ApoaⅠ0、ApoAⅠ-1、 ApoAⅠ-2、ApoAⅠ+1、ApoAⅠ+2，其中ApoAⅠ0含量最多。其通过促进胆固醇从组织中流出并充当卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的辅助因子，参与胆固醇从组织向肝脏的反向转运以排泄。可与β淀粉样蛋白、载脂蛋白A-1受体、热激蛋白、磷脂酰胆碱、高密度脂蛋白颗粒及受体结合，具有化学驱除、转移胆固醇活性、脂肪酶抑制剂活性、磷脂酰胆碱-固醇O-酰基转移酶激活剂活性。对于肾上腺发育、淀粉样原纤维形成、血管内皮细胞迁移、胆固醇生物合成及代谢运输有意义。它是一种分泌的伴侣蛋白，在某些压力条件下也可以在细胞质中发现。已经发现参与几种基本的生物学事件，例如细胞死亡，肿瘤进展和神经退行性疾病。APOA1在皮肤鳞状细胞癌转移作用中增加。 APOA1参与脂质代谢，HDL和Apo A1的平均水平银屑病患者低于对照组。APOA1 是与炎症相关的蛋白质。

但是迄今为止没有通过APOA1蛋白(载脂蛋白A-Ⅰ)判断判断皮肤衰老程度的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种皮肤衰老蛋白标志物—APOA1蛋白及其无创性提取方法。

本发明载脂蛋白A-Ⅰ(APOA1)在辅助判断衰老程度中的应用。

本发明中，所述载脂蛋白A-Ⅰ(APOA1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

本发明提供的用于检测受试者载脂蛋白A-Ⅰ(APOA1)含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为判断或辅助判断皮肤衰老。

本发明提供了用于检测受试者载脂蛋白A-Ⅰ含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断皮肤衰老程度。

上述的应用中，所述产品为试剂盒或芯片。

本发明一种产品，包括用于检测载脂蛋白A-Ⅰ含量的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)判断或辅助判断皮肤衰老；

(b)诊断或辅助诊断皮肤衰老程度。

上述的产品中，所述用于检测受试者载脂蛋白A-Ⅰ含量的物质是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

上述的产品中，所述用于检测受试者载脂蛋白A-Ⅰ含量的物质的仪器为轨道阱高分辨率质谱仪。

上述的产品中，所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：

1)取受试者表皮皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ含量；

3)将步骤2)测得的载脂蛋白A-Ⅰ含量与该年龄段正常人皮肤中的载脂蛋白A-Ⅰ含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度；

或4)将步骤2)测得的载脂蛋白A-Ⅰ含量与各年龄段正常人皮肤中的载脂蛋白 A-Ⅰ含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的衰老程度或皮肤生理年龄。

本发明进一步提供了一种辅助判断衰老程度的数据处理装置系统，包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄一致的正常人员皮肤中的载脂蛋白A-Ⅰ含量数据或所述数据存储模块被配置为存储正常人皮肤中的载脂蛋白A-Ⅰ含量标准曲线；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄一致的正常人皮肤中的载脂蛋白A-Ⅰ含量数据进行比较；或所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ含量数据与数据存储模块中存储的正常人皮肤中的载脂蛋白A-Ⅰ含量标准曲线进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否与其实际年龄相符，并输出判定结果。

上述的数据处理装置系统中，所述辅助判断衰老程度的系统还包括检测受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ含量的物质；

所述用于检测受试者载脂蛋白A-Ⅰ含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

上述的数据处理装置系统中，所述辅助判断衰老程度的系统还包括检测受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ含量的仪器；

所述检测受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ含量的仪器具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

本发明提供了受试者表皮皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ中肽段的提取方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M胶贴于前臂曲侧部位；1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，用无菌刀片并沉积在玻璃板上在转移到1.5毫升离心管之前；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟；然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)以下在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT 在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。

本发明进一步提供了受试者表皮皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：

(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M胶贴于前臂曲侧部位；1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，用无菌刀片并沉积在玻璃板上在转移到1.5毫升离心管之前；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟；然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)以下在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT 在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

(3)检测

a)将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UHPLC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，25cm柱长)串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；

b)DDA和/或DIA质谱检测

DDA质谱检测：

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific，San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000；二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s，AGC设置为：一级3E6，二级1E5；

DIA质谱检测：

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DIA(data-independent acquisition)模式检测；参数设置如下：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

本发明具有以下优点：

通过检测待测者的载脂蛋白A-Ⅰ含量与标准曲线对比判断皮肤衰老程度，其方法更为简便，且结果准确，效率高；其为不同年龄的受试者皮肤衰老程度提供依据，对皮肤管理起指导意义。

附图说明

图1为本发明载脂蛋白A-Ⅰ(APOA1)的特征肽段 (LREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLR)的质谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

以生活环境比较接近、身体健康的白领人群为样本，通过无创法进行表皮皮肤样本取样(具体为3M胶粘皮，完成取样)。

本发明对受试者表皮皮肤样本中蛋白质含量的测定方法，按照如下步骤：

(1)高效液相

受试者表皮皮肤样本取样：将3M胶(3M医用胶贴的生产厂家为3M Health Care 3MBrookings)贴于前臂曲侧部位，以排除光老化因素；1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品。

干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块(0.5×0.5厘米)，用无菌刀片并沉积在玻璃板上在转移到1.5毫升离心管之前；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟。然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜。

3)以下在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理 DTT在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥；即得到干燥的肽段样品。

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样。通过Thermo公司UltiMate 3000UHPLC进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，25cm柱长)串联，以 500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。

(2)DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific，San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

(3)DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进入到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DIA(data-independent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

经上述方法测定，载脂蛋白A-Ⅰ(APOA1)的特征肽段(LREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLR)的质谱如图1所示。

按照上述方法分别对受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ(APOA1)进行测定，得到基于质谱的相对含量数据如下表1所示：

表1受试者皮肤样本中APOA1基于质谱的相对含量

由上表1中数据可以看出，随着年龄的增长，受试者皮肤样本中载脂蛋白A-Ⅰ(APOA1)基于质谱的相对含量增加。

在实际应用中，根据载脂蛋白A-Ⅰ(APOA1)基于质谱的相对含量辅助判断受试者皮肤衰老程度的方法如下：

(1)首先采集大量的各个年龄阶段的具有统计学意义的正常人的皮肤样本，分别测定各皮肤样本中APOA1基于质谱的相对含量；

(2)测定受试者皮肤样本中的APOA1基于质谱的相对含量；然后进行(3)或 (4)；

(3)将步骤(2)中受试者的数据，与该年龄段正常人皮肤中的APOA1基于质谱的含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的相对皮肤衰老程度；

(4)基于步骤(1)中的数据，绘制年龄-APOA1基于质谱的相对含量的标准曲线，再测定受试者皮肤样本中的APOA1基于质谱的相对含量，与上述标准曲线比较，判定受试者的皮肤衰老程度或皮肤年龄，即可。

本发明中，上述载脂蛋白A-Ⅰ具体如下所示：

Gene:APOA1

Protein:Apolipoprotein A-I

氨基酸序列如SEQ ID NO.1，具体如下：

MKAAVLTLAVLFLTGSQARHFWQQDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRD YVSQFEGS

ALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSK DLEEVKAK

VQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEM RDRARAHV

DALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKP ALEDLRQ

GLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ 。

序列表

<110> 杨森

<120> 一种皮肤衰老蛋白标志物—APOA1蛋白及其无创性提取方法

<130> GNCLW211344

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser

1 5 10 15

Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp

20 25 30

Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp

35 40 45

Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys

50 55 60

Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr

65 70 75 80

Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp

85 90 95

Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys

100 105 110

Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe

115 120 125

Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu

130 135 140

Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu

145 150 155 160

Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala

165 170 175

Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp

180 185 190

Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn

195 200 205

Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu

210 215 220

Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln

225 230 235 240

Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala

245 250 255

Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

260 265