一种针对骨吸收代谢状态的β-CTx化学发光检测方法和试剂盒

技术领域

本发明属于骨密度检测相关技术领域，具体涉及一种针对骨吸收代谢状态的β-CTx化学发光检测方法和试剂盒。

背景技术

国际上公认的骨质疏松检测方法是骨密度监测，包括单光子吸收测定法、双能X线吸收测定法、定量CT法、超声骨密度测定法等。但是骨密度反应的是骨骼形态学的改变，往往需要几年的时间才会发生变化，因此不能及时反馈人体骨骼生长和骨质疏松相关药物的治疗效果，并且骨密度检测仪器成本较高，特定医院才会配置，不适合大范围推广。

骨质疏松指标指南中推荐β胶原特殊序列(β-CTx)作为快速评价骨质疏松诊断和治疗效果的指标。β-CTx是骨吸收过程中产生的特异性代谢产物，反馈了破骨细胞相关的骨吸收水平的变化。正常骨代谢期间，成熟的I型胶原会被降解，形成的小片段进入血液后通过肾脏排泄。生理或病理性骨吸收增强时(如老年人或骨质疏松症)，I型胶原的降解也增高，血液中的胶原片段含量随之也相应升高。检测β-CTx骨吸收标志物便可测得破骨细胞的活性，能反映短期内骨量的变化，对诊断与监测骨质疏松症、骨关节病等骨代谢病具有重要价值。因此，有必要开发针对骨代谢循环系统的检测方法，以快速准确反应人体骨骼变化情况，可以用于骨质疏松的诊断筛查。

到目前为止，用于检测人血清中β-CTx的方法主要有：酶联免疫法(ELISA)放射性免疫检测法和化学发光检测法。但是当前的这些方法的灵敏度不高，线性范围窄，准确度低，重复性差。因此当前需要对上述方法进行改进来满足检测的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对骨吸收代谢状态的β-CTx化学发光检测方法和试剂盒，其采用辣根过氧化物作为化学发光标记物，具有灵敏度高，线性范围宽，准确度高，重复性好的优点，并且辣根过氧化物分子量小，不影响抗体的空间位阻。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。

一种针对骨吸收代谢状态的β-CTx化学发光检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

步骤1：进行第一次孵育：加入30μL被测样本和60μL的β-CTx试剂R1到包被有链霉亲和素偶联物的微孔中，一起孵育15min，使抗原从血清中释放出来；

所述β-CTx试剂R1具体为：生物素化的β-CTx捕获抗体；

步骤2：进行第二次孵育：加入60μL的β-CTx试剂R2，孵育15min；

所述β-CTx试剂R2具体为：辣根过氧化物酶标记的β-CTx检测抗体；

步骤3：进行清洗：即吸取350μL清洗液加入到微孔中，清洗4次，将未结合在固相上的抗体和被测样本被清除；

步骤4：进行读数：加入化学发光底物A、化学发光底物B，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；

步骤5：进行利用已知浓度的定标品绘制发光强度标准曲线，根据步骤4得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的骨吸收代谢状态的β-CTx含量。

进一步的，所述链霉亲和素偶联物具体为：生物素化牛血清白蛋白与链霉亲和素的偶联物。

进一步的，所述清洗液具体为：含0.1％吐温20和0.1％ Proclin300的0.05M、pH值为7.5的Tris-HCl溶液。

进一步的，所述底物液A具体为含有0.4％鲁米诺，pH9.0的水溶液；所述底物液B具体为含有0.06％四硼酸钠，pH5.0的水溶液。

进一步的，所述β-CTx试剂R1的配置方法为：取27.44g K2HPO4、5.76gKH2PO4、30g牛血清白蛋白、30g牛γ球蛋白、3.5g小鼠血清加入到1L纯化水中，调节pH为7.3，再加入2mg生物素化β-CTx抗体、2mg消泡剂204、10g PROCLIN300配置成β-CTx试剂R1。

进一步的，所述β-CTx试剂R2的配置方法为：取1.8g K2HPO4、5.4gKH2PO4、30g/L牛血清白蛋白、0.4g ANS、10mg铁氰化钾加入到1L纯化水中，调节pH为7.2，再加入2mgβ-CTx抗体-HRP、2mg消泡剂204、10gPROCLIN300配置成β-CTx试剂R2。

进一步的，所述定标品具体为：将一定量的β-CTx抗原添加至马血清中，配置成浓度约为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、600pg/mL、2000pg/mL和6000pg/mL的定标品。

基于上述检测方法，本发明还提供了一种针对骨吸收代谢状态的β-CTx化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括链霉亲和素偶联物包被的微孔、β-CTx试剂R1、β-CTx试剂R2、定标品、化学发光底物液A和底物液B、浓缩清洗液。

进一步的，所述化学发光底物液A和底物液B、浓缩清洗液均以独立包装提供。

与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

1、本发明采用化学发光双抗体直接夹心法体外定量检测被测样本中的β-胶原特殊序列(β-CTx)的含量；在预包被链霉亲和素和生物素化牛血清白蛋白的微孔中加入被测样本后，再加入生物素化β-CTx抗体(IgG)，然后加入β-CTx抗体-HRP酶结合物，则被测样本中所含的β-CTx将会与之形成抗体—抗原—抗体—酶复合物；再洗去未结合在固相上的反应物，加入化学发光底物，化学发光底物在HRP酶的催化下发光，然后读取相对发光强度(RLU)，最后通过校准曲线计算样本中β-CTx的浓度，上述方法实现针对骨吸收代谢状态的β-CTx的检测。

2、本方法具有高灵敏度：生物素与抗体形成的生物素衍生物不仅保持了抗体的原有生物活性，并且每个链霉亲合素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物，因此具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。

3、本方法具有明显的特异性：链霉亲和素与生物素间具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性，因此生物素-链霉亲合素系统的优势的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，而且生物素-链霉亲合素系统的优势结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。

4、本方法具有稳定性：链霉亲和素结合生物素的亲的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合，因此生物素-链霉亲合素系统的优势在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。

5、本方法具有经济性：生物素-链霉亲合素系统可依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂，适用于不同的反应体系，而且都可高度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是生物素-链霉亲合素系统与成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用；并且生物素-链霉亲合素系统具高速、高效的特性，所需的温育时间不长，可大大缩减整体反应时间。

附图说明

图1为计算线性相关系数R2的示意图。

具体实施方式

实施例：基于本发明的检测方法，制作试剂盒进行以下各种性能指标的检测。

性能指标1、最低检测限：

将实施例的试剂盒作为实验组，市售试剂盒作为对照组进行实验，用零浓度稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，计算其RLU值(相对发光值)平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD。利用剂量-反应曲线计算出(M+2SD)对应的浓度值为最低检测限。

表1最低检测限结果

通过检测数据可知，本发明的检测方法具有较好的最低检测限。

性能指标2、线性范围及相关系数：

取接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限，对每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，如图1所示，并计算线性相关系数R2，R2不小于0.99。

表2线性范围结果

实验结果表明本试剂盒的线性结果的R2高于0.99，证明本发明的检测方法在其线性范围内均有准确的检测结果。

性能指标3、准确度：

使用β-CTx市售质控品1和质控品2作为样本，以市场上获得认可的β-CTx检测试剂盒作为对照组进行比对实验，各重复检测3次，将每次检测结果记为(Mi)，分别计算每次检测结果的相对偏差(Bi)。

表3准确度检测结果

通过表3的检测数据可知，实施例检测试剂盒与质控物质靶值的相对偏差均在10％以内，符合企业制定的技术要求，并且该测试结果优于对照试剂盒的15％以内的测试结果，表明本发明的试剂盒的准确度性能优于市场上获得认可的β-CTx检测试剂盒，证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对使得准确性得到了提升。

性能指标4、重复性：

使用β-CTx市售质控品1和质控品2作为样本，以市场上获得认可的β-CTx检测试剂盒作为对照组进行比对实验，各重复检测10次，计算各参考品10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV＝SD/M×100％，计算变异系数。

表4重复性检测结果

实验结果表明本试剂与对照例试剂的的检测结果的变异系数均在10％以内，并且本实施例的检测结果优于对比例的结果，证明本试剂的优于市售的试剂结果。

性能指标5、稳定性：

将实施例的试剂盒均置于37℃环境下7天，分别在0天、1天、3天、5天、7天测定，共3次重复，取其平均值，将第7天检测结果与第0天的检测结果进行比对，检测数据如表5。

表5稳定性检测结果

对比例的重复1到重复3的结果表明其避光环境中贮存7天的降解率为10.6％，而实施例试剂的重复1到重复3结果表明其在37℃避光环境中贮存7天测试结果降低了4.3％，降低幅度小于对比例试剂，证明本发明的试剂稳定性能够满足产品的要求。