蛋白质及其在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及蛋白质及其在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途。

背景技术

对于苏云金芽孢杆菌(Bt)的认知，起步阶段源于二十世纪初亚洲专家石渡繁胤(S.Ishiwata)从得猝倒病的家蚕(Bombyx mori)内部提取获得的猝倒细菌(Sottbacteria)，也就是苏云金杆菌猝倒变种(Bacillus thuringiensis var.sott)。Berliner在德国苏云金省(Thüingen)染病的地中海粉螟(Anagasta kuhniella Zeller)中分离获得一种杆菌，详尽地说明了其形状和培养特点后将其定名为苏云金杆菌。首个商业化的Bt制剂Sporeine出现于1938年的法国，主要作用的对象是地中海粉螟。

苏云金芽孢杆菌具有的一个突出特征是在芽孢形成过程中，可产生伴孢晶体蛋白。伴孢晶体蛋白由一种或多种蛋白组成，具有高度特异杀虫活性，这种蛋白通常被称为杀虫晶体蛋白。伴孢晶体蛋白以原毒素的状态存在，当它进入敏感昆虫的消化道后，在碱性环境中溶解并被蛋白酶激活成毒性多肽，活化的毒性多肽与昆虫中肠道的纹缘膜上的受体相结合，并且在细胞膜上形成孔道，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞裂解，最终导致幼虫的死亡。

目前，为了提高伴孢晶体蛋白杀菌特性，采用的技术手段主要有高毒力菌株筛选诱变、高性能毒蛋白从头设计等。然而，菌株诱变筛选效率低下，且成本高企，从头设计蛋白技术要求高且难以一次满足稳定性等其他农业场景要求。因此，高效、稳定、具有成本优势的增效物质受到越来越多的关注。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种蛋白质及其在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途和制备方法、组合物、杀虫剂、增强苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力的方法和杀虫方法，本发明的蛋白质与伴孢晶体蛋白共同作用后，可以有效地提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种蛋白质。根据本发明的实施例，所述蛋白质包括：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质。

发明人为了研究如何提高伴孢晶体蛋白毒力时发现，苏云金芽孢杆菌上清液与伴孢晶体蛋白混合作用时，可以提高伴孢晶体的毒力。进而，发明人推断可能是上清液中含有某些蛋白质所起到的作用。进一步地，发明人对上清液中的蛋白质进行分离和研究筛选，发现具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质(本发明亦简称“增效蛋白”)本身并没有杀虫活性，但是与伴孢晶体蛋白共同作用时，可以显著提高伴孢晶体蛋白的毒力。尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。

SVRYFANQIGHHTGKTWFFSNTHWRLQYQSSKFHWPRIRHAWYKHAFGEQNRNRHVWVLNEGYDYCCEMDWECNASALWQSAQICFLHHRASCIYEHGEPPKQRPAQDPWNHTREYRQYPSLHHDQYLEGLRTSVYRTFEHDPTLIMILHPYLAMRECPCQHLHEQHPALKIVKGCWIHYDKFNATGAPELLRSLDANLVAPYPIHVGDLEAPDDRPPQCMTGCQDIIFFYGQWLTISRMLFECFPMECSHLMCNHVEPPCQRDQNSWLPHTEMVKAWHQMGGDPSSRFHFLDKMDTDAVMNMWEYLCKYLELDDQENKDFVWAKKSNGVWYALVGQCHLSQCCLPEVYRCHCMKIRMDEMCTYDLPKKLADITAVASQSTSPPIMEVHHMFKMMDVCCCMRNQSAKDICVIVSEQIKEWCWQDEHDMRIVRTTMFNWEQTMTFSPTLHRNCVGKVVNLREMRDNALYWVEEEGEPRMDPRNFVTYIQNMPANTLFWKSSGHDMTEDLWWCQNDCGERVVRLFPLMQFYHASAKAKCRLHYYIIHRLKMFCKFLITKLYTVRPVGHFHCHSYFWQCYDMGMWHSGYGMAPQEELPQCMHESGWDGCIMILEFFIMCPTETIMDGHKAEVAEKLQDDTQECNRYQTGTAPGWNCDFNVQEQDAGSNIDKYWAPLGLWQLWIKVREIIWEHWMVLEHRYKWCCLDMRNIQFKLSTDKPRSYDECHTTCAFTGHFKDRVGWWLSFTDPEMAWHQFFGNAASPWAKMRFVIQITGYIQPKKHQKKPFSKRMAPCVPRLSWQLMGRVGPLWPCASNLRQMSLEPMATELWVDEIKWMHWRRCPLLPVPNHVKIAVLGCRPLPCVVINISRCMHDFIWYESETVTRLNNFQNYASGNYFKRPYGFPDGVFRITHWNIVKSH(SEQ ID NO：1)

在本发明的另一方面，本发明提出了前面蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途。如前所述，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质与伴孢晶体蛋白共同作用时，可以显著提高伴孢晶体蛋白的毒力。尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。

根据本发明的实施例，所述蛋白质用于提高伴孢晶体蛋白的杀虫能力。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：前面所述蛋白质；苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白。增效蛋白和苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白共同作用，可以有效地提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。

根据本发明的实施例，所述伴孢晶体蛋白与所述蛋白质的质量比为1：(0.5～7)。发明人经过大量实验得到上述较佳配比，由此，可以进一步提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种杀虫剂。根据本发明的实施例，所述杀虫剂包括：前面所述的组合物。根据本发明实施例的杀虫剂杀虫效果好，效率高，使用量低。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述蛋白质的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：步骤1：将苏云金芽孢杆菌进行发酵培养，所得发酵液离心，收集上清液；步骤2：将所述上清液进行透析，收集截留物；步骤3：将所述截留物通过层析柱，收集预定时间段流出的馏分，得到所述蛋白质。

增效蛋白存在于苏云金芽孢杆菌的发酵上清液中，将上清液进行透析，以除去小分子物质和盐类，再经过层析柱分离得到蛋白质。在采用层析柱分离时，对收集的不同时间的馏分进行研究，发现SEQ ID NO：1所示氨基酸的蛋白质具有较好的提高伴孢晶体蛋白活性的作用，并且其含量高，且分离度较高，因此，选择增效蛋白作为目标蛋白。由此，根据本发明实施例的方法操作简便，蛋白质的分离度高，收率高，馏分中蛋白质含量高，杂质少。

根据本发明的实施例，所述透析所采用的滤膜截留分子量为1000～6000。由此，可以有效地除去小分子物质和盐类，截留目标蛋白。盐类的去除有助于后续层析

根据本发明的实施例，所述层析柱包括阴离子交换柱与阳离子交换柱，所述阳离子交换柱选自GE SuperoseTM 6Increase，所述阴离子交换柱选自GE Capto IEX阴离子交换柱。发明人经过大量实验发现，采用阳离子交换柱和阴离子交换柱共同作用，可以有效地分离出目标蛋白，所得馏分中目标蛋白含量高、杂质少。进一步地，发明人优化筛选了上述具体的阴离子交换柱与阳离子交换柱，其分离效果更佳。

根据本发明的实施例，步骤3包括：将所述截留物先通过阳离子交换柱，收集特定时间段流出的第一馏分，再将所述第一馏分通过阴离子交换柱，收集特定时间段流出的第二馏分，得到所述蛋白质。由此，以便进一步提高分离效果，所得馏分中蛋白含量高、杂质少、收率高。

根据本发明的实施例，步骤3进一步包括：将收集的所述第二馏分进行冷冻干燥，制成透析冻干粉。由此，方便保存。

根据本发明的实施例，步骤3进一步包括：将收集的所述第二馏分和所述上清液一同进行冷冻干燥，制成上清和透析混合冻干粉。由于伴孢晶体蛋白与上清液共同作用时，也可以提高伴孢晶体蛋白的毒力，只是其效果没有伴孢晶体蛋白与增效蛋白效果好。进而，通过将收集的馏分和上清液一同进行冷冻干燥，所得上清和透析混合冻干粉可以进一步提高伴孢晶体蛋白的毒力。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种增强苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白与前面所述蛋白质进行混合处理。增效蛋白和苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白共同作用，可以有效地提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。

根据本发明的实施例，所述伴孢晶体蛋白与所述蛋白质的质量比为1：(0.5～7)，优选1：(1～4)。由此，可以进一步提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力。

根据本发明的实施例，所述蛋白质是以前面所述获得蛋白质的方法中的所述透析冻干粉或所述上清和透析混合冻干粉的形式提供的。由此，可以进一步提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种杀虫方法。根据本发明的实施例，所述杀虫方法包括：将前面所述杀虫剂施加于待处理的昆虫。由此，根据本发明实施例的方法可以高效杀虫，减少杀虫剂的使用量，提高杀虫效率，适于规模化应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在50L发酵罐对苏云金杆芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis aizawai_HD133)进行发酵，50小时后结束培养，收集发酵液，分别获得伴孢晶体蛋白和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质：

1、获得伴孢晶体蛋白

放罐发酵液静置24小时，12000rpm离心，取沉淀。用生理盐水洗涤/离心三次，冻干即可。

2、获得具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质

将发酵液于10000rpm转30分钟，4℃离心，收集发酵上清液。将发酵上清液分两部分，其中一部分置于-60℃冻干机过夜，冻干制成发酵上清液冻干粉，另一部分进行如下操作：将发酵上清液进行透析，截留分子量为3000，4℃透析24小时，总稀释倍数为10000倍，每隔8小时换一次水，收集截留物。将截留物用GE SuperoseTM 6Increase过柱，流动相为Tris，0.05mol，pH＝7.8，选择41min至43min馏分。将馏分用GE Capto IEX阴离子交换柱过柱，流动相为MOPS，0.05mol，pH＝7.3，选择12min馏分，掐峰收集。将馏出液置于-60℃冻干机过夜，冻干制成透析冻干粉。密封保存。

实施例2

在50L发酵罐对苏云金杆芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis aizawai_HD133)进行发酵，60小时后结束培养，收集发酵液，分别获得伴孢晶体蛋白和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质：

1、获得伴孢晶体蛋白

同实施例1。

2、获得具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质

将发酵液于10000rpm转30分钟，4℃离心，收集发酵上清液。将发酵上清液分两部分，其中一部分置于-60℃冻干机过夜，冻干制成发酵上清液冻干粉，另一部分进行如下操作：将发酵上清液进行透析，截留分子量为4000，4℃透析24小时，总稀释倍数为8000倍，每隔8小时换一次水，收集截留物。将截留物用GE SuperoseTM 6Increase过柱，流动相为Tris，0.05mol，pH＝7.8，选择41min至43min馏分。将馏分用GE Capto IEX阴离子交换柱过柱，流动相为MOPS，0.05mol，pH＝7.3，选择12min馏分，掐峰收集。将馏出液置于-60℃冻干机过夜，冻干制成透析冻干粉。密封保存。

生物活性实验

下面以实施例1为例，将制备好的伴孢晶体蛋白粉(简称孢晶粉)、发酵上清液冻干粉和透析冻干粉进行生物活性实验，实施例2的结果与实施例1相近，不再赘述。

生物效价检测方法参考论文：《棉铃虫作供试虫的苏云金杆菌制剂毒力生物测定的研究(DOI：CNKI:SUN:ZSWF.0.1990-S1-000)》。

结果如表1所示。由第1组、第2组和第3组数据可以看出，增效蛋白自身杀虫活性较低。由第4组和第5组数据可以看出，当增效蛋白与孢晶粉混合后，孢晶粉杀虫活性可提高三倍多，显著提高了孢晶粉毒力，从而可以减少孢晶粉的使用量，降低使用成本。由于小分子物质存在于发酵上清液中，经透析后除去，并不存在于透析冻干粉中，第5组和第6组实验的效价接近，表明起到增强伴孢晶体毒力的物质并非小分子物质，而是大分子物质。经过透析处理以除去小分子物质，可以进一步提高透析冻干粉中增效蛋白含量，由此，在减少伴孢晶体蛋白和透析冻干粉的添加量下，可以达到相近的增强毒力效果。

表1生物活性

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。