一种乙酰化透明质酸盐的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种乙酰化透明质酸盐的制备方法。

背景技术

透明质酸又名玻璃酸，是由葡糖醛酸和氨基葡糖的二糖重复排列而形成的一种酸性直链多聚粘多糖。1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是当下发现的自然界中保湿性较好的物质，被称为理想的天然保湿因子。透明质酸是一种多功能基质，透明质酸(玻尿酸)HA广泛分布于人体各部位。其中皮肤也含有大量的透明质酸。人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂。

乙酰化透明质酸盐具有比传统透明质酸钠更高效保湿、修复皮肤屏障和增加皮肤弹性等功效。通过在透明质酸结构上添加乙酰基，其生物活性区别明显,溶液具有良好的豁弹性和保湿、润滑功能，广泛应用于化妆品保湿美容，眼科手术薪弹剂及骨关节润滑的润滑剂，保湿性大幅增强，且更易被人体吸收。外用时能被皮肤吸收，增加皮下组织的含量,能有效增加皮肤弹性,达到深层保湿的效果，口服能补充体内的不足，对美容、预防和治疗骨关节炎具有显著的作用，目前乙酰化透明质酸在医药、保健品方面展现了良好的应用前景。

目前，乙酰化透明质酸盐的制备方法存在一定的缺点。比如CN109206537A公开了一种乙酰化透明质酸钠，将透明质酸或其盐在乙酸和乙酸酐混合溶剂中，在浓硫酸催化下进行酰化反应，反应结束后将反应液流加入水中析出沉淀物，经过滤和大量水洗涤后得到乙酰化透明质酸；CN114133419B公开了一种低分子量乙酰化透明质酸盐及其制备方法和应用，在惰性气体保护下，将低分子量的透明质酸或其盐加入到乙酸和乙酸酐的混合溶液中，加入浓硫酸催化剂进行酰化反应；反应结束后将反应液加入到醚类溶剂中析晶过滤、洗涤、碱液调节pH、干燥，即可制得。两者反应过程使用了受管控的乙酸酐与浓硫酸，操作复杂，对环境污染性大，且需喷雾干燥，成本较高，不利于工业化生产。CN113045686 B公开了一种乙酰化透明质酸的制备方法，采用有机碱活化处理透明质酸，然后采用乙酰氯乙酰化活化后的透明质酸，该专利采用有机碱活化处理透明质酸、最后制得乙酰化透明质酸盐，虽未使用乙酸酐、浓硫酸等试剂，但制得产品产率较低；且单一使用催化剂进行催化，催化效果差。

目前在得到乙酰化透明质酸盐的同时，提高产率、品质、降低成本并减少环境污染方面遇到极大的困难，因此有必要开发一种新的乙酰化透明质酸盐的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙酰化透明质酸盐的制备方法，此方法在提高产品产率、品质、降低成本的同时无需使用乙酸酐和硫酸等原料，解决了现有技术中产品产率低、成本高、环境污染大、制备原料为产品、难获得的问题。为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种乙酰化透明质酸盐的制备方法，制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸盐溶于第一有机溶剂，得到第一混合液；

步骤二：将乙酸与第一有机溶剂和活化试剂/有机碱混合，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，在一定温度下反应，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液与第二有机溶剂混合，析出固体粗品；

步骤五：将固体粗品用第二有机溶剂纯化，干燥后得到乙酰化透明质酸盐固体纯品；或步骤一与步骤二的操作顺序可以先后调换。

在制备乙酰化透明质酸盐的过程中，通过将乙酸溶于第二有机溶剂，并加入活化试剂进行预活化，使得其生成的第二反应液与透明质酸盐进行酯化反应，从而生产乙酰化透明质酸盐，在制备过程中未使用乙酸酐和浓硫酸，所用的乙酸也只是少量，降低成本，且制备试剂易于获取，更适合工业化生产，减轻了对环境的污染。仅利用预活化的的乙酸，得到的乙酰化透明质酸盐质量更好。

作为本发明的一种实施方式，活化试剂为DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)、EDCI[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]、HATU[N,N,N′,N′-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲]、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉)中的一种或多种，有机碱为DIEA(N,N-二异丙基乙胺)、TEA(三乙胺)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)、NMM(N-甲基吗啉)中的一种或多种。

作为本发明的一种更具体实施方式，活化试剂/有机碱为DIC/DMAP，选取该种活化试剂/有机碱利于提高酯化效率，提高收率，降低成本。

作为本发明的一种实施方式，乙酸与透明质酸盐的质量比为0.1：1～0.5：1。乙酸量过少，乙酰化程度不充分；乙酸量过多，乙酰化程度基本不变，成本增加。该质量比的范围有利于在保证乙酰化程度的同时，降低成本。活化试剂与透明质酸盐的质量比为0.1：1～2：1，优选0.5：1～1.5：1；有机碱与透明质酸盐的质量比为0.1：1～2：1，优选0.5：1～1.5：1；该质量比的范围有利于在保证乙酰化程度的同时，降低成本。

作为本发明的一种实施方式，第一有机溶剂包括DCM(二氧甲烷)、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、甲苯、N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种；透明质酸盐和溶解用第一有机溶剂的质量比为1：3～1：10。第一有机溶剂用量过少，产品不容易搅拌，导致反应在非均相条件下影响反应收率；第一有机溶剂用量过多时，增加成本。选取该质量比可在保证反应均相的同时减少成本。

作为本发明的一种实施方式，反应温度为25～60℃，反应时间为4～24h；优选反应温度为35～50℃，反应时间为5～7h。在反应温度为45℃，该温度为优选反应温度，此时得到的乙酰化透明质酸盐质量最优、产率最高。

作为本发明的一种实施方式，第二有机溶剂包括乙醇、甲基叔丁基醚、甲醇、乙醚中的一种或多种，优选乙醇。

作为本发明的一种实施方式，透明质酸盐的分子量为1～2000kDa。本发明所使用的制备方法适合于各种大小分子量的透明质酸盐，适用范围广。

作为本发明的一种实施方式，透明质酸盐包括透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐或铵盐中的1种或至少2种的组合。发明所使用的制备方法适合于各类透明质酸盐，适用范围广。

与现有技术方案相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明将乙酸溶于第二有机溶剂，并加入活化试剂/有机碱进行预活化，再与透明质酸盐进行酯化反应，从而得到乙酰化透明质酸盐，在制备过程中未使用乙酸酐和浓硫酸，所用的乙酸也只是少量，最大限度的降低了生产成本，且制备试剂易于获取，更适合工业化生产，减少废水排放量，减轻了对环境的污染。利用预活化的的乙酸，提高了乙酰化透明质酸盐的产率及乙酰化程度且所得产品品质更好。本发明产率均在95％以上，进一步达到98％以上；乙酰基含量达到24％以上，进一步达到28％以上。

2、本发明将乙酸预活化，增加羧基活性，促进反应效率，缩短反应时间，提高乙酰化程度。选取的活化试剂/有机碱的优点成本低，酯化效率高。

3、本发明所使用的制备方法适合于各类透明质酸盐、各种大小分子量，适用范围广，使用价值大。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

一种乙酰化透明质酸盐的制备方法，实施例中所用的，包括各个不同分子量的透明质酸盐原料均由南京乐韬生物科技有限公司提供。

实施例中所用的设备或其它试剂/材料均可通过商业化途径购买得到。

乙酰化透明质酸盐的产率可用得到的乙酰化透明质酸盐与原料透明质酸盐的质量比进行简单换算。

本发明所述乙酰化透明质酸盐的乙酰基含量通过紫外分光光度法测定。

实施例1

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸钠和DMF按质量比为1：6混合，得到第一混合液；所述透明质酸钠的分子量为1kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸钠按质量比为0.2：1与DMF混合，加入活化试剂DIC/有机碱DMAP进行预活化，所述活化试剂DIC的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，所述有机碱DMAP的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，45℃搅拌反应6h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表1。

实施例2

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸钠和DMF按质量比为1：6混合，得到第一混合液；所述透明质酸钠的分子量为20kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸钠按质量比为0.2：1与DMF混合，加入活化试剂DIC/有机碱DMAP进行预活化，所述活化试剂DIC的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，所述有机碱DMAP的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，45℃搅拌反应6h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表1。

实施例3

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸钠和DMF按质量比为1：6混合，得到第一混合液；所述透明质酸钠的分子量为500kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸钠按质量比为0.2：1与DMF混合，加入活化试剂DIC/有机碱DMAP进行预活化，所述活化试剂DIC的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，所述有机碱DMAP的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，45℃搅拌反应6h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表1。

实施例4

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸钠和DMF按质量比为1：6混合，得到第一混合液；所述透明质酸钠的分子量为2000kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸钠按质量比为0.2：1与DMF混合，加入活化试剂DIC/有机碱DMAP进行预活化，所述活化试剂DIC的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，所述有机碱DMAP的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，45℃搅拌反应6h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表1。

对比例1

对比例参照CN110981991公开的方法，乙酸酐在浓硫酸催化下与透明质酸钠酰化反应，所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表1。

步骤一：将透明质酸钠和乙酸酐按质量比1：13.5混合，在浓硫酸、45℃下进行酰化反应6h；其中，所述透明质酸钠的分子量为500kDa；所述浓硫酸的添加量为透明质酸钠质量的33％；

步骤二：反应结束后得到的反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤三：固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表1

表1实施例1～4和对比例1所得乙酰化透明质酸钠的指标

通过表1可以发现，本发明提供的制备方法，将乙酸预活化再与透明质酸钠进行酯化反应，在制备过程中未使用乙酸酐和硫酸，其产率可高达96％以上，降低了环保压力和节省了物料成本；所用乙酸也只是少量，相对于对比例1中乙酸酐的大量使用，本发明更适合工业化，对环境污染更小，成本更低，同时制备所得的乙酰化透明质酸钠的乙酰基含量均在27％以上，满足乙酰基含量在23％～29％的范围内，因此产品的品质更好。

实施例5

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸钠和DMF按质量比为1：6混合，得到第一混合液；所述透明质酸钠的分子量为20kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸钠按质量比为0.2：1与DMF混合，加入活化试剂EDCI/有机碱TEA进行预活化，所述活化试剂DIC的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，所述有机碱DMAP的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，45℃搅拌反应6h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表2。

实施例6

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸钠和DMF按质量比为1：6混合，得到第一混合液；所述透明质酸钠的分子量为20kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸钠按质量比为0.2：1与DMF混合，加入活化试剂HATU/有机碱DIEA进行预活化，所述活化试剂DIC的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，所述有机碱DMAP的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，45℃搅拌反应6h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表2。

实施例7

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸钠和DMF按质量比为1：6混合，得到第一混合液；所述透明质酸钠的分子量为20kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸钠按质量比为0.2：1与DMF混合，加入活化试剂HBTU/有机碱NMM进行预活化，所述活化试剂DIC的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，所述有机碱DMAP的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，45℃搅拌反应6h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表2。

实施例8

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钠的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸钠和DMF按质量比为1：6混合，得到第一混合液；所述透明质酸钠的分子量为20kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸钠按质量比为0.2：1与DMF混合，加入活化试剂EEDQ/有机碱DMAP进行预活化，所述活化试剂DIC的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，所述有机碱DMAP的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，45℃搅拌反应6h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钠的相关指标详见表2。

表2实施例1与实施例5～8所得乙酰化透明质酸钠的指标

通过表2可以发现，本发明提供的制备方法中，使用的活化试剂DIC、EDCI、HATU、HBTU、EEDQ和有机碱DIEA、TEA、DMAP、NMM配合乙酸的使用，使用活化试剂和有机碱的好处是乙酰化效率高，副反应少；反应时乙酸的羧基被活化试剂预活化先形成一个活性中间体，在有机碱的催化下活性中间体与透明质酸钠中的羟基更容易发生酯化，且副反应更少，最终提高乙酰化透明质酸盐的产率、品质，且其中DIC配合DMAP使用效果最佳，产率最高且所得产品的乙酰基含量最高。

实施例9

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸钾的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将乙酸和透明质酸钾按质量比为0.1：1与DCM混合，加入活化试剂DIC/有机碱DMAP进行预活化，所述活化试剂DIC的添加量与透明质酸钾的质量比为0.1：1，所述有机碱DMAP的添加量与透明质酸钾的质量比为0.1：1，得到第二混合液；

步骤二：将透明质酸钾和DCM按质量体积比为1：3混合，得到第一混合液；所述透明质酸钾的分子量为1kDa；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，60℃搅拌反应4h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钾固体纯品。

所得乙酰化透明质酸钾的相关指标详见表3。

实施例10

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸镁的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸镁和甲苯按质量体积比为1：8混合，得到第一混合液；所述透明质酸镁的分子量为1kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸镁按质量比为0.5：1与甲苯混合，加入活化试剂DIC/有机碱DMAP进行预活化，所述活化试剂DIC的添加量与透明质酸镁的质量比为0.5：1，所述有机碱DMAP的添加量与透明质酸镁的质量比为0.5：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，25℃搅拌反应24h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品分别用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸镁固体纯品。

所得乙酰化透明质酸镁的相关指标详见表3。

实施例11

本实施例中提供一种乙酰化透明质酸锌的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将透明质酸锌和N-甲基吡咯烷酮按质量体积比为1：10混合，得到第一混合液；所述透明质酸锌的分子量为1kDa；

步骤二：将乙酸和透明质酸锌按质量比为0.4：1与N-甲基吡咯烷酮混合，加入活化试剂DIC/有机碱DMAP进行预活化，所述活化试剂DIC的添加量与透明质酸锌的质量比为1.5：1，所述有机碱DMAP的添加量与透明质酸锌的质量比为1.5：1，得到第二混合液；

步骤三：将第二混合液与第一混合液混匀，50℃搅拌反应5h，得到反应液；

步骤四：将步骤三中反应液缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤五：所述固体粗品分别用乙醇纯化，45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸锌固体纯品。

所得乙酰化透明质酸锌的相关指标详见表3。

对比例2

本实施例参照专利CN113045686A中提供一种乙酰化透明质酸盐的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

步骤一：将分子量为1kDa的透明质酸钠和DMF按质量体积比为1：6混合，采用有机碱三乙胺活化透明质酸钠，三乙胺的添加质量与透明质酸钠质量比为0.6：1，得到第一混合液；

步骤二：在冰水浴中向上述混合物中加入乙酰氯，所述乙酸氯和透明质酸钠质量比为0.26：1，45℃搅拌反应6小时；

步骤三：反应后的液体缓慢加入到20倍乙醇中搅拌、抽滤，析出固体粗品；

步骤四：所述固体粗品分别用乙醇打浆2遍，抽滤得固体纯品；

步骤五：固体纯品45℃真空干燥8h得到乙酰化透明质酸钠。

表3实施例1、实施例9～11与对比例2所得乙酰化透明质酸盐的指标

通过表3可以发现，本发明提供的制备方法实施例1、实施例9、实施例10、实施例11与对比例2数据对比可知，本发明产率均在95％以上，乙酰基含量都比对比例2高，且对比例2加乙酰氯时放热严重，投料时需控制低温，不易于工业化生产。

综上所述，本发明提供的制备方法中，适用于各类透明质酸盐，其产率均在95％以上，乙酰基含量更高，适用于工业化生产，使用价值大。