一种丹参注射液批次间质量均一性的评价方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种丹参注射液批次间质量均一性的评价方法，尤其是基于中药成分存在状态与成分分布特征构建的丹参注射液批次间质量均一性的评价方法。

背景技术

中药制剂研发、生产、质控均遵循“质量可控、安全有效”的基本原则，受制于中药制剂本身化学成分复杂性、生产单元变异来源较多，传统指标检测的工艺操作模式依然难以保证产品质量的均一性，进而导致相同处方、不同厂家、甚至不同批次间产品质量不一。

目前中药制剂质量均一性控制方法依靠设计开发、生产控制及物流管理等产品制造的所有环节，贯彻质量源于过程控制的理念，对中药的种子种苗繁育、种植基地优选、药材采收、饮片炮制、制备工艺，参照质量标准中的指标性成分、特征/指纹图谱进行生产过程监控，明确成分的传递规律，并对关键生产环节进行智能化控制，提升生产过程的可控性，从而保障中药制剂质量的均一性。

但是，目前质量均一性评价方法，仅能通过直观的成分含量高低数据去调整生产参数，而不理解为什么相同批次的药材、相同的生产工艺参数难以生产出质量高度均已的制剂，导致引起质量差异性的根本原因无法解读。

丹参注射液具有活血化瘀，通脉养心的功效，以丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛、丹参素钠为代表的酚酸类成分为其主要药效成分，也是生产过程中主要关注的质控指标，目前仅通过成分解离常数定性判断成分存在状态，难以在实际生产中实现成分状态的定量化控制。而根据纳滤传质系数和浓度的相关性拟合的方法仅能计算分子态，而且对于丹参注射液黏度偏高的溶液环境，难以进行纳滤分离数据收集，因此存在明显局限性。

发明内容

本发明提供一种基于“存在状态-成分含量”相关联理念的质量均一性控制方法，根据成分状态与过滤行为的相关性，构建适用于丹参注射液中酚酸类成分存在状态的推算方法。根据酚酸类成分与膜材质的作用规律，选择聚四氟乙烯材质作为超滤膜的分离层，强化与水溶性酚酸类成分的界面排斥效应，从而提升成分存在状态与分离系数之间的变化的敏感度，保障推算结果的准确性。

基于上述背景，提供一种评价丹参注射液质量批次间均一性的方法，将丰富丹参注射液的质控方法，进一步提升中药制剂批次间一致性评价的合理性，有效降低了中药企业生产风险。

因此，本发明提供一种丹参注射液批次间质量均一性的评价方法，所述方法包括：

a.取丹参注射液，采用聚四氟乙烯材质超滤膜，调节跨膜压力差为0.02-0.2MPa，收集相应压力下的膜通量J1，收集相应的超滤液，并计算截留率R1；

b.根据丹参注射液中所述指标性成分的浓度，分别配制指标性成分对照品的混合溶液，调节溶液pH为2.0-3.0，采用聚四氟乙烯材质超滤膜，调节跨膜压力差为0.02-0.2MPa，收集相应压力下的膜通量J2，收集相应的超滤液，并计算所述指标性成分的截留率R2；

c.根据丹参注射液中所述指标性成分的浓度，分别配制所述指标性成分对照品的混合溶液，调节溶液pH为6.0-7.0，采用聚四氟乙烯材质超滤膜，调节跨膜压力差为0.02-0.2MPa，收集相应压力下的膜通量J3，收集相应的超滤液，并计算所述指标性成分的截留率R3；

d.根据公式ln[J/R-J]-ln[DK/δ]＝J/S，计算步骤a-c中，溶液在截留分子量1KDa、3KDa、5KDa、8KDa、10KDa时，所述指标性成分的分离系数S，其中，δ为超滤膜分离层厚度，DK为传质常数；

e.分别拟合步骤a丹参注射液、步骤b-c不同pH对照品的混合溶液中所述指标性成分的分离系数S与截留分子量M的线性方程；

f.分别收集步骤a丹参注射液、步骤b-c不同pH对照品的混合溶液中所述指标性成分的线性方程斜率K；

g.根据不同pH对照品混合溶液所拟合的斜率值(K)，对应的成分状态(Z)的离子态1％(pH2.0)、离子态99％(pH7.0)，以离子态比例为横坐标，斜率K为纵坐标做两点的线性方程，将丹参注射液中丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸的线性方程斜率，分别带入方程即可计算出丹参注射液中所述指标性成分的分子态和离子态的比例；

h.以所述分子态和离子态的比例为加权系数，与丹参注射液中所述指标性成分特征相乘得到均一性评价指标，进而对丹参注射液的批次间质量均一性进行评价。

进一步地，所述超滤膜为截留分子量为1KDa-10KDa的聚四氟乙烯材质超滤膜。

进一步地，所述步骤a、b、c中，调节跨膜压力差为0.02、0.05、0.10、0.15、0.20MPa。

进一步地，所述步骤a、b、c中，所述截留率(％)＝(1-C

进一步地，所述指标性成分为丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素和迷迭香酸。

进一步地，所述分离系数S表征指标性成分接近并透过膜分离层的性能参数。

进一步地，所述步骤h中，所述指标性成分特征是指成分含量、特征图谱、指纹图谱中的一种或多种。

本发明至少具备以下有益效果：

(1)基于成分状态-成分含量双指标协同的模式，提升了丹参注射液批次间质量均一性的评价方法。

(2)根据丹参注射液中酚酸类成分与聚四氟乙烯材质间较强的界面排斥效应，提升成分存在状态与分离系数之间的变化的敏感度，保障推算结果的准确性。

(3)根据丹参注射液中酚酸了成分离子态、分子态，进一步形成多状态-多成分含量相关联的丹参注射液批次间质量均一性的评价方法，丰富了丹参注射液质量控制方法。

与传统的指纹图谱等评价指标相比，丹参注射液批次间相似度高，则指纹图谱相似度一定高，难以评价批次间差异；本发明通过指标性成分分子态和离子态的比例作为加权系数，计算后得到的质量均一性评价指标能够更加全面客观地反映丹参注射液批次间的质量均一性。

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

实施例1：丹参注射液中酚酸类成分存在状态计算

取丹参注射液(批号2021-1201，江苏神龙药业有限公司)，采用截留分子量(MWCO)为1KDa、3KDa、5KDa、8KDa、10KDa的聚四氟乙烯材质超滤膜，调节跨膜压力差为0.02、0.05、0.10、0.15、0.20MPa，收集相应压力下的膜通量，并收集相应的超滤液，采用下述色谱条件检测原液及超滤液中丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸含量。

色谱条件：SCIENTIFIC C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：30℃；检测波长：286nm；流速：1mL/min；进样量：10μL；流动相：甲醇-1％乙酸水溶液梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。

表1洗脱程序

线性关系：配制丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸质量浓度分别为1.520、0.362、0.610、0.850mg/mL的混合对照品溶液，精密吸取混合对照品溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00mL分别置于5mL的量瓶中，50％甲醇水溶液定容至刻度，Agilent 1260高效液相色谱仪检测，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品溶液浓度为横坐标(X)，得线性回归方程，

丹酚酸B Y＝16.16X+10.02，R2＝0.9991，在30.4～608μg/mL范围内线性关系良好；

原儿茶醛Y＝6.91X+12.45，R2＝0.9995，在7.24～144.8μg/mL范围内线性关系良好；

丹参素Y＝4.02X+7.11，R2＝0.9992，在12.2～244μg/mL范围内线性关系良好；

迷迭香酸Y＝10.68X+13.37，R2＝0.9990，在17～340μg/mL范围内线性关系良好。

并根据截留率(％)＝(1-C

表2系列膜孔径的通量数据、截留率

表3指标性成分在不同截留压力和截留分子量下的截留率

根据丹参注射液中丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸的浓度(丹酚酸B0.15mg/ml、原儿茶醛0.22mg/ml、丹参素0.60mg/ml、迷迭香酸0.20mg/ml)，配制丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸对照品的混合溶液，调节溶液pH为2.0，采用截留分子量为1KDa、3KDa、5KDa、8KDa、10KDa的聚四氟乙烯材质超滤膜，调节跨膜压力差为0.02、0.05、0.10、0.15、0.20MPa，收集相应压力下的膜通量，结果见表4，并收集相应的超滤液，并计算成分截留率，数据见表5。

表4相应压力下的膜通量

表5指标性成分在不同截留压力和截留分子量下的截留率

根据丹参注射液中丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸的浓度，配制丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸对照品的混合溶液，调节溶液pH为7.0，采用截留分子量为0.02、0.05、0.10、0.15、0.20MPa的聚四氟乙烯材质超滤膜，调节跨膜压力差为0.02、0.05、0.10、0.15、0.20MPa，收集相应压力下的膜通量，结果见表6，并收集相应的超滤液，并计算成分截留率，结果见表7。

表6相应压力下的膜通量

表7指标性成分在不同截留压力和截留分子量下的截留率

根据膜通量J、分离系数S与截留率R的相关性，根据公式ln[J/R-J]-ln[DK/δ]＝J/S，计算丹参注射液在截留分子量1KDa、3KDa、5KDa、8KDa、10KDa时，丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸的分离系数S，结果见表8。

表8指标性成分的分离系数S

计算混合对照品溶液(pH2.0)在截留分子量1KDa、3KDa、5KDa、8KDa、10KDa时，丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸的分离系数S，结果见表9。

表9指标性成分的分离系数S

计算混合对照品溶液(pH 7.0)在截留分子量1KDa、3KDa、5KDa、8KDa、10KDa时，丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸的分离系数S，结果见表10。

表10指标性成分的分离系数S

分别拟合丹参注射液、不同pH对照品的混合溶液中丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸的分离系数S与截留分子量(M)的线性方程，相关系数均大于0.9，结果见表11。

表11指标性成分的分离系数S与截留分子量(M)的线性方程

分别收集丹参注射液、不同pH对照品的混合溶液中丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸的线性方程斜率，根据两种pH对照品所拟合的斜率值(K)，对应的成分状态(Z)的离子态1％(pH2.0)、离子态99％(pH7.0)做两点的线性方程(以离子态比例为横坐标，斜率K为纵坐标，利用excel两点线性关系计算得到)，并将丹参注射液中的四种成分的斜率带入线性方程，计算成分离子态、分子态比例，结果见表12。

表12

其中，批次2021-1201的丹参注射液中成分离子态比例分别为丹酚酸B48.46％、原儿茶醛35.81％、丹参素5.89％、迷迭香酸28.27％。

实施例2：不同批次间丹参注射液的均一性分析

采用实施例1中相同的技术手段，检测批次2021-1101、2021-1110、2021-1201、2021-1208丹参注射液中成分离子态比例，结果见表13。

表13

以离子态比例为加权系数，与溶液中成分浓度相乘得到均一性评价指标，以批次2021-1101为参照，四种成分的均一性评价指标分别与批次2021-1110的均一性评价指标对比平均，可得均一性至分别为0.912、1.000、0.904、0.961，与指纹图谱评价的相似度结果均大于0.95相比，本发明的方法更能反映批次间的质量差异性。

实施例3：不同批次丹参注射液的调节血脂效果评价

动物：雄性ICR小鼠，SPF级，70只，体质量(20±2)g，由南京中医药大学实验动物中心提供。实验动物合格证号为SCXK(豫)2020-0005，使用许可证书编号为SYXK(苏)2018-0049。饲养环境通风干燥，安静，光线充足，饮水自由摄取。实验过程符合南京中医药大学实验动物伦理要求，审批号为410983211100040072。

药物与试剂：丹参注射液(江苏神龙药业有限公司，批号20211101、20211201)、丹参注射液(神威药业有限公司，批号SW-202210-1)、非诺贝特胶囊(法国利博福尼制药公司，批号：H20200105)。

方法：ICR小鼠70只小鼠，每天按20mL/kg高脂乳剂(含猪油15g，胆固醇6g，胆酸钠2g，丙硫氧嘧啶0.2g，4mL吐温-80，加蒸馏水定容至100mL，参照脂乳剂制备方法)灌胃。造模第21天，随机抽取10只小鼠，取血，检测血清TG、CHO、LDL-C含量，三者均显著升高视为造模成功。将造模成功后的60只小鼠随机分为模型组、非特组、20211101组、20211201组、SW-202210-1组，每组10只。10只未进行造模处理的小鼠，作为空白组。

分组后，模型组与各给药组每天上午继续给予高脂乳剂，模型组每天下午予生理盐水腹腔注射，各给药组每天下午予相应药物进行干预，以70kg成人1倍临床等效剂量给药。丹参注射液人注射剂量为每天20mL，换算得小鼠腹腔注射剂量为每天2.5mL/kg，非诺贝特胶囊人口服剂量为每天200mg，换算得小鼠灌胃剂量为每天26mg/kg。空白组每天上午予生理盐水灌胃，下午予生理盐水腹腔注射。每组均连续干预21天。

小鼠禁食不禁水12h，测量空腹体质量，末次给药2h后，用戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，眼底静脉丛取血，3000r/min离心(离心半径8cm)10min，分离血清备用。应用全自动生化仪检测血清TG、CHO、HDL-C、LDL-C。

统计学方法：采用SPSS Statistics 22.0软件进行统计分析。计量资料以“均值±方差”表示，符合正态分布者，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布者，采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。结果见表14。

表14

注：与空白组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

对比表14中不同厂家、批次丹参注射液，与空白组比较，模型组TG、CHO和LDL-C含量均明显升高(P＜0.05)与模型组比较，各给药组CHO、LDL-C含量均明显降低(P＜0.05)，非特组TG含量明显降低(P＜0.05)；各给药组HDL-C含量与模型组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；20211101组、20211201组、SW-202210-1组TG、CHO、LDL-C含量与模型组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。对比江苏神龙药业有限公司两个批次20211101组、20211201组对血脂水平影响相对接近，且两次批次四种指标成分丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素、迷迭香酸相对一致，影响差异的原因可能与成分存在状态有关，而SW-202210-1的差异可能是成分含量差异和存在状态共同作用的结果。

实施例4：不同厂家生产的丹参注射液的均一性评价

采用实施例1中相同的技术手段，收集3个生产厂家，每个厂家两个批次，分别标记为SL-20221101、SL-20221201、SW-202210-1、SW-202212-1、SH-2023001、SH-2023005丹参注射液中成分离子态比例，结果见表15。

表15

从表13中不同厂家和批次间成分存在状态存在差异，以离子态比例为加权系数，与溶液中成分浓度相乘得到均一性评价指标，以批次SL-20221101为参照，四种成分的均一性评价指标分别与批次SL-20221101的均一性评价指标对比平均，可得均一性至分别为1.000、0.964、0.730、0.845、0.782、0.457。

对以上批次进行指纹图谱评价，结果均大于0.85，难以对批次间均一性进行评价，而本发明基于“存在状态-成分含量”相关联理念的质量均一性控制方法，根据成分状态与过滤行为的相关性，更能反映不同厂家批次间的质量差异性。