一种表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒及其构建方法和应用，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

感染牛呼吸道合胞病毒(BRSV)是小牛呼吸道疾病的主要原因之一，牛呼吸道合胞体病毒属于副黏病毒科，单链、负股、有囊膜的RNA病毒。牛感染BRSV后，有发热、呼吸急迫等特征，BRSV主要引起2～6月龄犊牛的细支气管炎和间质性肺炎。在存在母牛抗体的情况下，仍能感染犊牛，对犊牛产生不可逆的肺部损伤，为养牛业带来严重经济损失。

目前，牛呼吸道合胞体病毒的疫苗主要包括灭活疫苗和减毒活疫苗，疫苗在效果上有争议。其中灭活疫苗有介导疾病加重的风险，而减毒活疫苗在病毒的免疫原性和毒力之间很难找到平衡。尽管如此，国际上BRSV疫苗仍在被使用，包括灭活疫苗Vacores、减毒疫苗Bayovac等，其也能在一定程度上降低发病率，减少经济损失，由于BRSV病毒粒子脆弱，不易培养，所以制作灭活疫苗也存在难度，我国尚未有成功上市的疫苗。

牛疱疹病毒I型(BHV-1)是一种双链DNA病毒，属于疱疹病毒科，总基因组长度约为138kb，其编码的蛋白质中有10种是包膜糖蛋白。其中，糖蛋白E(US8)，是病毒复制的非必需蛋白。

呼吸道合胞病毒(RSV)，是导致世界5岁以下儿童住院的最主要呼吸道病原，每年有66000至234000名婴幼儿死于RSV感染，前尚无应用于临床的成熟RSV疫苗。20世纪60年代研发过一种RSV福尔马林灭活疫苗，但部分患儿注射后病情反而加重。融合蛋白(F)是RSV的病毒表面蛋白，其功能涉及病毒进入细胞的过程，而且拥有高度的序列保守性，故成为疫苗开发的主要目标蛋白。F蛋白有两个构象，分别为融合前(pre-F)和融合后(post-F)构象。相比而言pre-F与post-F构象，pre-F构象更能代表活性RSV，利用融合前构象制成的亚单位疫苗DS-Cav1(引入半胱氨酸辅助形成二硫键、对蛋白空腔进行氨基酸替代填充)有好的耐受性和安全性。DS-Cav1疫苗接种引起了RSV F蛋白特异性抗体和RSV中和活性的显著提升。与之相似的牛呼吸道合胞体病毒的pre-F也显示出了对犊牛的保护效果，基于牛呼吸道合胞体病毒的pre-F的基因工程疫苗的研究，也逐渐变为牛吸道合胞体病毒疫苗研制的研究热点。

利用BRSV G蛋白构建牛疱疹病毒I型重组病毒已有先例，重组病毒免疫动物后能产生BRSV G的抗体。随着对RSV及BRSV研究的深入，pre-F构象相比于G蛋白所存在的抗原表位可能更适合构建亚单位疫苗及基因工程疫苗。但是，目前利用BRSV的F蛋白和牛疱疹病毒I型开展外源免疫原基因的重组病毒构建和应用均未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒及其构建方法和应用，期于解决现存BRSV灭活疫苗和减毒活疫苗在免疫效果和安全性上的不足，并提供pre-F以牛疱疹病毒Ⅰ型为载体的递送方式，降低免疫成本。同时本发明还提供了表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒的构建方法，构建的重组病毒有制备预防Ⅰ型牛疱疹病毒和牛呼吸道合胞体病毒感染药物的潜力。

本发明的技术方案如下：

一种表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组病毒，所述重组病毒为可以表达表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F；

该重组Ⅰ型牛疱疹病毒中插入有优化后的牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象基因(pre-F)。

根据本发明优选的，所述优化是指：先对F蛋白的氨基酸进行了以下突变：V207F、S190F、S290C、Q98C、Q301C；然后以GS连接F1、F2组分；再以BHV-1糖蛋白E信号肽替代原信号肽并将T4folden融合于F蛋白的C端；最后在T4folden的C端末尾融合6×his标签，T4folden及6×his标签以BRSV的密码子偏嗜性进行密码子优化；所述优化后的牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述重组Ⅰ型牛疱疹病毒缺失编码糖蛋白E的US8基因，然后将该缺失基因替换为PCMV-pre-F-BGH表达盒；所述PCMV-pre-F-BGH表达盒由CMV启动子(含增强子)、优化后的牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象基因(pre-F)和牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号组成。

进一步优选的，所述CMV启动子(含增强子)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步优选的，所述牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

上述重组Ⅰ型牛疱疹病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F的构建方法，包括如下步骤：

(1)将基因片段US8上游同源臂-PCMV-pre-F-BGH-US8下游同源臂连接至PCDNA3.1质粒上，得到含有PCMV-pre-F-BGH表达盒的同源修复质粒PCDNA 3.1-HDR；

(2)设计四条sg序列，经退火和两两连接后，转化至大肠杆菌，经培养和提取，得到靶向Ⅰ型牛疱疹基因组US8基因的质粒PX459-1和PX459-2；

(3)将质粒PCDNA 3.1-HDR、PX459-1和PX459-2共转染VERO细胞，然后接种BHV-1荧光毒株，收取感染后的病毒，在MDBK细胞上进行空斑纯化，筛选没有荧光标记的目标，得到重组Ⅰ型牛疱疹病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F。

根据本发明优选的，所述重组Ⅰ型牛疱疹病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F的构建方法，具体步骤如下：

1)以Ⅰ型牛疱疹病毒基因组为模板进行PCR扩增，得到US8上游同源臂(SEQ IDNO.4，含HindⅢ酶切位点)，引物序列如下：

Primer1:5′-AAGCTTGTCGACGAGACGACGGAAG-3′，

Primer2:5′-TACTGCCAAAACCGCATCACGGTGGGTTGCATTGCCAAAT-3′；

2)以Ⅰ型牛疱疹病毒基因组为模板进行PCR扩增，得到US8下游同源臂(SEQ IDNO.5，含EcoRI酶切位点)，引物序列如下：

Primer3:5′-GGATGCGGTGGGCTCTATGGTCCGCTAGGCGCCCCCCCCCCGCGCGCT-3，Primer4:5′-GAATTCCGCCTTGCCTCTCTATATC-3′；

3)以PCDNA 3.1质粒为模板进行PCR扩增，得到CMV启动子(含增强子)，引物序列如下：

Primer5:5′-ATTTGGCAATGCAACCCACCGACATTGATTATTGACTAGTTA-3′，

Primer6:5′-CGGCGCGGTGGGTTGCATGGTGGCAGCTCTGCTTATATAGAC-3′；

4)以PCDNA 3.1质粒为模板进行PCR扩增，得到BGH聚腺苷酸化信号，引物序列如下：

Primer7:5′-CATCATCATCATCACCATTAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC-3′，

Primer8:5′-AGCGCGCGGGGGGGGGGCGCCTAGCGGACCATAGAGCCCACCGCATCC-3′；

5)以PCDNA3.1-pre-F质粒为模板进行PCR扩增，得到pre-f基因，引物序列如下：

Primer9:5′-GTCTATATAAGCAGAGCTGCCACCATGCAACCCACCGCGCCG-3′，

Primer10:5′-GGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTTAATGGTGATGATGATGATG-3′；

6)通过融合PCR依次连接US8上游同源臂、CMV启动子(含增强子)、pre-F、BGH聚腺苷酸化信号和US8下游同源臂，得到融合片段US8上游同源臂-PCMV-pre-F-BGH-US8下游同源臂；再利用酶切、连接的方式将融合片段克隆到PCDNA3.1质粒上，得到含有PCMV-pre-F-BGH表达盒的同源修复质粒PCDNA 3.1-HDR；

7)设计sg序列1～4，然后将sg序列1～4两两组合，分别进行梯度退火，退火后与PX459质粒进行golden gate连接，将连接后的产物转化至大肠杆菌，经培养和提取，得到靶向Ⅰ型牛疱疹基因组US8基因的质粒PX459-1和PX459-2；

所述sg序列如下：

sg 1:5′-CACCGTCGGCAAGCTGGTGTATAC-3′，

sg 2:5′-AAACGTATACACCAGCTTGCCGAC-3′，

sg 3:5′-CACCGAGGTCGTAGGCATCCGCAG-3′，

sg 4:5′-AAACCTGCGGATGCCTACGACCTC-3′；

8)将质粒PCDNA3.1-HDR、PX459-1和PX459-2共转染VERO细胞，培养4～8h后，接种BHV-1荧光毒株，收取感染后的病毒，接种在MDBK细胞上进行空斑纯化5代，筛选没有荧光标记的目标，得到重组Ⅰ型牛疱疹病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F。

上述表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒在制备预防Ⅰ型牛疱疹病毒和牛呼吸道合胞体病毒感染药物中的应用。

上述牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒在制备牛疱疹病毒和牛呼吸道合胞体病毒疫苗中的应用。

有益效果：

1、本发明提供一种表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒，该重组病毒能够稳定并高效表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象。而F蛋白是BRSV的主要抗原糖蛋白之一，其融合前构象pre-F存在免疫原性强的抗原表位，因此该重组病毒以F蛋白的融合前构象pre-F作为免疫原，用于制备牛呼吸道合胞体病毒新型亚单位疫苗和预防牛呼吸道合胞体病毒感染的药物。同时，该重组病毒是以US8基因缺失的BHV-1为载体构建的，因此该重组病毒还可以用于制备Ⅰ型牛疱疹病毒疫苗和预防牛呼吸道合胞体病毒感染的药物。

2、本发明还提供了表达牛呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象的重组Ⅰ型牛疱疹病毒的构建方法，该方法构建了PCMV-pre-F-BGH表达盒，然后通过CRISPR-Cas9方法连接至US8基因缺失的BHV-1，得到重组Ⅰ型牛疱疹病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F。该方法构建方法简单，易行，易于大规模生产。并且US8基因缺失的BHV-1基因组足够大，可以容纳大片段基因的插入，并具有稳定的基因组和构建成熟的重组体的技术，作为病毒载体有着节约免疫成本、安全性较高、鉴别诊断等优势。本发明所制备的重组病毒具有易于增殖、致病性极低、基因漂移风险低、安全性更高的优点，在MDBK细胞中可以高效复制，滴度达到了4.6×10

附图说明

图1为pre-F的氨基酸突变位点示意图(A)及PCDNA3.1-pre-F质粒图谱(B)，图片由SnapGene生成。

图2为用于融合PCR的各组分及融合后的长片段的琼脂糖凝胶电泳图。

图中，泳道1为US8上游同源臂扩增产物，泳道2为CMV启动子(含增强子)，泳道3为pre-f基因扩增产物，泳道4为BGH聚腺苷酸化信号扩增产物，泳道5为US8下游同源臂扩增产物，泳道6为融合后片段。

图3为含有PCMV-pre-F-BGH表达盒的同源修复质粒PCDNA 3.1-HDR，图片由SnapGene生成。

图4为以重组病毒F5代为模板，进行PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；

图中，泳道1-泳道6为不同单克隆样本的扩增产物。

图5为基于his标签的重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F间接免疫荧光鉴定。

图6为基于his标签的重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F的Western Blot鉴定。

图7为BHV-1野生型病毒、缺失US8基因的BHV-1病毒以及重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F产生噬斑的形态学比较。

图8为BHV-1野生型病毒、缺失US8基因的BHV-1病毒以及重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F的病毒生长曲线。

图9为重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F免疫豚鼠后，豚鼠血清的间接免疫荧光鉴定。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实例中涉及到的实验材料：

牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)荧光病毒、缺失US8基因的牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)病毒，均按照中国专利文献CN108690835B一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株及其获取方法中公开的内容构建。BHV-1野生型病毒由内蒙古农业大学兽医学院温永俊实验室分离，本实验室鉴定及保存，该毒株已经在文章“基于CRISPR/Cas9技术构建BHV-1gE缺失株及其免疫生物学特性初步鉴定”中公开。

DH5α感受态菌株：购自Takara公司。

PCDNA 3.1质粒、PX459质粒购自Addgene公司、优化后的PCDNA3.1-pre-F由北京华大基因科技有限公司合成。

VERO细胞系、MDBK细胞和293T细胞系购自ATCC，由本实验室保存。

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)、无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118)购自天根公司；

质粒的构建参考《分子克隆指南》(第四版)。

实施例1、pre-F基因的确定

以牛呼吸道合胞病毒(BRSV)的ATCC51908毒株的基因组(GenBank:AF295543.1)为模板，将其F蛋白进行优化，以表达F蛋白的融合前构象pre-F。

所述优化是指：先对F蛋白(pre-F)的氨基酸进行了以下突变：V207F、S190F、S290C、Q98C、Q301C；然后以GS连接肽连接F1、F2组分；再以BHV-1糖蛋白E信号肽替代原信号肽并将T4folden融合于F蛋白的C端；最后在T4folden的C端末尾融合6×his标签；T4folden及6×his标签以BRSV的密码子偏嗜性进行密码子优化，设计好的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。将该核苷酸序列交往北京华大基因科技有限公司合成并克隆于PCDNA3.1质粒上，命名为PCDNA3.1-pre-F。所述pre-F的氨基酸突变位点如图1A所示，PCDNA3.1-pre-F质粒图谱如图1B所示。

实施例2、重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F的制备

1、BHV-1荧光病毒基因组的提取

将BHV-1荧光病毒以0.1MOI感染MDBK细胞，待细胞出现约80％病变时，收取细胞及病毒于-80℃和4℃反复冻融两次，以5000g离心5分钟收取沉淀。沉淀用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取总DNA，其中包含BHV-1荧光病毒的全基因组。

2、构建含有PCMV-pre-F-BGH表达盒的同源修复质粒PCDNA3.1-HDR

2.1.用于融合PCR各组分的扩增

按照试剂盒

1)以Ⅰ型牛疱疹病毒基因组(GenBank No.NC_001847.1)为模板进行PCR扩增，得到US8上游同源臂(SEQ ID NO.4，含HindⅢ酶切位点)，引物序列如下：

Primer1:5′-AAGCTTGTCGACGAGACGACGGAAG-3′，

Primer2:5′-TACTGCCAAAACCGCATCACGGTGGGTTGCATTGCCAAAT-3′；

2)以Ⅰ型牛疱疹病毒基因组(GenBank No.NC_001847.1)为模板进行PCR扩增，得到US8下游同源臂(SEQ ID NO.5，含EcoRI酶切位点)，引物序列如下：

Primer3:5′-GGATGCGGTGGGCTCTATGGTCCGCTAGGCGCCCCCCCCCCGCGCGCT-3，Primer4:5′-GAATTCCGCCTTGCCTCTCTATATC-3′；

3)以PCDNA 3.1质粒为模板进行PCR扩增，得到CMV启动子(含增强子)(SEQ IDNO.2)，引物序列如下：

Primer5:5′-ATTTGGCAATGCAACCCACCGTGATGCGGTTTTGGCAGTA-3′，

Primer6:5′-CGGCGCGGTGGGTTGCATGGTGGCAGCTCTGCTTATATAGAC-3′；

4)以PCDNA 3.1质粒为模板进行PCR扩增，得到BGH聚腺苷酸化信号(SEQ IDNO.3)，引物序列如下：

Primer7:5′-CATCATCATCATCACCATTAACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCC-3′，

Primer8:5′-AGCGCGCGGGGGGGGGGCGCCTAGCGGACCATAGAGCCCACCGCATCC-3′；

5)以PCDNA3.1-pre-F质粒为模板进行PCR扩增，得到pre-f基因(SEQ ID NO.1)，引物序列如下：

Primer9:5′-GTCTATATAAGCAGAGCTGCCACCATGCAACCCACCGCGCCG-3′，

Primer10:5′-GGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTTAATGGTGATGATGATGATG-3′。

2.2.融合PCR及质粒的构建

将PCR扩增后的US8上游同源臂、US8下游同源臂、CMV启动子(含增强子)、pre-F基因、BGH聚腺苷酸化信号进行琼脂糖凝胶电泳，使用Thermo公司的GeneJET凝胶回收试剂盒进行回收纯化。按照摩尔比1:1:1:1:1混合后作为融合PCR模板，进行融合PCR扩增，并将扩增后产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，使用Thermo公司的GeneJET凝胶回收试剂盒进行回收纯化。

纯化后的US8上游同源臂、US8下游同源臂、CMV启动子(含增强子)、pre-F、BGH牛生长激素聚腺苷酸化信号及融合片段US8上游同源臂-PCMV-pre-F-BGH-US8下游同源臂的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。

由图2可知，各组分的扩增条带大小与预期相符，各组分及融合PCR扩增成功。

将纯化后的融合片段US8上游同源臂-PCMV-pre-F-BGH-US8下游同源臂使用TaKaRa LA

按照说明使用天根公司的无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118)，对一代测序验证后的PMD-19T-HDR菌液进行质粒小提。按照Thermo公司试剂盒FastDigest HindIII及FastDigest EcoRI的说明书对PMD19T-HDR质粒及PCDNA3.1质粒进行酶切，将酶切后的目的条带使用Thermo公司的GeneJET凝胶回收试剂盒分别进行回收纯化。按照T4 DNA Ligase的说明将融合并酶切后的回收产物和酶切后的PCDNA3.1质粒按照摩尔比3：1进行连接，并转化于DH5α感受态中，在培养箱中37℃培养。12小时后挑取单克隆菌落并培养与含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养37℃、200rpm培养12小时，按照1：1的比例混合菌液与80％的甘油，保存于-80℃冰箱，并将新鲜菌液送往北京华大基因科技有限公司进行一代测序，测序连接正确含有PCMV-pre-F-BGH表达盒的同源修复质粒命名为PCDNA 3.1-HDR，其示意图如图3所示。

3、构建CRISPR-Cas9 KO质粒

3.1.设计sg序列

使用CRISPR-Cas9的sg序列在线设计网站

sg 1:5′-CACCGTCGGCAAGCTGGTGTATAC-3′，

sg 2:5′-AAACGTATACACCAGCTTGCCGAC-3′，

sg 3:5′-CACCGAGGTCGTAGGCATCCGCAG-3′，

sg 4:5′-AAACCTGCGGATGCCTACGACCTC-3′；

3.2.质粒PX459-1和PX459-2的构建

将四条sg序列按照sg1和sg2、sg3和sg4分别混合组成两对，然后稀释至100μM，取1μl的sg1、1μl的sg2与8μl超纯水进行温度梯度退火，退火后稀释200倍，得到稀释后的退火产物；sg3和sg4也按照相同的法法进行退火稀释，然后按照如下体系进行goldengate连接。

所述温度梯度退火为：95℃5min，然后每分钟降低5℃直至温度为5℃。

goldengate连接体系为：PX459(100ng/μl)1μL、稀释后的退火产物2μL、10×T4连接酶buffer 2μL、BbsI内切酶1μL、T4连接酶0.5μL、超纯水13.5μL。

goldengate连接程序为：37℃5分钟，16℃5分钟(5个循环)，37℃30分钟，65℃10分钟，4℃保温。

将连接后的产物转化于DH5α感受态中，在培养箱中37℃培养。12小时后挑取单克隆菌落并培养与含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养37℃、200rpm培养12小时，按照1：1的比例混合菌液与80％的甘油，保存于-80℃冰箱，并将新鲜菌液送往北京华大基因科技有限公司进行一代测序，测序连接正确的两对CRISPR-Cas9 KO质粒命名为PX459-1和PX459-2。

4、质粒的共转染及接毒

转染前一天将VERO细胞铺于6孔板中，按照说明使用无内毒素质粒小提中量试剂盒(DP118)，对一代测序验证后的质粒PCDNA3.1-HDR、PX459-1和PX459-2进行无内毒素质粒小提。以摩尔比PCDNA3.1-HDR：PX459-1：PX459-2为2：1：1的比例按照试剂盒

5、重组病毒的挑取及纯化

提前一天将MDBK细胞传于6孔板中，第二天将上一步冻融后的病毒以10倍梯度稀释，接种于MDBK的6孔板中，2小时后覆盖含有0.8％低熔点琼脂糖(Thermo)、1％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中。48小时后将6孔板于荧光显微镜下观察，用10μl枪头挑取没有荧光的病毒噬斑并稀释于20μl的DMEM培养基中收获重组病毒F1代，并接于提前一天铺的6孔板中的MDBK细胞。2小时后覆盖含有0.8％低熔点琼脂糖、1％胎牛血清的DMEM培养液中。48小时后将6孔板于荧光显微镜下观察，用10μl枪头挑取没有荧光的病毒噬斑并稀释于20μlDMEM中收获重组病毒F2代，重复此步骤，直至收获重组病毒F5代。

实施例3、重组病毒的鉴定

1、重组病毒的核酸序列鉴定

提前一天于12孔板上铺MDBK细胞，第二天将重组病毒F5代接于12孔板的MDBK细胞中，96小时后于-80℃和4℃反复冻融两次，以5000g离心5分钟收取沉淀，沉淀用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取总DNA，其中包含重组病毒基因组。

按照

Primer11:5′-GATCGTGGGTGGTATTGTGA-3′，

Primer12:5′-AAGGCCAGGCTTTGGTTTAT-3′；

然后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示。由图4可知，以重组病毒F5代为模板，泳道1、3、4、5、6号样本成功扩增出了BRSV的F蛋白基因，说明pre-F片段成功插入牛疱疹病毒Ⅰ型的基因组中。将扩增的片段送往北京华大基因科技有限公司进行一代测序，测序验证正确的样品所对应的重组病毒命名为rBHV-1-ΔUS8-pre-F。

2、鉴定重组病毒中pre-F的表达情况

2.1.重组病毒pre-F间接免疫荧光的鉴定

将重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F传代20代后，接种至单层MDBK细胞，培养至细胞病变效应(CPE)达到80％时，以PBS缓冲液洗涤、冷4％甲醛固定细胞，以鼠源抗his(碧云天生物，1：100)为一抗，山羊抗鼠IgG-FITC(碧云天生物，1：500)为二抗，进行间接免疫荧光，于荧光显微镜下观察，并以BHV-1野生型病毒感染的MDBK细胞作为阴性对照，鉴定结果如图5所示。

由图5可知，间接免疫荧光的结果显示传代20代后的重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F所感染的细胞有明显的绿色荧光，而感染BHV-1野生型病毒的MDBK细胞没有绿色荧光，说明重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F能够表达pre-F蛋白，并且该蛋白能够在牛疱疹病毒Ⅰ型上稳定遗传。

2.2.重组病毒pre-F的Western Blot鉴定

将重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F传代20代后，接种至单层MDBK细胞，37℃，5％CO

由图6可知，在55kDa-70kDa之间出现有明显的特异性条带，而阴性对照无此特异性反应结果，这说明重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F成功表达了pre-F蛋白，并且该蛋白能够在牛疱疹病毒Ⅰ型上稳定遗传。

实施例4、重组病毒生物学特性分析

1、重组病毒的形态学分析及病毒滴度的测定

将BHV-1野生型病毒、缺失US8基因的BHV-1病毒以及重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F以10倍比例梯度稀释，每个稀释度吸取400μl，分别感染汇合度为80％的MDBK细胞。4小时后加入37℃、含有1％FBS和1％低熔点琼脂糖的DMEM培养基；48小时后以10％甲醛室温固定1小时。用PBS缓冲液冲洗3次，加入8％结晶紫染色30min，洗涤晾干后拍照记录，计算斑块的数量和面积并计算病毒滴度，噬斑形态如图7所示。

由图7可知，重组病毒rBHV-1-ΔUS8-PRE F重与缺失US8基因的BHV-1病毒产生的斑块的大小相似，均小于BHV-1野生型病毒。

2、重组病毒生长动力学分析

以1MOI用BHV-1野生型病毒、缺失US8基因的BHV-1病毒以及重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F分别感染MDBK细胞，在感染后6、12、24、36、48和72小时收获细胞和上清液，每个时间点取3个样品作为重复。使用上述方法计算病毒滴度，并绘制生长曲线，结果如图8所示。

由图8可知，BHV-1野生型病毒、缺失US8基因的BHV-1病毒以及重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F增殖动态趋势相近，缺失US8基因的BHV-1病毒以及重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F病毒滴度略低于野生型病毒。

实施例5、重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F豚鼠免疫

将20只豚鼠随机分为二组，每组10只，第一组免疫重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F，第二组免缺失US8基因的BHV-1病毒，作为对照。

具体方法是：通过肌肉注射分别进行免疫，首次免后的14天进行二免，首次免疫后的28天，对豚鼠进行采血，分离血清用于pre-F的免疫验证。将质粒PCDNA3.1-pre-F转染于24孔板的293T细胞中，48小时后以含有1％Triton和4％多聚甲醛的固定透膜液固定细胞，以收集的血清为一抗，山羊抗豚鼠IgG H&L Alexa

由图9可知，重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F免疫组血清对应的细胞有明显的红色荧光，而缺失US8基因的BHV-1病毒免疫组对应的细胞没有红色荧光。说明重组病毒rBHV-1-ΔUS8-pre-F免疫豚鼠后，豚鼠能够产生pre-F的抗体。