一种复合酵母抽提物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及酵母抽提物、饲料领域，具体涉及一种草药复合酵母抽提物，其制备方法和应用。

背景技术

酵母细胞营养丰富，在中国已有几千年使用历史，其含有丰富的蛋白质、维生素矿、多糖等物质，可以促进机体生长发育消化吸收，并且其中的多糖可以促进有益菌增生，被大量用于食品、饲料、酿酒饮料、药物、美容以及水处理领域中。酵母抽提物则是通过酶的作用，将酵母大分子营养物质如蛋白质、核酸等降解为小分子进行抽提得到富含氨基酸、肽、核酸、维生素、微量元素的天然营养调味物质。现有技术中的酵母抽提物多用于调味，在饲料中的应用偏于营养补充和调味作用。由于酵母酶解过程较长，期间需要多次加入复合酶成分，并分步骤进行酶解。制备工艺时间长，控制因素多。同时，酵母抽提物中的酶或其他活性成分可能在提取、处理或储存的过程中失去活性。因此，需要采取适当的方法来保护和稳定酵母抽提物中的活性成分，例如优化提取条件、添加保护剂或使用低温储存等。不同批次的酵母抽提物可能存在差异，导致其活性或成分的变化。为了确保一致性和可重复性，需要建立标准化的提取和制备方法，并严格控制提取的工艺参数，如温度、时间、酵母菌株的选择等。

酵母自溶过程中添加的复合蛋白酶可以水解蛋白质的肽键、酰胺键、脂键、多糖等，打开细胞壁和蛋白结合键，释放蛋白质、多糖、核酸等营养成分。由于复合酶的种类较多，和酵母作用时间和酶解条件千差万别，往往需要多步骤不同条件下加入不同的酶，获得更好的效果，这给工业生产带来一些不便。例如CN104161259B，CN1481721A，CN101595808A等公开的那样。

中草药作为天然来源植物成分，价格便宜，副作用小，无毒易得，利用中草药复合成分替代激素和抗生素具有潜在的价值。但中药和酵母抽提物的配伍需要兼顾相容和相互作用。现有技术没有中药成分作为酵母酶解促进剂的记载，如果可以实现，这可以简化生产进程。

同时，自然界中的辐射包括紫外线、电磁、核辐射等。环境辐射问题日渐严重，可以在动物行为模式和免疫系统中产生严重影响，包括对细胞内核酸蛋白质结构、抗氧化系统的攻击，对细胞电子的掠夺，进而造成不可逆损伤。包括抗生素耐药、瘟疫等。但是否和家畜生育率以及幼崽存活率相关，目前鲜见报道。我们在家畜饲养过程中，往往关注营养增重或者如何缩短其发情期，提高产仔量和存活率，这的确是提高养殖效益的关键方法。但现有技术中很多饲料添加大量抗生素和催情成分，虽然提高交配率但幼崽生存率明显降低，这和母体激素内环境有关，催情药物的使用容易导致内分泌紊乱，同时母体耗费大量营养物质，如果幼崽存活率不高，会带来负向经济损失。另外除了营养因素还有环境条件、内分泌水平等等因素影响。而激素类饲料的使用也会使得肉制品存在安全隐患。

发明内容

发明人通过酵母抽提工艺优化，加入复合酶和复合中草药成分，发现中药成分不仅具有一些辅助疗效，还产生一些促进酵母酶解的“植物酶”成分，简化了生产流程，另外中药复合酵母抽提物，除了提高家畜配种意愿外，还在辐射抵抗中发挥意想不到的的作用，大大增加了幼崽存活率。这是激素添加剂无法实现的，并且作为饲料添加剂，基本不含有机溶剂，抗生素和激素物质，且具有独特香气，易于增加进食。

具体技术方案包括：

提供一种复合酵母抽提物，其原料经酶解反应制备而成，原料包括酵母、生姜、木犀草、柚子皮，所述酵母选自面包酵母和/或啤酒酵母，使用的酶为复合酶，优选包括木瓜蛋白酶、核酸酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶；其中所述生姜、木犀草和柚子皮优选经过超声震荡或微波处理破壁，超声震荡频率优选20-50KHZ, 功率优选100-150W，超声时间优选1-3h；微波处理2.45 GHz频率以下，加热10-30min。

在一个优选技术方案中，将酵母培养后使用复合酶以及复合草药，通过酶促抽提获得，复合酶以及复合草药包括：木瓜蛋白酶、核酸酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、生姜、木犀草、柚子皮。

进一步，本发明原料组成如下：

酵母1-2份

复合酶1-5份

生姜15-25份

木犀草5-15份

柚子皮5-15份

具体制备方法如下：

1）酵母培养：

将酵母投料入富含培养液的酵母池中，室温下培养得到的扩增的酵母菌液，干燥得酵母菌粉；

培养液可以选自市售产品（内含葡萄糖、氨基酸、胰蛋白胨等），或加入额外的氮源、碳源，或根据所需保健功能加入相应的营养生长因子等，扩增可以为指数扩增，一级种子液继二级种子扩增，可以选择适宜温度，例如20-80℃，优选30-60℃，扩增5-72h，优选12-48h，可以进入发酵罐中保温。其中优选地，估算加水量，使调配后的酵母池中酵母乳浓度为10～15%，并均匀搅拌。随后干燥。

2）将复合草药清洗后加入适量水（复合草药：水=1-10：1-10）进行超声震荡或微波处理，加入复合酶搅拌，获得复合酶草药混合物；

优选，其中生姜：木犀草：柚子皮的重量比为3-6：1-3：1-3；优选地，复合酶包括但不限于木瓜蛋白酶、核酸酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶等；复合酶的重量比为木瓜蛋白酶：核酸酶：纤维素酶：β-葡聚糖酶=1-3：1-3：1-3：1-3；复合酶和复合草药的重量比为1：5-60；酵母菌：复合酶重量比=1-5：1-5；

3）将1）得到的酵母菌粉加入适量水，配制成10-15%浓度的悬浮液，加入盛有上述复合酶草药混合物的酵母罐中，加热至50℃以上，自溶酶解不小于2h；加热至90℃以上，维持30min灭酶；采用筛网过滤分离，滤渣烘干处理；

其中酶解温度优选50-65℃，时间2-24h，优选4-20h，酵母罐中PH优选为4.5-6.5；灭酶温度优选为90-130℃，最优为90-110℃，灭酶时间10-30min优选15-20min；过滤使用60-80目筛。

4）过滤后的清液进行真空浓缩，然后喷雾干燥，得到粉状的复合酵母抽提物；成品包装检验。

其中喷雾干燥进风温度优选180±10℃，出风温度优选180±10℃。

浓缩过程可以如下操作：循环泵、出料泵、及冷凝水泵先进冷却水，进入一定量的料液，开真空水力喷射泵，调节真空度，开启进气阀门，开始浓缩。调节进料量和蒸汽阀门，控制一效温度为85±10℃，二效温度为75±10℃，三效温度为65±10℃。待产品已达到工艺技术要求前，应放出少量料液，用波美度计测量浓度，确认达到18-25Bx（固形物浓度25～45%）时出料，送下一步干燥工序。

对于滤渣的处理，具体而言，将滤渣打入滚筒，滚筒已被预热，根据干燥程度调节滚筒转速和蒸汽用量。滚筒干燥所得的片粉状滤渣自然放冷后装入编织袋中。收集到一定量后再进行烘干、粉碎、检验、包装。

本发明还涉及一种复合酵母抽提物在制备饲料添加剂中的应用，所述添加剂包括上述复合酵母抽提物以及制备过程中烘干的滤渣，滤渣主要包括复合草药经酶解抽提后的固体残渣。

本发明还涉及含复合酵母抽提物的家畜饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：

1）酵母培养：

将酵母投料入富含培养液的酵母池中，室温下培养得到的扩增的酵母菌液，干燥；

2）将复合草药清洗后加入适量水（复合草药：水=1-10：1-10）进行超声震荡或微波处理，加入复合酶搅拌，获得复合酶草药混合物；

3）将1）得到的酵母菌液加入适量水，配制成10-15%浓度的悬浮液，加入盛有上述复合酶草药混合物的酵母罐中，加热至50℃以上，自溶酶解不小于3h；加热至90℃以上，维持30min灭酶；采用筛网过滤分离，滤渣烘干处理；

4）过滤后的清液进行真空浓缩，然后喷雾干燥，得到粉状的复合酵母抽提物；将复合酵母抽提物与步骤3)烘干的滤渣混合，即得。

本发明的家畜饲料添加剂，可应用于制备预防或治疗家畜辐射病的产品，以及提高家畜配种意愿、幼崽生存率的产品。

本发明所述干燥方法也可以使用真空干燥过滤，真空加压为10毫巴-100压力，优选20-80毫巴，更优选40-60毫巴。滤液取上清液。滤渣经出料后滚筒干燥，粉碎机粉碎后另行处理。

在一个优选技术方案中，本发明的酵母抽提物流程简单可控，酶解步骤可以不用多步加酶，开启蒸汽阀门，搅拌加热，控制料液温度，在酶解一定时间后与过滤岗位联系通知放料即可。

其中，本发明复合酶中木瓜蛋白酶、核酸酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶均购自广州伟伯科技有限公司和南宁庞博生物工程有限公司（Q/NPB 31-2014）；酵母培养基购自上海嘉楚生物工程有限公司；

其余化合物购自默克（sigma）公司，检测设备购自梅特勒-托利多仪器有限公司。

面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616，是一株保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心的菌株，公众可通过购买获得。

啤酒酵母菌株于2016年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为 CGMCC No.13500。

啤酒酵母购自华润雪花啤酒（浙江）有限公司（QC/TCS 001-2015）, 样品在无菌生理盐水溶解稀释后进行培养，DNA检测显示与编号CGMCC No.13500的啤酒酵母菌株具有同源性，纯度高于99.9%。

面包酵母菌菌购自西安瑞禧生物科技有限公司，样品在无菌生理盐水溶解稀释后进行培养，DNA检测显示与编号CICC31616菌株基因序列具有同源性，纯度高于99.9%。

鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)购自西安百川。

鼠李糖乳杆菌，菌株LR863，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14410。本发明购买的鼠李糖乳杆菌菌株根据rRN序列分析和API细菌鉴定系统分析结果，和上述编号的保存菌株具有同源性和99.9%的纯度。

本发明所述家畜指的是用于产奶、产肉、繁殖或皮毛的畜牧产业动物，其实例包括但不限于牛、羊、猪、马、驴等。

本发明术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句"包括……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。本发明所述室温指15-25℃，本发明除特殊说明，所有的%均代表重量百分比，除非另有说明，本发明溶液即代表水溶液。

本发明的有益效果：

1）避免使用有机溶剂、避免使用抗生素和激素，原料天然易得，无毒无副作用。

2）改进了酵母抽提工艺，使用特定复合酶+复合草药，草药破壁后产生部分可以协同酶解作用的植物成分，酶解促进，节约复合酶的添加，简化工业化进程可控。

3）补充营养物质同时提高生育率，意外发现抗辐射作用，大幅度减少流产和幼崽死亡率。而简单使用催情药物可以增加交配但流产率高存活率低，反而增加了养殖成本。

附图说明

图1：酵母抽提物的工业生产流程图。

具体实施方式

实施例1：复合酵母抽提物

1）酵母培养获得扩增的酵母菌：

将啤酒酵母接入市售培养液中，室温下培养48h，将处于指数生长期的菌液作为一级种子液，继续接种于二级种子罐，实现指数扩增，得到的酵母液过滤干燥即得酵母菌粉；

2）将复合草药（生姜：木犀草：柚子皮=3：2：2）清洗后加入5倍水进行超声震荡处理，功率150w，破壁处理1h后，加入复合酶（木瓜蛋白酶：核酸酶：纤维素酶：β-葡聚糖酶=2：2：1：1）搅拌，获得复合酶草药混合物；

3）将1）得到的酵母菌粉加入适量水，配制成10-15%浓度的悬浮液，加入盛有上述复合酶草药混合物的酵母罐中，调节PH范围4.5-6.5，加热至60℃，自溶酶解4h；加热至95℃，维持30min灭酶；采用60-80目筛网过滤分离，留下清液，滤渣烘干处理（将滤渣打入滚筒，滚筒已被预热，根据干燥程度调节滚筒转速和蒸汽用量。滚筒干燥所得的片粉状滤渣自然放冷后装入编织袋中）；

4）过滤分离后留下的清液进行真空浓缩，真空浓缩过程可以如下操作：循环泵、出料泵、及冷凝水泵先进冷却水，进入一定量的料液，开真空水力喷射泵，调节真空度，开启进气阀门，开始浓缩。调节进料量和蒸汽阀门，控制一效温度为85±10℃，二效温度为75±10℃，三效温度为65±10℃。待产品已达到工艺技术要求前，应放出少量料液，用波美度计测量浓度，确认达到18-25Bx（固形物浓度25～45%）时出料，送下一步干燥工序。

浓缩后进行喷雾干燥，得到粉状的复合酵母抽提物；成品包装检验。其中喷雾干燥进风温度180±10℃，出风温度180±10℃。。

检测方法：

使用由ChemStation软件运行的HP1100仪器通过高压液相色谱法(HPLC)分析该抽提产物，HPLC的条件如下：

·分离管柱：Asahipak HPLCcolumn GS-320(30℃、7.5mm×300mm)

·流动相：0.1M磷酸钠缓冲液(pH值为7.0)

·流速：1.0mL/min

·检测：紫外线检测器(260nm)

使用聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)，进行电泳检测水解产物的蛋白质特性，将NuPAGEMES迁移缓冲液进行蛋白质迁移， SeeBluePlus2用作分子量标记，使用考马斯蓝R-250进行蛋白质染色，在过滤残渣中检测到高分子蛋白质、葡聚糖和甘露聚糖成分，总氨基酸 35%，多肽 18%;

实施例2：复合酵母抽提物

将酵母换为面包酵母，其余和实施例1相同，HPLC检测总氨基酸 30%，多肽 28%.

实施例3：复合酵母抽提物（不含中药）

不加入中药复合物，其余和实施例1制备步骤相同，由于酶解不充分，期间需要补充加入一次，酶解时间延长到16h，HPLC检测总氨基酸 20%，多肽 18%；远低于实施例1-2；

实施例4：复合酵母抽提物（转换复合酶）

将复合酶替换成碱性蛋白酶，并将酵母培养液进行蒸汽连消破壁，15-50s，将酵母罐PH调节至7.5-8，加入碱性蛋白酶。其余步骤同实施例1。获得的抽提物产品总氨基酸18%，多肽 7%；

通过上述抽提物制备和检测可看出，实施例4虽然对酵母进行了破壁预处理，酶解仍然不充分，说明中药复合物在该碱性蛋白酶对酵母的酶解反应中并没有起到协同酶促的作用，本发明中药和复合酶之间具有互相促进协同的效果，并且具有可选择性；另外，实施例3说明在中草药存在情况下，酶解反应得到补充并节省了时间。

实施例5（家畜饲料添加剂）

将实施例1的复合酵母抽提物与其制备过程中的步骤3）产生的滤渣烘干产物（主要含有中药药渣）进行混合，制备得到含复合酵母抽提物的家畜饲料添加剂。

实施例6（家畜饲料添加剂）

将实施例2的复合酵母抽提物与其制备过程中的步骤3）产生的滤渣烘干产物（主要含有中药药渣）进行混合，并加入鼠李糖杆菌，制备得到家畜饲料添加剂。

实施例7（家畜饲料添加剂，仅中药成分）

将复合草药（生姜：木犀草：柚子皮=3：2：2）清洗后加入5倍水进行超声震荡处理，功率150w，破壁处理1h后，浓缩干燥，制备得到家畜饲料添加剂。

实施例8（家畜饲料添加剂）

将实施例4的复合酵母抽提物与其制备过程中的步骤3）产生的滤渣烘干产物（主要含有中药药渣）进行混合，制备得到家畜饲料添加剂。

对照例1：

采用市售的含激素的家畜催情制剂，添加至普通饲料中。

试验1：

对本发明促进家畜配种和提高受孕幼崽存活率的效果进行验证，选择成年母猪随机分成对照组和实验组，每组20头。统计母猪断奶后15天，发情受孕率，幼崽存活率(30天存活率)，以及增重情况（喂食25day后）。

空白组：空白组为使用市售的酵母抽提物产品（例如购自安琪酵母公司）.

将上述实施例和对照例、空白组的复合酵母抽提物或饲料添加剂添加到常规饲料中进行喂养，每日3次，每次1-2kg。

结果如下表1所示：

表1

根据上述试验可看出，实施例1-2作为复合酵母抽提物对配种率增加特别是幼崽成活率提高具有显著影响。而不含中药酶解或复合酶改变的抽提物实施例3-4无论从配种率还是幼崽存活率上看都显著降低。这可能是酶解过程中产生的氨基酸和小分子肽与中药提取物相互作用具有一定的催情和保胎作用，提高了幼崽存活率。添加了中药药渣的饲料添加剂，对增重的正向影响较大，另外纯中药添加剂由于喂食不耐受，小猪进食意愿不高，体重增加较少，虽然幼崽存活率尚可但受孕率并不高。而酵母抽提物单一市售产品则各项指标最低。添加激素的饲料添加虽然可以提高配种率和受孕率，但幼崽存活率并没有显著提升。

试验2：抗辐射试验

1）选择成年母猪随机分成对照组和各实验组，每组20头，采用频率为2450HMZ的连续微波照射3day，研究饲料添加剂对微波辐射的影响。记录外周血细胞, 即白细胞（WBC）和血小板（PTS）、骨髓DNA(DNA-B)，血中SOD（超氧化物歧化酶）活性试验，结果参见表2。

表2

2）选择成年母猪随机分成对照组和各实验组，每组20头。采用

记录外周血细胞, 即白细胞（WBC）和血小板（PTS）、骨髓DNA(DNA-B)，血中SOD（超氧化物歧化酶）活性试验。参见表3。

表3

结果显示，本发明复合酵母抽提物对辐射后的家畜的血象保护显著提高，依照卫生部对辐射危害有辅助保护功能的评价标准，其对辐射危害具有辅助保护功能。另外在保护辐射危害的同时，发明人发现对孕期母猪因辐射导致的流产具有很好防护作用。相比对照组和空白组饲料添加剂，虽然部分母猪受孕增加，但在辐射试验中，无一例外导致流产，而实施例1-2，特别是实施例5-6组别的母猪流产率可以降低50%以上，实施例4组别流产率也得到降低。说明无论是电磁辐射还是放射物质辐射，低剂量时，本发明饲料添加剂均具有保护作用。其机理可能和提高免疫以及细胞抗氧化有关，也可能与血象保护有关。单独应用中药组或单独应用复合酵母提取物组，相比对照和空白组并无明显优势。

上述具体实施例并不构成对本发明的保护范围的限定，本领域技术人员可以根据上述说明对本发明进行各种变化和应用。