一种毛慈菇伴生菌及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种毛慈菇伴生菌及其培养方法与应用。

背景技术

毛慈菇作为兰科杜鹃兰属植物，作为重要中药材具有重要药用价值。毛慈菇现有的繁殖技术中，块茎繁殖生长周期长、繁殖慢，且投资大、技术要求严格不适合农户发展。种子是最佳的繁殖材料，但种子休眠期长，在自然条件下难以打破体眠，而且种壳坚硬，通透性差。另外，毛慈菇种子十分细小，胚乳发育不充分，导致在自然条件下萌发困难，野生毛慈菇自然萌发率不到10％，种苗更新缓慢，加之人工盗采情况严重，野外资源难以满足人工种植的种源需求。

毛慈菇直播栽培时需要伴生菌以促进种子萌发，现在市面上虽有很多品种的毛慈菇菌种，但是不一定都能完全出苗。因此，亟需找到解决利用人工种子繁育毛慈菇萌发困难的有效技术方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种毛慈菇伴生菌，可明显促进毛慈菇种子的萌发，促进毛慈菇幼苗的成活和生长。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种毛慈菇伴生菌，包括如下步骤：所述毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)于2022年07月05日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20221028。

本发明还提供了一种所述毛慈菇伴生菌的培养方法，包括如下步骤：将在毛慈菇根系处获取的龙胆消毒、研磨后涂抹于初代培养基于黑暗条件下培养10～12天后，挑取红色菌落接种至马铃薯琼脂培养基置于黑暗环境下培养至无杂菌长出为止。

优选地，所述初代培养基的配方为：去皮马铃薯180～220g、葡萄糖18～24g、维生素8～12mg、磷酸二氢钾0.4～0.8g、硫酸镁0.2～0.34g、琼脂14～16g。

优选地，所述培养温度为18～25℃。

本发明还提供了一种促进毛慈菇种子萌发的方法，将所述伴生菌或所述培养方法获得的伴生菌接种至扩大培养基中培养，将所得菌种按照每平方0.3～0.8kg放入苗床中，在上述苗床上播撒毛慈菇种子进行萌发。

优选地，所述扩大培养基包括如下重量份的原料：杂木屑75％～85％、麸皮16％～20％、石膏0.8％～1.2％、蔗糖0.8％～1.2％、维生素B

更优选地，所述扩大培养基的含水量为55～65％。

优选地，所述伴生菌按照质量比1:10～1:15接种至扩大培养基中。

优选地，所述培养的条件为：18℃～25℃温度下培养22～26天。

优选地，所述种子的播种量为每平方1～1.5g。

本发明还提供了一种所述毛慈菇伴生菌在促进毛慈菇幼苗成活和/或生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明首次从野外分离获得对毛慈菇萌发具有促生作用的Ilyonectria sp.DJL-1菌株，优化了菌株的分离、纯化、扩大培养和播种系列技术方案。本发明通过在不同产地毛慈菇种子萌发实验中验证了所述菌种对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇种子的萌发量、萌发速度、萌发整齐程度；所述菌种对毛慈菇幼苗成活率、总根长、株高、叶面积、叶绿素SPAD值均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇幼苗的成活和生长，进一步验证了所述菌种对于促进毛慈菇种子萌发的可行性和先进性，找到解决人工种子繁育毛慈菇萌发困难的有效技术方案。

附图说明

图1为野外毛慈菇龙胆采集；

图2为本发明毛慈菇伴生菌菌种纯化培养图；

图3为贵州百里杜鹃山林区毛慈菇种子萌发后180天幼苗；

图4为四川峨嵋山林区毛慈菇种子萌发幼苗。

生物保藏信息

毛慈菇伴生菌，拉丁文为：Ilyonectria sp.DJL-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20221028，保藏日期为2022年07月05日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

具体实施方式

本发明提供了一种毛慈菇伴生菌，包括如下步骤：所述毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)于2022年07月05日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20221028。

本发明还提供了一种毛慈菇伴生菌的培养方法，包括如下步骤：将在毛慈菇根系处获取的龙胆消毒、研磨后涂抹于初代培养基于黑暗条件下培养10～12天后，挑取红色菌落接种至马铃薯琼脂培养基置于黑暗环境下培养至无杂菌长出为止，所述毛慈菇伴生菌包括上述毛慈菇伴生菌(Ilyonectriasp.DJL-1)。在本发明的具体实施例中，对所述龙胆消毒方法为：用75％酒精消毒15～30s。在本发明的具体实施例中，所述研磨为：将消毒后的龙胆按照质量比1：5无菌水在无菌研磨中研磨。在本发明的具体实施例中，将所述龙胆研磨液用无菌三角玻璃棒均匀涂抹于初代培养基。在本发明中，所述马铃薯琼脂培养基购自生工生物工程(上海)股份有限公司。在本发明中，将红色菌落接种至马铃薯琼脂培养基置于黑暗环境下培养后可得到纯化后的菌种。

本发明中，所述初代培养基的配方优选为：去皮马铃薯180～220g、葡萄糖18～24g、维生素8～12mg、磷酸二氢钾0.4～0.8g、硫酸镁0.2～0.34g、琼脂14～16g。更优选的初代培养基的配方为，去皮马铃薯190～200g、葡萄糖20～22g、维生素9～10mg、磷酸二氢钾0.5～0.6g、硫酸镁0.25～0.3g、琼脂14.5～15g。本发明的初代培养基可有效分离得到毛慈菇伴生菌。

本发明中，所述培养温度优选为18～25℃，更优选为20～22℃。

本发明还提供了一种促进毛慈菇种子萌发的方法，将所述伴生菌或所述培养方法获得的伴生菌接种至扩大培养基中培养，将所得的菌种优选地按照每平方0.3～0.8kg放入苗床中，在上述苗床上播撒毛慈菇种子进行萌发。更优选地为0.4～0.6kg。在本发明的具体实施例中，所述培养基用塑料袋封装在温度120～130℃下高压灭菌20～30分钟。在本发明的具体实施例中，将扩大培养后的菌种均匀排列在苗床中上后覆盖粒径8～12cm木屑、木屑厚度1～2cm，用腐殖土完全覆盖木屑。在本发明的具体实施例中，所述苗床选择排水条件良好的林下土地，郁闭度50％～80％，将土地表层杂草去除，土壤破碎至块茎5～10cm，整理成宽1～1.2m、高10～15cm的苗床。在本发明中，苗床上覆盖木屑和腐殖土可以保证苗床的透气性，有利于培养过程中温度和湿度维持在一定范围内。

本发明中，所述扩大培养基优选的包括如下重量份的原料为：杂木屑75％～85％、麸皮16％～20％、石膏0.8％～1.2％、蔗糖0.8％～1.2％、维生素B

本发明中，所述扩大培养基优选的含水量为55～65％，更优选为58～60％。

本发明中，所述伴生菌优选地按照质量比1:10～1:15接种至扩大培养基中，更优选的质量比1:12～1:14。

本发明中，所述培养条件优选为18℃～25℃温度下培养22～26天，更优选为20℃～22℃温度下培养23～25天。

本发明的具体实施例中，所述种子的播种量优选为每平方1～1.5g，更优选为每平方1.2～1.4g。在本发明的具体实施例中，将种子均匀铺洒至苗床后再用腐殖土覆盖种子，厚度0.2～0.5cm，培育30～60天后种子萌发，培育120～150天获得幼苗，播种后10个月幼苗即可移至大田栽培。

本发明还提供了一种所述毛慈菇伴生菌在促进毛慈菇幼苗成活和/或生长中的应用。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)分离、纯化步骤

第一步，原材料采集，寻找野外自然生长毛慈菇，在其根系处用竹刀取下龙胆不少于10g，见图1；

第二步，初代培养基配置，去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、维生素10mg、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁0.3g、琼脂15g、pH值6；

第三步，初代微生物分离，将第一步获得的龙胆用75％酒精消毒30s，然后按照质量比1：5加入无菌水，在无菌研磨中研磨，将研磨液用无菌三角玻璃棒均匀涂抹在第二步配置培养基中培养，并放置在23℃黑暗条件下培养10～12天；

第四步，菌种纯化，挑取第三步培养平板中红色菌落中少量菌丝体接种到马铃薯琼脂培养基的斜面上，置于23℃黑暗环境下培养，直至无其它杂菌长出为止即可获得毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)，见图2。

实施例2

一种促进毛慈菇种子萌发的方法，包括如下步骤：将实施例1纯化的菌种接种到扩大培养基质中培养，按质量组分培养基质组成杂木屑80％、麸皮18％、石膏1.0％、蔗糖1.0％、维生素B

萌发苗床准备：选择排水条件良好的林下土地，郁闭度75％，将土地表层杂草去除，土壤破碎至块茎5～10cm，整理成宽1.2m、高12cm的苗床；

萌发基质配置：将第五步培养好的菌棒按照每平方0.5kg均匀排列在苗床中，菌棒上覆盖粒径10cm木屑、木屑厚度1.5cm，用腐殖土完全覆盖木屑；

播种与管护：选择成熟毛慈菇，将种子取出，在第七步基础上，按每平方1.25g种子量进行播种，种子均匀铺洒后再用腐殖土覆盖种子，厚度0.43cm，培育30～60天后种子萌发，培育120～150天获得幼苗，播种后10个月幼苗即可移至大田栽培。

实施例3

一种促进毛慈菇种子萌发的方法，包括如下步骤：将实施例1纯化的菌种接种到扩大培养基质中培养，按质量组分培养基质组成杂木屑75％、麸皮16％、石膏0.8％、蔗糖0.8％、维生素B

萌发苗床准备：选择排水条件良好的林下土地，郁闭度50％，将土地表层杂草去除，土壤破碎至块茎5～10cm，整理成宽1m、高10cm的苗床；

萌发基质配置：将第五步培养好的菌棒按照每平方0.3kg均匀排列在苗床中，菌棒上覆盖粒径8～12cm木屑、木屑厚度1～2cm，用腐殖土完全覆盖木屑；

播种与管护：选择成熟毛慈菇，将种子取出，在第七步基础上，按每平方1g种子量进行播种，种子均匀铺洒后再用腐殖土覆盖种子，厚度0.2～0.5cm，培育30～60天后种子萌发，培育120～150天获得幼苗，播种后10个月幼苗即可移至大田栽培。

实施例4

一种促进毛慈菇种子萌发的方法，包括如下步骤：将实施例1纯化的菌种接种到扩大培养基质中培养，按质量组分培养基质组成杂木屑85％、麸皮20％、石膏1.2％、蔗糖1.2％、维生素B

萌发苗床准备：选择排水条件良好的林下土地，郁闭度80％，将土地表层杂草去除，土壤破碎至块茎5～10cm，整理成宽1.2m、高15cm的苗床；

萌发基质配置：将第五步培养好的菌棒按照每平方0.5kg均匀排列在苗床中，菌棒上覆盖粒径8～12cm木屑、木屑厚度1～2cm，用腐殖土完全覆盖木屑；

播种与管护：选择成熟毛慈菇，将种子取出，在第七步基础上，按每平方1.5g种子量进行播种，种子均匀铺洒后再用腐殖土覆盖种子，厚度0.2-0.5cm，培育30-60天后种子萌发，培育120-150天获得幼苗，播种后10个月幼苗即可移至大田栽培。

试验例1

为了进一步验证本发明技术方案中微生物分离方法合理性，开展对照实验。选择贵州百里杜鹃林区成熟毛慈菇种子为实验对象，在贵州百里杜鹃康合堂中药种植有限责任公司育苗基地开展实验。分别设置实验组7组，各组重复3次，每个重复播种种子1600粒。1、对照组：按照实施例2中准备好苗床直接播种，不进行后续步骤，不添加毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)；2、方法组：采用实施例2中方法逐步严格执行操作；3、对比组(一)：按照实施例1的方法，将初代培养基条件调整为去皮马铃薯160g、葡萄糖18g、维生素12mg、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁0.1g、琼脂14g、pH值5.8，其它条件不变；对比组(二)：按照实施例1的方法，将初代培养基条件调整为去皮马铃薯180g、葡萄糖24g、维生素7mg、磷酸二氢钾0.4g、硫酸镁0.17g、琼脂16g、pH值6.2，其它条件不变；对比组(三)：按照实施例1的方法，将初代培养基条件调整为去皮马铃薯220g、葡萄糖24g、维生素12mg、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.1g、琼脂14g、pH值6.5，其它条件不变；对比组(四)：按照实施例1的方法，将初代培养基条件调整为去皮马铃薯220g、葡萄糖24g、维生素12mg、磷酸二氢钾0.4g、硫酸镁0.1g、琼脂14g、pH值6.5，其它条件不变；对比组(五)：按照实施例1的方法，将初代微生物分离培养温度设置为16℃，其它条件不变。各组其它管护条件一致，在各组处理后第10天开始，每5天统计一次发芽情况，种子产生圆球茎视为萌发，统计直至无种子萌发为止。测定种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数等萌发指标，测定方法参考(龚记熠等.观赏辣椒种子萌发特征研究[J].种子,2011,30(06):93-95)结果如下：

表1不同微生物分离条件对毛慈菇种子萌发的影响

通过表1中的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组和各个对比组，明显促进了毛慈菇种子的萌发量、萌发速度萌发整齐程度，进一步证明本发明技术方案中微生物分离方法的合理性。图3为本发明萌发方式获得的贵州百里杜鹃山林区毛慈菇种子萌发后180天幼苗。

试验例2

为了进一步验证本发明技术方案中微生物菌种纯化方法合理性，开展对照实验。选择贵州百里杜鹃林区成熟毛慈菇种子为实验对象，在贵州百里杜鹃康合堂中药种植有限责任公司育苗基地开展实验。分别设置实验组8组，各组重复3次，每个重复播种种子2100粒。1、对照组：按照实施例3中准备好苗床直接播种，不进行后续步骤，不添加毛慈菇伴生菌(Ilyonectriasp.DJL-1)；2、方法组：采用实施例1和实施例3逐步严格执行操作；3、对比组(一)：按照实施例1的方法，将初代培养条件中马铃薯培养基调整为牛肉膏蛋白胨培养基，其它条件不变；对比组(二)：按照实施例1的方法，将初代培养条件中马铃薯培养基调整为高氏1号培养基，其它条件不变；对比组(三)：按照实施例1的方法，将初代培养条件中马铃薯培养基调整为马丁氏培养基，其它条件不变；对比组(四)：按照实施例1的方法，将初代培养条件中马铃薯培养基调整为察氏培养基培养基，其它条件不变；对比组(五)：按照实施例1的方法，将初代培养条件中培养温度设置为16℃，其它条件不变；对比组(六)：按照实施例1的方法，将将初代培养条件中培养温度设置为26℃，其它条件不变。各组其它管护条件一致，在各组处理后第10天开始，每5天统计一次发芽情况，种子产生圆球茎视为萌发，统计直至无种子萌发为止。测定种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数等萌发指标，结果如下：

表2不同微生物纯化方法对毛慈菇种子萌发的影响

通过表2中的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组和各个对比组，明显促进了毛慈菇种子的萌发量、萌发速度萌发整齐程度，进一步证明本发明技术方案中微生物菌种纯化方法的合理性。

试验例3

为了进一步验证本发明技术方案中微生物菌种扩大培养方法合理性，开展对照实验。选择贵州百里杜鹃林区成熟毛慈菇种子为实验对象，在贵州百里杜鹃康合堂中药种植有限责任公司育苗基地开展实验。分别设置实验组8组，各组重复3次，每个重复播种种子1500粒。1、对照组：按照实施例4中准备好苗床直接播种，不进行后续步骤，不添加毛慈菇伴生菌(Ilyonectriasp.DJL-1)；2、方法组：采用实施例1和实施例4逐步严格执行操作；3、对比组(一)：按照实施例1，将菌种扩大培养条件调整为培养基质组成杂木屑50％、麸皮10％、石膏0.1％、蔗糖0.1％、维生素B

表3不同微生物菌种扩大培养方法对毛慈菇种子萌发的影响

通过表3的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组和各个对比组，明显促进了毛慈菇种子的萌发量、萌发速度萌发整齐程度，进一步证明本发明技术方案中微生物菌种扩大培养方法的合理性。

试验例4

为了进一步验证本发明技术方案中播种方法合理性，开展对照实验。选择贵州百里杜鹃林区成熟毛慈菇种子为实验对象，在贵州百里杜鹃康合堂中药种植有限责任公司育苗基地开展实验。分别设置实验组5组，各组重复3次，每个重复播种种子1200粒。1、对照组：按照实施例4中准备好苗床直接播种，不进行后续步骤，不添加毛慈菇伴生菌(Ilyonectriasp.DJL-1)；2、方法组：采用实施例1和实施例4逐步严格执行操作；3、对比组(一)：按照实施例4，将萌发苗床准备条件调整为郁闭度45％，土壤破碎至块茎5cm，整理成宽1.5m、高8cm的苗床，其它条件不变；对比组(二)：按照实施例4，将萌发基质条件调整为培养好的菌棒按照每平方0.4kg均匀排列在苗床中，菌棒上覆盖粒径15cm木屑、木屑厚度3cm，其它条件不变；对比组(三)：按照实施例4，将播种与管护条件调整为按每平方1.8g种子量进行播种，种子均匀铺洒后再用腐殖土覆盖种子，厚度0.1cm，其它条件不变。各组其它管护条件一致，在各组处理后第10天开始，每5天统计一次发芽情况，种子产生圆球茎视为萌发，统计直至无种子萌发为止。测定种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数等萌发指标，结果如下：

表4不同播种方法对毛慈菇种子萌发的影响

通过表4的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组和各个对比组，明显促进了毛慈菇种子的萌发量、萌发速度萌发整齐程度，进一步证明本发明技术方案中播种方法的合理性。

试验例5

选择贵州百里杜鹃林区成熟毛慈菇种子为实验对象，在贵州百里杜鹃康合堂中药种植有限责任公司育苗基地开展实验。分别设置实验组4组，各组重复3次，每个重复播种种子1200粒。1、对照组：按照实施例4中准备好苗床直接播种，不进行后续步骤，不添加毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)；2、方法组：采用实施例1和实施例4逐步严格执行操作；3、无菌组：将实施例1中获得的龙胆用无菌水代替，在后续步骤中不添加分离的微生物；4、培养基组：选择常用MS培养基进行种子萌发，在人工培养箱中按照野外条件设置光照强度1000LX、温度(日间24℃、夜间12℃)和湿度(80％)。各组其它管护条件一致，在各组处理后第10天开始，每5天统计一次发芽情况，种子产生圆球茎视为萌发，统计直至无种子萌发为止。测定种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数等萌发指标；各组种子萌发结束后第40天测定幼苗生根长、株高、叶面积和叶绿素SPAD值4个生长指标。以下实验中涉及上述指标均采用相同方法。结果如下：

表5不同处理对贵州百里杜鹃林区毛慈菇种子萌发的影响

在相同的环境下，萌发率高，表示在此环境中有生活力的种子多，播种后发芽数相对较多；发芽势是种子在达到发芽峰值时的发芽数目与总的播种种子数目比值，种子发芽势越高表明种子萌发越整齐；平均发芽天数体现出品种整体发芽的快慢程度，作为评价品种好坏的一项指标，在农业生产中根据平均发芽天数长短来确定播种时间；发芽指数综合反映了种子萌发的各项指标，体现出萌发的快慢和整齐程度，发芽指数越高，表明种子萌发越快、越整齐。通过表5中的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇种子的萌发。

表6不同处理对贵州百里杜鹃林区毛慈菇幼苗的影响

通过表6中的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇幼苗成活率、总根长、株高、叶面积、叶绿素SPAD值均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇幼苗的成活和生长。

试验例6

选择四川峨嵋山林区成熟毛慈菇种子为实验对象，在贵州百里杜鹃康合堂中药种植有限责任公司育苗基地开展实验。分别设置实验组4组，各组重复3次，每个重复播种种子1800粒。1、对照组：按照实施例4中准备好苗床直接播种，不添加毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)；2、方法组：采用实施例1和4逐步严格执行操作；3、无菌组：按照实施例1和4，用无菌水代替第一步获取的龙胆从第二步开始执行，在后续步骤中不添加分离的微生物；4、培养基组选择常用MS培养基进行种子萌发，在人工培养箱中按照野外条件1500LX、温度(日间22℃、夜间15℃)和湿度(70％)。各组其它管护条件一致，在各组处理后第10天开始，每5天统计一次发芽情况，种子产生圆球茎视为萌发，统计直至无种子萌发为止。测定种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数等萌发指标；各组种子萌发结束后第40天测定幼苗生根长、株高、叶面积和叶绿素SPAD值4个生长指标。结果如下：

表7不同处理对四川峨嵋山林区毛慈菇种子萌发的影响

通过实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇种子的萌发量、萌发速度萌发整齐程度。图4为四川峨眉山林区毛慈菇种子萌发幼苗。

表8不同处理对四川峨嵋山林区毛慈菇幼苗的影响

通过表8中的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇幼苗成活率、总根长、株高、叶面积、叶绿素SPAD值均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇幼苗的成活和生长。

试验例7

选择云南昭通林区成熟毛慈菇种子为实验对象，在贵州百里杜鹃康合堂中药种植有限责任公司育苗基地开展实验。分别设置实验组4组，各组重复3次，每个重复播种种子1700粒。1、对照组：按照实施例2中准备好苗床直接播种，不添加毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)；2、方法组：采用实施例1和2逐步严格执行操作；3、无菌组：用无菌水代替第一步获取的龙胆从第二步开始执行，在后续步骤中不添加分离的微生物；4、培养基组：选择常用MS培养基进行种子萌发，1200LX、温度(日间20℃、夜间12℃)和湿度(70％)。各组其它管护条件一致，在各组处理后第10天开始，每5天统计一次发芽情况，种子产生圆球茎视为萌发，统计直至无种子萌发为止。测定种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数等萌发指标；各组种子萌发结束后第40天测定幼苗生根长、株高、叶面积和叶绿素SPAD值4个生长指标。结果如下：

表9不同处理对云南昭通林区毛慈菇种子萌发的影响

通过表9的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇种子的萌发量、萌发速度萌发整齐程度。

表10不同处理对云南昭通林区毛慈菇幼苗的影响

通过表10的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇幼苗成活率、总根长、株高、叶面积、叶绿素SPAD值均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇幼苗的成活和生长。

试验例8

选择贵州遵义大娄山林区成熟毛慈菇种子为实验对象，在贵州百里杜鹃康合堂中药种植有限责任公司育苗基地开展实验。分别设置实验组4组，各组重复3次，每个重复播种种子1100粒。1、对照组：按照实施例3中准备好苗床直接播种，不添加毛慈菇伴生菌(Ilyonectria sp.DJL-1)；2、方法组：采用实施例1和3逐步严格执行操作；3、无菌组：用无菌水代替龙胆从第二步开始执行，在后续步骤中不添加分离的微生物；4、培养基组：选择常用MS培养基进行种子萌发，在人工培养箱中按照野外条件1500LX、温度(日间24℃、夜间10℃)和湿度(80％)。各组其它管护条件一致，在各组处理后第10天开始，每5天统计一次发芽情况，种子产生圆球茎视为萌发，统计直至无种子萌发为止。测定种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数等萌发指标；各组种子萌发结束后第40天测定幼苗生根长、株高、叶面积和叶绿素SPAD值4个生长指标。结果如下：

表11不同处理对贵州遵义大娄山林区毛慈菇种子萌发的影响

通过表11的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇种子萌发率、发芽势、平均发芽天数、发芽指数均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇种子的萌发量、萌发速度萌发整齐程度。

表12不同处理对贵州遵义大娄山林区毛慈菇幼苗的影响

通过表12的实验数据分析发现，试验中采用本发明方案的方法组对毛慈菇幼苗成活率、总根长、株高、叶面积、叶绿素SPAD值均要显著优于对照组、无菌组和培养基组，明显促进了毛慈菇幼苗的成活和生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。