肾脏的局部区域灌注

相关申请的交叉引用

本申请要求2022年2月20日提交的美国临时专利申请No.63/312,029、2022年2月2日提交的美国临时专利申请No.63/305,960和2021年2月22日提交的美国临时专利申请No.63/151,933的优先权利益，以上各案的公开内容特此通过全文引用并入本文中。

技术领域

本发明涉及肾脏疾病的治疗，并且明确地说，涉及将治疗剂局部递送到患者的肾脏。

背景技术

基因疗法和细胞疗法技术在治疗各种肾脏疾患(诸如慢性肾病)中由于可唯一地定制并且有效解决各种肾脏疾患的根本致病机制而引起较大关注。尽管如此，仍存在与递送相关的问题，包括载体效率、剂量、特异性和安全性。因此，需要进一步研究，以找到实现适于治疗各种肾脏疾患的药物的较高靶向性、均匀递送的方式，所述方式也是有效的，耐受性良好并且是微创的。

发明内容

本发明的一个目标是提供以微创方式在患者的一个或两个肾脏中灌注药物的方法。

本发明的一个目标是提供用于使灌注液(所述灌注液可能含有血液或药物中的一者或多者)循环通过患者的一个或两个肾脏以使得所述灌注液与所述患者的全身循环隔离的方法。

本发明的一个目标是提供医药-基因疗法的局部区域递送。

本发明的一个目标是减少递送给患者以治疗肾脏疾患的药物的总体剂量。

本发明的一个目标是降低施用适于治疗肾脏疾患的药物的风险和/或不良免疫反应。

本发明的一个目标是允许将医药-基因疗法药物再给予和/或给予患者，所述患者具有例如针对基因疗法载体的中和抗体，否则所述患者将不适合作为接受此类药物的候选者。

本发明的一个目标是使灌注液循环通过肾脏并将肾循环与所述患者的全身循环隔离，以便允许将可能有肾毒性的药物引入全身循环中，同时防止或减少所述药物暴露于肾脏。

本发明的一个目标是治疗肾脏疾患，诸如常染色体显性多囊肾病和肾消耗病。

本发明的一个目标是提供药物基因疗法的局部区域递送以治疗基因突变，诸如PKD2和NPHP1基因的突变。

以上目标和其他目标是通过本发明满足，在某些实施方案中，本发明涉及一种在患者的一个或两个肾脏中灌注药物的方法。在一个方面中，一种方法包括：将灌注导管定位在所述肾脏的肾动脉中；将回收导管定位在所述肾脏的肾静脉中，使得所述灌注导管和所述回收导管与膜式氧合装置一起形成穿过所述肾脏的闭合灌注回路；以及使灌注液流过所述闭合回路。在一些实施方案中，所述闭合回路将穿过所述肾脏的灌注与所述患者的全身循环隔离。

在一些实施方案中，所述方法还包括：将回收球囊导管定位在所述患者的膀胱中以在所述灌注期间测量尿液排泄。

在一些实施方案中，所述方法还包括：将额外的回收导管定位在所述患者的两条输尿管中的每一者中以有差别地测量所述患者的两个肾脏的排泄。

在一些实施方案中，将所述灌注导管定位在所述肾动脉中包括经由股动脉来定位所述灌注导管。

在一些实施方案中，将所述回收导管定位在所述肾静脉中包括经由股静脉来定位所述灌注导管。

在一些实施方案中，使所述灌注液流过所述闭合回路包括：使所述灌注液穿过所述膜式氧合装置，之后经由所述灌注导管进入所述肾动脉。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述闭合回路添加额外的灌注液或用约5％至约50％v/v的盐水溶液对所述灌注液进行稀释以将膀胱排泄量考虑在内。

在一些实施方案中，所述闭合回路将所述灌注液的流速维持为每肾脏约500mL/min/1.73m

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述回收导管处施加负压，使得所述负压在约-100mmHg至0mmHg的范围内。

在一些实施方案中，所述灌注导管和所述回收导管中的一者或多者是经皮引入。

在一些实施方案中，所述灌注液包括自体血液、来自供体的相配血液或其组合。

在一些实施方案中，血液组分是根据一个或多个参数进行选择的，使得所述一个或多个参数包括存在或不存在所选抗体。

在一些实施方案中，所述灌注维持了约15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或在其间限定的任何范围内的持续时间。

在一些实施方案中，所述灌注液包括治疗性多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述治疗性多核苷酸序列存在于一个或多个病毒载体中。在一些实施方案中，所述一个或多个病毒载体是选自由以下组成的组：腺相关病毒、腺病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、牛乳头状瘤病毒、慢病毒载体、牛痘病毒、多瘤病毒、仙台病毒、正粘病毒、副粘病毒、乳多泡病毒、微小RNA病毒、痘病毒、α病毒、其变异体及其组合。在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)。在一些实施方案中，所述AAV是以下一种或多种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、其变异体及其组合。在一些实施方案中，所述治疗性多核苷酸序列包含启动子。

在一些实施方案中，循环通过所述闭合回路的血液中小于约20％v/v、小于约15％v/v、小于约10％v/v、小于约5％v/v、小于约4％v/v、小于约3％v/v、小于约2％v/v、小于约1％v/v、小于约0.5％v/v或基本上不会(0％v/v)漏出到所述闭合回路之外。

在一些实施方案中，循环通过所述闭合回路的灌注液中小于约20％v/v、小于约15％v/v、小于约10％v/v、小于约5％v/v、小于约4％v/v、小于约3％v/v、小于约2％v/v、小于约1％v/v、小于约0.5％v/v或基本上不会(0％v/v)漏出到所述闭合回路之外。

在一些实施方案中，所述灌注导管或所述回收导管中的一者或多者是球囊导管。

在另一个方面中，一种方法包括：将灌注导管定位在所述肾脏的肾动脉中；将回收导管定位在所述肾脏的肾静脉中，使得所述灌注导管和所述回收导管与膜式氧合装置一起形成穿过所述肾脏的闭合灌注回路；以及使氧合血液流过所述闭合回路，使得所述闭合回路将所述肾脏与所述患者的全身循环隔离。在一些实施方案中，所述方法还包括将肾毒性药物引入所述患者的全身循环中。在一些实施方案中，相较于在不存在所述闭合回路的情况下施用所述肾毒性药物，所述肾毒性药物对所述肾脏的暴露得以防止或减少。

在另一个方面中，一种用于在与患者的肾脏流体地联接时对所述肾脏进行局部区域灌注的系统包括：灌注导管，所述灌注导管适合于插入所述肾脏的肾动脉中；回收导管，所述回收导管适合于插入所述肾脏的肾静脉中；膜式氧合装置，所述膜式氧合装置流体联接到所述灌注导管、所述回收导管和氧气源，其中当将所述灌注导管插入所述肾动脉中并将所述回收导管插入所述肾静脉中时，所述灌注导管、所述回收导管和所述膜式氧合装置一起形成穿过所述肾脏的闭合回路，所述肾脏与所述患者的全身循环隔离；以及泵，所述泵被配置为驱动流体流通过所述灌注导管和所述回收导管。

在一些实施方案中，所述系统还包括回收球囊导管，所述回收球囊导管适合于插入所述患者的膀胱中以在所述灌注期间测量尿液排泄。

在一些实施方案中，所述系统还包括额外地回收导管，所述额外的回收导管适合于插入所述患者的两条输尿管中的每一者中以有差别地测量所述患者的两个肾脏的排泄。

在一些实施方案中，所述膜式氧合装置包括被配置用于在灌注期间将药物注入所述闭合回路中的储槽。

在一些实施方案中，所述系统适合于将通过所述闭合回路的灌注液的流速维持为每肾脏约500mL/min/1.73m

在另一个方面中，一种用于对患者的肾脏进行局部区域灌注的系统包括：灌注导管，所述灌注导管插入所述肾脏的肾动脉中；回收导管，所述回收导管插入所述肾脏的肾静脉中；以及膜式氧合装置，所述膜式氧合装置流体地联接到所述灌注导管、所述回收导管和氧气源，使得所述灌注导管、所述回收导管和所述膜式氧合装置与所述肾脏一起形成穿过所述肾脏的闭合回路，所述肾脏与所述患者的全身循环隔离；以及泵，所述泵被配置为驱动流体流经由所述灌注导管进入所述肾脏并且经由所述回收导管离开所述肾脏。

在一些实施方案中，所述系统还包括：回收球囊导管，所述回收球囊导管插入所述患者的膀胱中以在所述灌注期间测量尿液排泄。

在一些实施方案中，所述系统还包括：额外的回收导管，所述额外的回收导管插入所述患者的两条输尿管中的每一者中以有差别地测量所述患者的两个肾脏的排泄。

在一些实施方案中，所述膜式氧合装置包括被配置用于在灌注期间将药物注入所述闭合回路中的储槽。

在一些实施方案中，所述系统适合于将通过所述闭合回路的灌注液的流速维持为每肾脏约500mL/min/1.73m

在另一个方面中，以上任何系统中的一种系统被配置为执行以上任何方法中的一种方法。

以上目标和其他目标进一步通过本发明满足，在某些实施方案中，本发明涉及被配置为执行任何前述方法的局部区域灌注系统。

附图说明

在结合附图考虑以下详细描述后，本发明的以上和其他特征、其性质和各种优势将变得更显而易见，其中：

图1示出根据至少一个实施方案的具有单一球囊结构的第一示例性回收导管的示意图；

图2是根据第一示例性回收导管的一个实施方案制造的回收导管的像片；

图3示出根据至少一个实施方案的第一示例性回收导管的部署；

图4示出根据至少一个实施方案的具有单一球囊结构的第二示例性回收导管的部署；

图5示出根据至少一个实施方案的各自具有单一球囊结构的第三示例性回收导管和第四示例性回收导管的部署；

图6示出根据至少一个实施方案的具有单一球囊结构的第五示例性回收导管和不具有球囊结构的第六示例性回收导管的部署；

图7示出根据至少一个实施方案的具有多个球囊结构的第七示例性回收导管的部署；

图8示出根据至少一个实施方案的具有被部分覆盖并且可收回的支架结构的第八示例性回收导管的部署；

图9示出根据至少一个实施方案的具有可展开并且可回缩的支架结构和球囊结构的第九示例性回收导管的部署；

图10示出根据至少一个实施方案的具有被覆盖的盘状支架结构的第十示例性回收导管的部署；

图11A是根据至少一个实施方案的具有单一球囊结构的第一示例性灌注导管的示意图；

图11B是根据至少一个实施方案的呈扩张状态的第一示例性灌注导管的球囊结构的示意图；

图11C是根据至少一个实施方案的呈回缩状态的第一示例性灌注导管的球囊结构的示意图；

图12A是根据至少一个实施方案的具有远端管塞的第二示例性灌注导管的示意图；

图12B是根据至少一个实施方案的第二示例性灌注导管的管塞的示意图；

图12C是根据至少一个实施方案的呈伸出状态的第二示例性灌注导管的管塞的示意图；

图13A是根据至少一个实施方案的具有远端楔形件的第三示例性灌注导管的示意图；

图13B是根据至少一个实施方案的第三示例性灌注导管的楔形件的示意图；

图13C是根据至少一个实施方案的呈伸出状态的第三示例性灌注导管的远端的另一示意图；

图14A示出根据至少一个实施方案的具有被部分覆盖并且可收回的支架结构的第四示例性灌注导管的部署；

图14B示出根据至少一个实施方案的呈回缩状态的第四示例性灌注导管的支架结构；

图14C示出根据至少一个实施方案的呈展开状态的第四示例性灌注导管的支架结构；

图15A示出根据至少一个实施方案的具有可脱离的被覆盖编织盘的第五示例性灌注导管的部署；

图15B示出根据至少一个实施方案的呈展开状态的第五示例性灌注导管的编织盘；

图16A是根据至少一个实施方案的具有逐渐变细的管腔轴的第六示例性灌注导管的示意图；

图16B示出根据至少一个实施方案的第六示例性灌注导管的部署；

图16C示出根据至少一个实施方案的第六示例性灌注导管的预整形管腔轴；

图17示出根据各个实施方案的示例性导管的示例性预成型管腔轴；

图18描绘根据本公开的实施方案的示例性局部区域灌注系统；

图19是根据本公开的实施方案的示例性局部区域灌注装置的示意图；

图20包括示出在静脉注射造影剂之前(上部图像)和之后(下部图像)动脉导管和静脉导管分别在猪肾的肾动脉和肾静脉中的放置的放射线像片；

图21是示出根据本公开的实施方案执行肾脏LRP 60分钟之后的肾脏转导和生物分布的图；

图22A示出在高载体基因组剂量的情况下在60分钟肾脏LRP程序期间的各个时间点测得的每mL血浆的载体基因组；

图22B示出在低载体基因组剂量的情况下在45分钟肾脏LRP程序期间的各个时间点测得的每mL血浆的载体基因组；

图23A是两种不同的动物在肾脏LRP治疗后数天的C3a水平的图；

图23B是各种样本稀释的转导抑制百分数的图；

图24A是在肾脏LRP期间的流速的图；以及

图24B是在肾脏LRP期间的泵速度的图。

定义

除非上下文另外明确指出，否则如本文所使用，单数形式“一个”和“所述”包括多个参考物。因此，例如，提及“药物”包括单一药物以及两种或两种以上不同药物的混合物；并且提及“病毒载体”包括单一病毒载体以及两种或两种以上不同病毒载体的混合物，及其类似情形。

此外，如本文所使用，当结合测得的量使用时，“约”是指如本领域普通技术人员所预期的使测量和操作与测量的目标和测量设备的精确度在所关心的水平上相称的测得的量的正常变化。在某些实施方案中，术语“约”包括所述数值±10％，由此“约10”将包括9到11。

此外，如本文所使用，“多核苷酸”具有它在此项技术中的普通且惯用的含义并且包括任何聚合核酸，诸如DNA或RNA分子，以及本领域技术人员已知的化学衍生物。多核苷酸不仅包括编码治疗蛋白的多核苷酸，并且还包括可用于使用此项技术中已知的技术减少目标核酸序列的表达的序列(例如反义、干扰或小干扰核酸)。多核苷酸还可以用于起始或增加心血管系统的细胞内目标核酸序列的表达或目标蛋白质的产生。目标核酸和蛋白质包括但不限于通常见于目标组织中的核酸和蛋白质、此类天然存在的核酸或蛋白质的衍生物、不常见于目标组织中的天然存在的核酸或蛋白质、或合成核酸或蛋白质。一种或多种多核苷酸可组合使用，同时和/或依次施用，以增加和/或减少一种或多种目标核酸序列或蛋白质。

此外，如本文所使用，“灌注”具有它们在此项技术中的普通且惯用的含义，并且是指基本上比技术公认的术语“注射”或“推注注射”(通常小于一分钟)长的时间段(通常为一分钟或更长时间)的施用。灌注的流速将至少部分取决于所施用的体积。

此外，如本文所使用，“外源”核酸或基因是自然界中不存在于用于核酸转移的载体中的核酸；例如非天然存在于病毒载体中的核酸，但该术语不意欲排除编码天然存在于患者或宿主中的蛋白质或多肽的核酸。

此外，如本文所使用，“肾细胞”包括参与维持肾脏结构或提供肾脏功能的任何肾脏细胞。

此外，如本文所使用，“隔离”、“基本上隔离”、“在很大程度上隔离”及其变化形式是不需要肾脏或全身循环的完全或绝对隔离的术语；而是，它们意欲表示指定循环的大部分、优选地主要部分或甚至是基本上全部被隔离。此外，如本文所使用，“部分地隔离”是指指定循环的任何重要部分被隔离。

此外，如本文所使用，“非天然限制”包括限制流体流过血管的任何方法，例如球囊导管、缝合等，但不包括天然存在的限制，例如斑块堆积(狭窄)。非天然限制包括例如肾脏循环的实质性或完全隔离。

此外，如本文所使用，“微创”意欲包括不需要开放肾脏或与肾脏紧密相连的血管的手术通路的任何程序。此类程序包括使用内窥镜检方式进入肾脏，以及使用依赖于经由大动脉和静脉进入的基于导管的方式。

此外，如本文所使用，“腺相关病毒”或“AAV”涵盖所有亚型、血清型和假型，以及天然存在的形式和重组形式。多种AAV血清型和病毒株是此项技术中已知的并且可公开得自多种来源，诸如ATCC，和学术或商业来源。另选地，可使用已知技术合成公开和/或得自多种数据库的来自AAV血清型和病毒株的序列。

此外，如本文所使用，“血清型”是指基于与确定的抗血清的衣壳蛋白反应性来鉴别并与其他AAV相区别的AAV。存在至少十二种已知血清型的人类AAV，包括AAV1到AAV12，但仍不断发现另外的血清型，并且考虑使用新发现的血清型。

此外，如本文所使用，“假型”AAV是指含有来自一种血清型的衣壳蛋白和病毒基因组的AAV，所述病毒基因组包括不同或异源血清型的5'和3'反向末端重复序列(ITR)。假型重组AAV(rAAV)预计将具有衣壳血清型的细胞表面结合特性和与ITR血清型一致的遗传特性。假型rAAV可包括AAV衣壳蛋白，包括VP1、VP2和VP3衣壳蛋白；以及来自任何血清型AAV的ITR，包括来自AAV1到AAV12的任何灵长类动物AAV血清型，只要衣壳蛋白为与ITR的血清型异源的血清型即可。在假型rAAV中，5'和3'ITR可为相同或异源的。假型rAAV是使用此项技术中所描述的标准技术产生。

此外，如本文所使用，“嵌合”rAAV载体涵盖包含异源衣壳蛋白的AAV载体；即，rAAV载体关于其衣壳蛋白VP1、VP2和VP3可为嵌合的，使得VP1、VP2和VP3不是都属于相同血清型AAV。如本文所使用，嵌合AAV涵盖AAV，使得衣壳蛋白VP1、VP2和VP3在血清型方面不同，包括例如但不限于来自AAV1和AAV2的衣壳蛋白；是其他细小病毒衣壳蛋白的混合物或包含其他病毒蛋白或其他蛋白质，诸如将AAV靶向递送到所希望细胞或组织的蛋白质。如本文所使用，嵌合rAAV还涵盖包含嵌合5'和3'ITR的rAAV。

此外，如本文所使用，“医药学上可接受的赋形剂或载剂”是指组合物中与调配物中的活性剂组合的任何惰性成分。医药学上可接受的赋形剂可包括但不限于碳水化合物(诸如葡萄糖、蔗糖或聚葡萄糖)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸或麸胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质、高分子量聚合物、胶凝剂或其他稳定剂和添加剂。医药学上可接受的载剂的其他示例包括润湿剂、乳化剂、分散剂或特别适用于防止微生物生长或作用的防腐剂。各种防腐剂是熟知的并且包括例如苯酚和抗坏血酸。载剂、稳定剂或佐剂的示例可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版.(1985)。

此外，如本文所使用，“患者”是指表现出一种或多种表明需要治疗的特定症状的临床表现、针对疾患进行了预防性治疗、或已诊断患有待治疗的疾患的受试者，特别是人类(但也可以涵盖非人类)。

此外，如本文所使用，“受试者”涵盖术语“患者”的定义并且不排除在其他方面健康的个体。

此外，如本文所使用，“治疗”包括施用药物以旨在降低某种疾患的严重程度或预防某种疾患，例如肾脏疾患或肾脏疾病。

此外，如本文所使用，“预防”包括避免例如肾脏疾患或肾脏疾病等疾患的发生。

此外，如本文所使用，“疾患”是指可通过向受试者施用有效量的药物来治疗、缓解或预防的医学疾患，诸如肾脏疾病。

此外，如本文所使用，“有效量”是指足以产生某一水平的有益或所希望效果的药物的量，该水平可通过常用于检测此类效果的方法容易地检测到。在一些实施方案中，此类效果引起相对于未施用药物的基础水平的值至少10％的变化。在其他实施方案中，所述变化是相对于基础水平的至少20％、50％、80％或甚至更高百分比。如下文将描述，药物的有效量可取决于受试者的年龄、一般状况、所治疗疾患的严重程度、所施用的特定药物及其类似因素，随各受试者而变化。在任何个别情况下适当的“有效”量可由本领域普通技术人员参考相关文本和文献和/或通过使用常规实验来确定。

此外，如本文所使用，“活性剂”是指预期会产生治疗、预防或其他预期效果的任何物质，无论是否被政府机构批准用于所述目的。

除非本文另外指示，否则本文中的值的范围的叙述仅意欲充当个别地提及在所述范围内的每一单独值的简写方法，并且每一单独值并入本说明书中，如同在本文中个别地叙述一般。除非本文另外指明或与上下文明显矛盾，否则本文所描述的所有方法可以按任何适合的顺序进行。本文所提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅意欲说明某些物质和方法并且不对范围造成限制。本说明书的语言均不应解释为指示任何非主张的要素对于所公开的物质和方法的实践为必不可少的。

具体实施方式

本公开的某些实施方案涉及用于以微创方式治疗肾脏疾患的系统和方法。本公开的某些其他实施方案涉及使用微创经皮递送系统将AAV器官选择性地递送到肾脏。示例性方法可以包括将患者的肾脏循环与患者的全身循环隔离，并将流体(诸如含药物流体)灌注到患者的被隔离或基本上隔离的肾脏循环中。可在一个或两个肾中执行灌注，并且可用于递送一种或多种药物，包括但不限于基因治疗载体、外泌体、纳米颗粒、抗体、化疗等，但不会使全身循环暴露于所选药物中且因此不会使其他器官暴露于所选药物中。所述方法还可以用于隔离肾脏循环以允许向患者的全身循环施用例如肾毒性药物，以便保护肾脏免受不良作用影响。下文将参照图18和图19更详细地描述患者的肾脏循环的隔离。

可以用本文公开的方法治疗的肾脏疾患或疾病可包括但不限于肾消耗病，尤其是由NPHP1基因中的常染色体隐性突变引起的肾消耗病，和常染色体显性多囊肾病，尤其是由PKD2基因的单倍剂量不足引起的常染色体显性多囊肾病。肾消耗病是导致终末期肾衰竭的常染色体隐性肾病。最常见的形式是由NPHP1的突变(最常见是双等位基因缺失)引起(Hildebrandt,F.等人,Nature Genetics,vol.17,149-153,1997；Saunier,S.等人,HumanMolecular Genetics,vol.6,no.13,2317-2323,1997)。NPHP1基因导致位于肾上皮细胞的粘合连结和粘着斑处的733氨基酸蛋白质、肾结核蛋白-1(长度是2199个碱基的cDNA)，所述肾上皮细胞可搭载在AAV上。可设想到，肾结核蛋白-1取代到目标组织可以缓解或纠正1型肾消耗病。

常染色体显性多囊肾病(ADPKD)的发病率是1/1000人，并且其中约15％是由于PKD2蛋白质的突变引起。PKD2是968氨基酸多肽，并且是定位到纤毛的内在膜蛋白。主要的发病机制是单倍剂量不足(Veldhuisen,B.等人,American Journal of Human Genetics,vol.61,547-555,1997)。可设想到，用AAV介导基因疗法提高PKD2蛋白质水平可以缓解ADPKD。

通过全身施用重组AAV载体进行实体器官转导具有挑战性，因为它要求高剂量且导致严重不良事件(SAE)，尤其是肝毒性和血栓性微血管病。某些实施方案涉及使得能够对实体器官进行选择性灌注的局部区域递送和灌注系统。所述实施方案证明了AAV载体到一个或两个肾脏的靶向递送是可能的，且不会有到全身循环的相关排放。

为了证明本文描述的实施方案的功效，经由颈内静脉和股通路对AAV血清阴性的成年家猪(约90kg)的左肾动脉和静脉经皮插入导管。为了将肾脏与全身循环隔离，使用每个动物自己的肝素化血液预充(灌注液)建立闭合回路，并且使用体外膜式氧合(ECMO)系统来开始局部区域灌注(LRP)。将具有CMV-EGFP转基因盒的AAV载体注入闭合回路LRP系统中，并且执行肾脏的局部区域灌注多达2小时。纵向收集血液样本以进行安全评估，并且在程序之前、期间及之后进行载体滴定和免疫学评估(例如，补体激活、抗AAV抗体)。在程序完成之后，抽出含有载体的灌注液，并且移除导管。在对动物实施安乐死并采集来进行组织处理之前，要对动物评估2周。使用定量PCR(qPCR)来检测载体基因组的存在，并且通过qPCR、免疫印迹和免疫组织化学来评估转基因表达。该程序在所有动物身上都成功，并且没有发生围手术期并发症。动物很快恢复，并且没有肾损伤或损害的任何临床体征。在程序期间，在闭合回路的灌注液中，载体浓度保持为高且稳定，并且没有到全身循环的相关泄漏或尿液。AAV颗粒均匀地分散在治疗后的肾组织中。绿色萤光蛋白(GFP)在被灌注肾脏中均匀地表达。在未经治疗的对侧肾脏、肝脏或其他器官中没有检测到载体。抗AAV中和抗体相比于基线仅略微增加，并且没有检测到补体激活。在下文更详细地讨论其他试验。

在一些实施方案中，所述系统包括动脉进入导管，所述动脉进入导管可以例如经由股动脉插入并且密封在肾动脉内，其中流速适合于在程序持续时间期间对肾脏进行灌注和氧合，在70kg成人中通常是500-600mL/min/肾(或1000-1200mL/1.73m

在一些实施方案中，所述系统包括允许药物施用或流体添加的一个或多个额外进入管线。在一些实施方案中，球囊导管可以插入患者的膀胱中以在程序期间测量尿液排泄。在其他实施方案中，各个输尿管导管放在两条输尿管中的每一者中以有差别地测量两个肾脏的排泄。在一些实施方案中，所述系统适合于置换由于膀胱排泄而损失的灌注液的流体体积。例如，在一些实施方案中，可使用额外的灌注液(例如，血液)和/或其他生理上可接受的溶液(例如，血浆或盐水溶液)来置换约5％v/v至约50％v/v的损失的灌注液体积以将膀胱排泄考虑在内。

在一些实施方案中，所述系统和方法允许用目标药物对一个肾进行局部区域灌注，持续时间是诸如15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或其间限定的任何范围。在一些实施方案中，所述系统和方法允许对一个肾脏或两个肾脏的选择性药物寻靶，其中全身循环和其他器官不会暴露于药物或以最小程度暴露于药物。在一些实施方案中，基因治疗药物可用于治疗肾脏疾患，所述基因治疗药物可使用病毒载体(例如，腺相关病毒)、裸或衣壳化DNA或RNA分子、合成DNA或RNA类似物(例如，反义的)。在一些实施方案中，可使用化疗来靶向肾肿瘤。在一些实施方案中，可使用其他药物或生物制剂/抗体。在一些实施方案中，可使用前述药物的组合。

当治疗肾脏疾患时，将患者的肾脏循环与患者的全身循环隔离有许多优点。这些优点包括但不限于：(1)药物的局部区域递送、药物极少漏出到其他器官和总体药物剂量减少；(2)目标药物剂量增加；(3)风险和副作用减少；和(4)对选定患者再给药或对并非某些疗法的适合疗法候选者的患者群(诸如将利用病毒载体的基因疗法用于具有针对所述病毒载体的抗体的患者)给药的可能性。

示例性导管实施方案

现在描述示例性回收导管和灌注导管。本领域普通技术人员应了解，所述导管可被配置用于将被执行LRP的任何目标器官(例如肾脏)的解剖结构。另外，应理解，被描述为“回收导管”的导管中的任一者也可用作“灌注导管”，并且反之亦然。本文所描述的实施方案不限于肾脏的LRP，而且还可以用于将肾脏循环与全身循环隔离，例如以减少或防止肾脏暴露于引入全身循环中的可能对肾脏具有害影响的药物或其他药剂。本领域普通技术人员应了解本文所描述的导管实施方案的其他用途，例如用于希望密封血管的应用中。

现在描述在LRP系统中用作回收导管的示例性导管的实施方案。在至少一个实施方案中，回收导管被设计成支持约400mL/min或更高(例如约700mL/min或更高)的液体抽吸流速。例如，在某些实施方案中，示例性导管在约-80mmHg下可支持约800mL/min的活体外抽吸流速。

图1到图10描绘LRP系统中适于流体回收的各种导管实施方案。图1到图10中所描绘的导管中的任一者可被配置为支持至少约400mL/min、至少约450mL/min、至少约500mL/min、至少约550mL/min、至少约600mL/min、至少约650mL/min、至少约700mL/min、至少约750mL/min、至少约800mL/min、至少约850mL/min、至少约900mL/min、至少约950mL/min或至少约1000mL/min的液体流速(抽吸或灌注)。每个导管都可以与可控式导引鞘兼容，所述导引鞘提供稳定性并且引导导管的远端，并允许导管产生定向推力。每个导管还可以具有整合到其轴组件中的牵引线，以允许在闭塞结构近端的区段弯曲至多120°的角度并且实现闭塞结构的较佳追踪和定中心。

在某些实施方案中，一个或多个导管可以是多管腔导管，诸如双管腔导管。在某些实施方案中，所述多管腔导管允许液体流动(例如灌注液)并且能够使一个或多个球囊膨胀。在某些实施方案中，一个或多个导管可以是具有两个或两个以上球囊的多球囊导管。在某些实施方案中，一个或多个球囊可独立地展开或收缩。

图1示出具有管腔轴104/106的示例性导管100，所述导管具有近端101和远端102。管腔轴104/106可由外管腔轴104形成，所述外管腔轴至少部分地包围内管腔轴106而暴露内管腔轴106的接近远端102的远端部分。近端101包括出口结构，所述出口结构可流体联接到LRP系统。外管腔轴104或内管腔轴106中的一者或多者可由耐用聚合物材料诸如聚醚嵌段酰胺(PEBA)材料(例如可作为

导管100包括在远端102处的顶端部分108以及沿内管腔轴106的一部分112安置的可扩张球囊结构110。在至少一个实施方案中，顶端部分108包括从球囊结构110延伸到远端102的细长轴。在至少一个实施方案中，所述顶端部分的细长轴的长度是约2mm至约35mm、约5mm至约30mm、约10mm至约25mm、约15mm至25mm或在其间限定的任何子范围(例如约2mm至约5mm)内。在至少一个实施方案中，顶端部分108包括在远端102处的开口和沿所述细长轴的一个或多个穿孔。在至少一个实施方案中，顶端部分是由柔性材料形成，所述柔性材料的柔性要高于内管腔轴106的材料。

在至少一个实施方案中，内管腔轴106包括在液体流动路径周围的同心内部流动路径。所述同心内部流动路径提供气体从球囊结构110流到孔口114的路径，所述路径可根据在孔口114处施加的压力而用于使球囊膨胀或收缩。在至少一个实施方案中，在部分112处的内管腔轴106的最外表面被移除以使得所述部分112被球囊结构110密封以隔离从同心内部流动路径到球囊结构110的气体流。在至少一个实施方案中，球囊结构的扩张直径是约15mm至约30mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约24mm至约28mm或约25mm至约30mm。

图2是结构类似于导管100的具有呈展开状态的球囊的导管的图像。所述导管的尺寸包括：19Fr(6.3mm)的截面外形；12Fr(4.0mm)的最内直径；80cm的可用长度；25mm的球囊直径(当展开时)；以及20mm的顶端部分长度。管腔轴可由聚合物材料诸如

图3示出根据至少一个实施方案将示例性导管300经由较大血管或腔室350(本文称为“血管”)插入血管352中。在所描绘的解剖结构中，来自血管352和354的血流排出到血管350中。导管300可能与导管100相同或类似，具有近端301、远端302、内管腔轴304、外管腔轴306、顶端部分308以及安置在内管腔轴304的一部分312上的球囊结构310。球囊结构310在展开时具有足够顺从性以适合血管352的解剖结构并闭塞穿过血管352进入血管350中的血流，同时不会对组织产生过量的力。如图3中所示，导管300插入穿过血管354，以避免闭塞从血管354进入血管350中的流。

请注意，血管或腔室350、血管352和血管354分别是心脏的右心房、冠状窦和中心脏静脉的解剖结构的例示，以说明可使用示例性导管的各种类型的闭塞技术。然而，它们在本文中被称为普通血管，因为将理解，本文描述的任何导管的部署都可以适应于将在其中进行LRP或闭塞的目标器官(例如，肾脏)的特定解剖结构。例如，血管350和血管352可分别对应于肾脏的下腔静脉和肾静脉(不存在血管354)。

图4到图10示出根据本公开的各个实施方案的其他闭塞技术。图4到图10中所描绘的导管在某些方面可能与图1到图3中所描绘的导管类似，例如在尺寸、材料或结构方面。

图4示出根据至少一个实施方案的导管400，所述导管仅部分插入血管352中，使得其邻接血管352的孔。导管400包括近端401、远端402、内管腔轴404、外管腔轴406、顶端部分408以及安置在内管腔轴404的一部分412上的球囊结构410。在至少一个实施方案中，当展开时，球囊结构410的直径大于约15mm、大于约20mm、大于约25mm或大于约30mm。顶端部分408除包括在远端402处的开口外，还可以包括一个或多个穿孔，以便于血液从血管352和血管354流到导管400中。

在至少一个实施方案中，在展开期间，外管腔轴406可以向远端移动以邻接展开的球囊结构410，使得球囊结构410对血管352的孔产生额外压力，以使导管400的位置进一步稳定。在至少另一个实施方案中，可利用线结构对球囊结构410施加压力。线结构例如可以具有正弦曲线形状，所述正弦曲线形状可以被部署成从外管腔轴406或内管腔轴404径向延伸的扩张的花状结构。当与球囊结构410接触时，线结构可以在球囊结构410的整个表面上产生较均匀的压力分布。在部署之前，线结构可以被外管腔轴406覆盖，或者可以被在外管腔轴406外面的额外管腔覆盖。

图5示出根据至少一个实施方案使用第一导管500和第二导管550分别单独地闭塞和排空血管352和血管354。第一导管500包括近端501、远端502、管腔轴504、顶端部分508以及安置在管腔轴504的一部分512上的球囊结构510。类似地，第二导管550包括近端551、远端552、管腔轴554、顶端部分558以及安置在管腔轴554的一部分562上的球囊结构560。在该配置中，第一导管500插入血管352中，使得球囊结构510不会闭塞血管354，而第二导管550直接插入血管354中。可以选择第一导管500和第二导管550的尺寸以分别提供对血管352和血管354的安全且有效的闭塞。

图6示出图5的变化形式，所述变化形式使用两个导管，其中仅一个具有根据至少一个实施方案的球囊结构。第一导管600包括近端601、远端602、管腔轴604、顶端部分608以及安置在管腔轴604的一部分612上的球囊结构610。第二导管650包括近端651、远端652、管腔轴654和顶端部分658，并且不包括球囊结构。第一导管600插入血管352中，使得球囊结构610的一部分闭塞血管354并且部分地在血管350和血管352内。第二导管650直接插入血管354中并且安置在血管壁与球囊结构610之间，至少部分地闭塞血管354。

图7示出根据至少一个实施方案使用单个导管700，所述导管包括多个球囊。导管700包括近端701、远程702、管腔轴704、顶端部分708、安置在管腔轴704的第一部分712上的第一球囊结构710以及安置在管腔轴704的第二部分722上的第二球囊结构720。在至少一个实施方案中，导管700被设计用于插入血管352中，使得第一球囊结构710闭塞血管352，并且第二球囊结构720邻接血管352的孔以闭塞血管354(并且进一步闭塞血管352)。在第一球囊结构710与第二球囊结构720之间的管腔轴704的中间部分724包括允许血管354排空的一个或多个穿孔。在至少一个实施方案中，第二球囊结构720的扩张直径大于第一球囊结构710的扩张直径。在至少一个实施方案中，导管700是被设计成允许各球囊彼此独立地展开和收缩的多管腔导管。

图8示出根据至少一个实施方案的导管800，所述导管包括被部分覆盖并且可收回的支架结构810。导管800包括近端801和远端802、联接到支架结构810的内管腔轴804、以及外管腔轴806。外管腔轴806的部分是以剖视图描绘以示出里面的内管腔轴804。支架结构810是以其展开状态描绘，但在展开之前可容纳在外管腔轴806内。支架结构810进一步被描绘为具有可由柔性且耐用的聚合物材料形成的近端被覆盖部分810A，以及远端未被覆盖部分810B。当插入血管352中时，如所示，被覆盖部分810A闭塞从血管352流出的血流，而未覆盖部分810B在血管352内提供结构支撑，同时允许血液从血管352和血管354直接流入导管800中。在至少一个实施方案中，导管800可以用作连接到供给管线的灌注导管。

图9示出根据至少一个实施方案的导管900，所述包括可展开并且可回缩的支架结构920。导管900还包括近端901、远端902、管腔轴906、顶端部分908以及安置在管腔轴906的一部分912上的球囊结构910。导管900还可以包括外管腔轴(未示出)，所述外管腔轴在展开之前基本上包封支架结构920和球囊结构910。支架结构920的展开可以通过在近端方向上移动外管腔轴来进行，并且支架结构920的回缩可以通过在远侧方向上移动外管腔轴来进行。支架结构920可以由例如不锈钢形成，并且安置在球囊结构910与顶端部分908之间。在至少一个实施方案中，管腔轴906沿在球囊结构910与支架结构920之间的部分922包括至少一个穿孔以允许血管354排出到导管900中。当插入血管352中时，球囊结构910邻接血管352的孔。

图10示出根据至少一个实施方案的导管1000，所述导管包括被覆盖的盘状支架结构1010。导管1000还包括近端1001、远端1002、外管腔轴1006、内管腔轴1004和顶端部分1008。支架结构1010可以由例如具有耐用聚合物覆盖物的不锈钢支架形成。在支架结构1010展开之前，外管腔轴1006可覆盖所述支架结构。在导管1000正确地定位后，外管腔轴1006即可以在近端方向上移动以便能展开支架结构1010。在至少一个实施方案中，支架结构1010联接到顶端部分1008，所述顶端部分可以部分容纳在内管腔轴1004内，并且可以是可致动的(使用线)以在近端方向上移动时展开支架结构1010，并且在远端方向上移动时回缩支架结构1010。在至少一个实施方案中，支架结构1010在展开时足够大以在邻接血管352的孔时闭塞血管352和血管354。在至少一个实施方案中，支架结构1010的直径是约10mm至约30mm。

现在描述在LRP系统中用作灌注导管的示例性导管的实施方案。在至少一个实施方案中，灌注导管被设计成支持约400mL/min或更高(例如约700mL/min或更高)的液体灌注流速。在利用多个灌注导管的实施方案中，可以支持700mL/min或更高的组合流量容量。

图11到图16描绘LRP系统中适于流体灌注的各种导管实施方案。图11到图16中所描绘的导管中的任一个可以被配置为支持至少约400mL/min、至少约450mL/min、至少约500mL/min、至少约550mL/min、至少约600mL/min、至少约650mL/min、至少约700mL/min、至少约750mL/min、至少约800mL/min、至少约850mL/min、至少约900mL/min、至少约950mL/min或至少约1000mL/min的液体流速(抽吸或灌注)。每个导管均可以被设计成具有从近端导管体到下部远端外形的平滑外形，例如使用一个或多个同心管腔轴。另外，所述导管可以被设计为具有取决于将在其中执行LRP程序的解剖结构而预整形的管腔轴，这样可以在使用期间提高整体稳定性。

在某些实施方案中，一个或多个导管可以是多管腔导管，诸如双管腔导管。在某些实施方案中，所述多管腔导管允许液体流(例如灌注液)并且能够使一个或多个球囊膨胀。在某些实施方案中，一个或多个导管可以是具有两个或两个以上球囊的多球囊导管。在某些实施方案中，一个或多个球囊可以独立地展开或收缩。

图11A到图11C示出具有管腔轴1104/1106的示例性导管1100，所述导管具有近端1101和远端1102，所述远端具有开口，灌注液可以从所述开口流出。管腔轴1104/1106可以由外管腔轴1104形成，所述外管腔轴至少部分地包围内管腔轴1106而暴露内管腔轴1106的接近远端1102的远端部分。近端1101包括出口结构，所述出口结构可以流体联接到LRP系统。外管腔轴1104或内管腔轴1106中的一者或多者可以由耐用聚合物材料，诸如聚醚嵌段酰胺(PEBA)材料(例如可作为

导管1100包括沿对应于内管腔轴1106的一部分1112安置的可扩张球囊结构1110以及由额外管腔形成的顶端部分。在至少一个实施方案中，内管腔轴1106包括在液体流动路径周围的同心内部流动路径。所述同心内部流动路径提供气体从球囊结构1110流到孔口1114的路径，所述路径可根据在所述孔口1114处施加的压力而用于使球囊结构1110膨胀或收缩。在至少一个实施方案中，在部分1112处的内管腔轴1106的最外表面被移除以使得所述部分1112被球囊结构1110密封以隔离从同心内部流动路径到球囊结构1110的气体流。在至少一个实施方案中，球囊结构1110的扩张直径是约15mm至约30mm、约15mm至约20mm、约20mm至约25mm、约24mm至约28mm、约25mm至约30mm或在其间限定的任何子范围(例如约20mm至约28mm)内。图11B和图11C示出呈展开和收缩状态的球囊结构1110。

图12和图13分别示出包括管塞和楔形件闭塞结构的导管，所述结构有利地使其形状适合血管或孔，由高度可压缩并且非创伤性材料形成以便安全引入和部署，具有比球囊结构短的长度，并且不像球囊结构一般需要额外管腔来进行膨胀。

图12A到图12C示出具有管腔轴1204/1206的示例性导管1200，所述导管具有近端1201和远端1202，所述远端具有开口，灌注液可以从所述开口流出。管腔轴1204/1206可以由外管腔轴1204形成，所述外管腔轴至少部分地包围内管腔轴1206而暴露内管腔轴1206的接近远端1202的远端部分。近端1201包括出口结构，所述出口结构可以流体联接到LRP系统。外管腔轴1204或内管腔轴1206中的一者或多者可以由耐用聚合物材料，诸如聚醚嵌段酰胺(PEBA)材料(例如可作为

导管1200还包括接近远端1202的管塞1210。在至少一个实施方案中，管塞1210是由柔性材料诸如硅酮或泡沫材料形成。在至少一个实施方案中，管塞1210包括配合到内管腔轴1206上的内部部分1210A以及被整形为可在回缩状态(图12A)与伸出状态(图12C)之间配置的柔性外部部分1210B，对于所述伸出状态，外部部分1210B从远端1202向远端延伸。图12A中的管塞1210被示出为在远端方向上逐渐变细。在至少一个实施方案中，管塞1210可反向，使得它在近端方向上逐渐变细。在至少一个实施方案中，外管腔轴1204可以被配置为在管塞1210展开之前覆盖所述管塞。当用作灌注导管时，流入在管塞1210的内部部分1210A与外部部分1210B之间的中空空间中的动脉血流的压力可以帮助改善导管1200在它所部署在的血管中的密封。

图13A到图13C示出具有管腔轴1304/1306的示例性导管1300，所述导管具有近端1301和远端1302，所述远端具有开口，灌注液可以从所述开口流出。管腔轴1304/1306可以由外管腔轴1304形成，所述外管腔轴至少部分地包围内管腔轴1306而暴露内管腔轴1306的接近远端1302的远端部分。近端1301包括出口结构，所述出口结构可以流体联接到LRP系统。外管腔轴1304或内管腔轴1306中的一者或多者可以由耐用聚合物材料，诸如聚醚嵌段酰胺(PEBA)材料(例如可作为

导管1300还包括接近远端1302的楔形件1310，所述楔形件可被整形为适合血管或孔。在至少一个实施方案中，楔形件1310是由柔性材料诸如硅酮或泡沫材料形成。在至少一个实施方案中，外管腔轴1304可以被配置为在楔形件1310展开之前覆盖所述楔形件。当部署在血管中时，楔形件的形状可以利用来自血管壁的回冲力以进一步增强在血管闭塞和灌注期间的稳定性。

图14A到图14C示出与关于图8所描述的导管800类似的根据至少一个实施方案的示例性导管1400，所述示例性导管包括被部分覆盖并且可收回的支架结构1406。导管1400被示出为经由血管或腔室1450插入动脉血管1452中。在某些实施方案中，导管1400包括外管腔轴1402以及与支架结构1406联接的内管腔轴1404。支架结构1406进一步被描绘为具有可由柔性且耐用的聚合物材料形成的近端被覆盖部分，以及远端未被覆盖部分。图14B和图14C分别示出在插入血管1452中时支架结构1406的放置和展开。支架结构1406的展开是通过在近端方向上移动外管腔轴1402来进行。

图15A和图15B示出根据至少一个实施方案的示例性导管1500，所述示例性导管包括可脱离的被覆盖编织盘1510。导管1500包括外管腔轴1506和内管腔轴1504。编织盘1510在导管1500放置期间被容纳在外管腔轴1506内，并且可以通过在近端方向上移动外管腔轴1506而展开。在某些实施方案中，当展开时，编织盘1510未扩张越过远端1502，并且用于使抵靠血管1452的孔的导管1500稳定，以减小在血管1452闭塞期间狭窄的风险，同时使远端1502延伸到血管1452中。

图16A到图16C示出具有管腔轴1606的示例性导管1600，所述导管具有近端1601和远端1602，所述远端具有开口，灌注液可以从所述开口流出。近端1601包括出口结构，所述出口结构可以流体联接到LRP系统。管腔轴1604可以由耐用聚合物材料诸如聚醚嵌段酰胺(PEBA)材料(例如可作为

预整形的导管管腔的示例示出于图17中。导管管腔可以被整形为在部署时邻接解剖结构的区域，从而利用来自血管壁的回冲力以进一步增强在目标器官的闭塞和灌注期间的稳定性。

示例性LRP系统实施方案

图18描绘根据本公开的实施方案的示例性LRP系统1800。LRP系统1800是以与肾脏1810呈闭合回路配置显示。LRP系统1800包括膜式氧合装置1820、血气分析(BGA)监测器1830、流体源1840、流量测量装置1842、用于监测和控制流体流的ECMO泵控制台1846，以及用于测量闭合回路内的压力的压力导丝和控制台1844。在某些实施方案中，还可以利用真空泵1848。LRP系统1800可以通过以下方式组装：将第一导管1822(它在本文中可称为“灌注导管”)定位在肾脏1810的肾动脉中以及将第二导管1824(它在本文中可称为“回收导管”、“收集导管”或“抽吸导管”)定位在肾脏1810的肾静脉中。第一导管1822和第二导管1824连同肾脏1810的脉管系统、膜式氧合装置1820和一个或多个视情况选用的额外组件一起形成闭合回路。此闭合回路可以将患者的肾脏循环与患者的全身循环隔离或基本上隔离。

第一导管1822和第二导管1824可以以微创方式经皮引入。在一些实施方案中，第一导管1822和/或第二导管1824可经由顺行性插管引入。在其他实施方案中，第一导管1822和/或第二导管1824可经由逆行性插管引入。当使用导管将药物递送到一个或两个肾脏时，第一导管1822在本文中可称为“药物递送导管”并且第二导管1824在本文中可称为“药物收集导管”。

第一导管1822可以是标准输注导管，所述导管可任选地包括标准导丝和输注泵并且能够将灌注液递送到肾脏1810，所述灌注液可含有例如在局部区域灌注期间欲递送到肾脏1810的药物。在一些实施方案中，第一导管1822经由股动脉定位在肾动脉中。在一些实施方案中，第二导管1824经由股静脉定位在肾静脉中。在一些实施方案中，第二导管1824是球囊导管，使得球囊可以在肾静脉内膨胀以确保循环通过闭合回路的所有血液均流过第二导管1824。本领域的普通技术人员应了解，球囊导管可以是

LRP系统1800还可以包括一个或多个额外组件，诸如但不限于一个或多个泵(例如，真空泵1848)、一个或多个抽吸机构、一种或多种灌注液及其组合。例如，LRP系统1800可以包括压力导丝和控制台1844，在一些实施方案中，所述压力导丝和控制台操作性地联接到膜式氧合装置1820或者是所述膜式氧合装置的一部分。压力导丝和控制台1844和ECMO泵控制台1846可一起使用以通过连续地监测肾动脉压力来控制灌注速率(即，流速)并确保安全性。第一压力传感器和第二压力传感器例如可分别与第一导管1822和第二导管1824共同插入，以分别测量肾动脉和肾静脉的压力。LRP系统1800还被描绘为包括BGA监测器1830，所述BGA监测器操作性地联接到膜式氧合装置1820以测量例如在经由第一导管1822灌注之前和/或在通过第二导管1824收集灌注液之后灌注液(例如当灌注液含有血液时)中的气体浓度。膜式氧合装置1820和一个或多个额外组件可放置于第一导管1822与第二导管1824之间。

在一些实施方案中，LRP系统1800包括用于排空膀胱1812的第三导管1826。在一些实施方案中，第三导管1826是用于阻止流体从膀胱1812泄漏的球囊导管。流量测量装置1842可用于测量在LRP程序期间从膀胱1812排出的尿液量。在一些实施方案中，流体源1840可用于通过经由流体管线1841将流体注入闭合回路中来置换从灌注液中丢失的排出的流体量。在一些实施方案中，所述流体与灌注液相同，或不全部具有灌注液的组分(例如，没有额外药物)。在一些实施方案中，所述流体是生理上可接受的溶液(例如，盐水溶液)。

在一些实施方案中，LRP系统1800可以经过修改以在患者的各个肾内同时建立闭合回路。在一些实施方案中，两个单独的LRP系统可用于患者的每个肾。

在一些实施方案中，在建立闭合回路时，可经由患者的全身循环灌注一种或多种药物。例如，如果药物具有肾毒性或潜在地对肾脏有害，但又需要全身递送，则建立穿过肾脏的闭合回路以将肾灌注与全身灌注隔离将有利于防止或减少药物暴露于肾脏。

图19是膜式氧合装置1820的示意图，所述膜式氧合装置可用于氧合灌注液，将灌注液与其他组分(例如药物)混合，从灌注液移除二氧化碳和/或将灌注液推入第一导管1822中。膜式氧合装置1820可以是用氧气交换血液中所包含的二氧化碳的任何可商购的ECMO装置。

如图19中所示，膜式氧合装置1820包括各种部件，包括热交换器1856(灌注液在离开出口1852并进入第一导管1822之前通过热交换器)、递送泵1858、储槽1860(用于将诸如血液和/或药物之类组分添加到经由进口1854经第二导管1824传回的灌注液中)、在闭合回路各个阶段处的传感器1862和1864(例如用于测量压力和/或血气含量)以及膜式氧合器1866。在一些实施方案中，脱氧合血液进入膜式氧合器1866并与富氧气体混合。富氧气体可以由气体掺混机1868供应，所述气体掺混机可以将氧气与二氧化碳和氮气以各种比率混合，并通过气体调节器1870调节。

灌注液可以包含一种或多种血液(或其组分，诸如血浆或血清)和/或适于治疗肾脏疾患的药物和/或诸如盐水或右旋糖溶液之类的媒剂。递送泵1858可将灌注液递送到第一导管1822中。在一些实施方案中，灌注液可容纳在IV袋或注射器中并且可在递送泵1858存在或不存在下直接施用给第一导管1822。

可使用抽吸机构对第二导管1824施加负抽吸压力以最大限度地减少血液和/或药物漏出闭合回路之外。负抽吸压力可以是约-150mmHg、约-100mmHg、约-50mmHg、约-20mmHg、约-15mmHg、约-10mmHg、约-5mmHg、0mmHg或在由这些点中的任一者限定的子范围内。

循环通过闭合回路的血液可以是自体血液、来自供体的相配血液或其组合。在一些实施方案中，血液组分，诸如血清或血浆，是根据一个或多个参数进行选择。一个参数可以是存在或不存在所选抗体。例如，当药物是一个或多个包含治疗性核酸序列的病毒载体时，可对患者的自体血液进行筛选以确定是否存在针对所述一个或多个病毒载体的抗体。患者的自体血液中抗体的存在可能会减小和/或完全抵消治疗效用和/或可能会引起不合需要的免疫反应。因此，可以用来自供体的呈血清反应阴性的相配血液稀释或置换患者的自体血液，由此减少患者对药物的免疫反应并增强药物的效用。

尽管图19中所示的各个部件示出作为膜式氧合装置1820的部分或与所述膜式氧合装置分开的部件，但应理解，此示意图仅为示例性的，因为一个或多个部件可包括在膜式氧合装置1820中或与所述膜式氧合装置分开(在其外部)。

LRP系统1800可设置和操作如下：(1)将回收导管(例如，第二导管1824)小心地放置并且紧密地密封于肾静脉中以便能够收集脱氧合静脉血；(2)将灌注导管(例如，第一导管1822)以密封方式放置在肾动脉中；(3)将额外的回收导管(例如，第三导管1826)以密封方式插入膀胱中、插入输尿管中或以上两种情况；(4)接着，使用标准管将灌注导管和回收导管连接到膜式氧合装置1820的动脉和静脉管线；(5)开始LRP系统1800的操作，并对肾动脉顺行性灌注氧合血液，同时使用平缓负压，经由回收导管从肾静脉收集传回的脱氧合血液；(6)接着，将血液引导到储槽1860中并且随后通过膜式氧合装置1866氧合，并经由第一导管1822顺行性再输注(由递送泵1858驱动)到肾脏中；以及(7)接着，使用流量测量装置1842来测量经膀胱排泄的流体量并且通过流体源1840用灌注液来置换。如果施用药物(例如载体)，则此可经由储槽1860在填装血液或血浆之后添加到灌注液中，并且可获取血液样本，或者可在整个灌注程序期间经由储槽1860施加药物。

在一些实施方案中，用来自供体的呈血清反应阴性的相配血液稀释或置换患者的含抗体自体血液(例如，通过去除静脉血并且用无抗体的血液冲洗来交换系统中循环的体积以减少所使用的病毒载体特定的循环抗体的量)可以减少不良免疫反应和/或改善药物功效。例如，相较于未经历自体血液稀释或置换的患者的免疫反应，在用来自供体的呈血清反应阴性的相配血液稀释或置换自体血液后，患者免疫反应的不幸可减少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％，或完全缓解。相较于药物在未经历自体血液稀释或置换的患者体内的功效，在用来自供体的呈血清反应阴性的相配血液稀释或置换自体血液后，施用的药物的功效可增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％或约500％。

在一些实施方案中，灌注液的血液部分可以在以下范围内：约5mL至约5000mL、约50mL至约2500mL、约100mL至约1000mL、约150mL至约500mL、约50mL、约75mL、约100mL、约125mL、约150mL、约175mL、约200mL、约225mL、约250mL、约275mL、约300mL、约325mL、约350mL、约375mL、约400mL、约425mL、约450mL、约475mL、约500mL、约550mL、约600mL、约650mL、约700mL、约750mL、约800mL、约850mL、约900mL、约950mL或约1000mL。

循环通过闭合回路的血液中自体血液与来自供体的相配血液的比率可根据需要进行调整以获得对于药物最易于接受并且在引入药物后会产生最少免疫反应的血液混合物。在一些实施方案中，所述比率可能是在以下范围内：约1:100至约100:1、约1:80至约80:1、约1:50至约50:1、约1:30至约30:1、约1:20至约20:1、约1:10至约10:1、约1:8至约8:1、约1:5至约5:1、约1:3至约3:1、或约1:2至约2:1的(自体血液体积):(来自供体的相配血液的体积)。

通过闭合回路的灌注液的流速可被调整为匹配患者的血液流速。本领域的普通技术人员应了解，血液流速随不同患者而变化，并且对于任何给定患者，一天中都在变化。因此，循环通过闭合回路的灌注液的流速可在原位进行调整。流速可在闭合回路内测量。在某些实施方案中，流速可用穿音速探针(诸如在管路上的夹钳)来测量。在一些实施方案中，在灌注期间的任何给定时间，灌注液的流速以mL/min为单位计可在患者的血液流速的约20％范围内、约15％范围内、约10％范围内、约8％范围内、约5％范围内、约3％范围内、约2％范围内、约1％范围内或约0.5％范围内。重要的是，循环通过闭合回路的灌注液的流速不明显偏离患者自身的血液流速，以避免局部缺血和/或灌注不足。

循环通过闭合回路的灌注液的示例性流速可以在但不限于以下范围内：约75mL/min至约750mL/min、约100mL/min至约650mL/min、约125mL/min至约600mL/min、约150mL/min至约500mL/min、约175mL/min至约400mL/min、约200mL/min至约300mL/min、约150mL/min、约175mL/min、约200mL/min、约225mL/min、约250mL/min、约275mL/min、约300mL/min、约325mL/min或约350mL/min。在一些实施方案中，所述系统将闭合回路中的灌注液的流速维持为每肾脏约500mL/min/1.73m

灌注液可循环通过闭合回路，持续时间的范围可以是但不限于约5分钟至约5小时、约15分钟至约4小时、约30分钟至约3小时或约1小时至约2小时。在一些实施方案中，治疗持续时间可以在数天内发生，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天等。

利用本文所公开的系统，在一些实施方案中，可以将比原本可经由全身递送安全地施用的剂量高的剂量的药物直接并且仅对一个或两个肾脏施用。在一些实施方案中，由于灌注液基本上没有漏出到一个或两个肾脏之外，因此可能需要较低的总体药物剂量来达到相同的治疗作用(与经历全身循环或仅经历肾脏循环的部分隔离的较大剂量所达到的治疗作用相同)。

在一些实施方案中，循环通过闭合回路的灌注液(例如血液和/或药物)中小于约50％v/v、小于约40％v/v、小于约30％v/v、小于约20％v/v、小于约15％v/v、小于约10％v/v、小于约5％v/v、小于约4％v/v、小于约3％v/v、小于约2％v/v、小于约1％v/v、小于约0.5％v/v或基本上不会(0％v/v)在灌注程序期间漏出闭合回路之外。

漏出闭合回路之外的灌注液减少(相较于此项技术中所公开的其他方法)可能是由于在闭合回路内形成的紧密密封和闭合回路中所利用的每一个别部件。

在某些实施方案中，仍可能有一些灌注液从闭合回路漏出。例如，循环通过闭合回路的灌注液中至多约0.5％v/v、约1％v/v、约2％v/v、约3％v/v、约4％v/v、约5％v/v、约10％v/v、约15％v/v、约20％v/v、约30％v/v、约40％v/v或约50％v/v可漏出闭合回路之外。经由灌注液漏出而损失的任何药物量均可以用灌注液置换，以便在计算出的暴露时间内保持药物始终暴露于肾脏。在某些实施方案中，计算出的暴露时间范围可为约5分钟至约5小时、约15分钟至约4小时、约30分钟至约3小时、约1小时至约2小时或在其间的任何子范围内。

治疗性组合物

适于治疗肾脏疾患的药物(即，灌注液中所包括的药物)可包括治疗性多核苷酸序列。在一些实施方案中，治疗性多核苷酸序列可编码用于治疗肾脏疾患的蛋白质。用于治疗肾脏疾患的蛋白质可以是人类来源的或可来源于不同物种(例如不限于小鼠、猫、猪或猴)。在一些实施方案中，由所述治疗性多核苷酸序列编码的蛋白质可对应于人肾脏中表达的基因。

示例性蛋白质可包括但不限于NPHP1、PKD2、其变异体或其组合。所用的一种或多种蛋白质还可以是本文中所提及的蛋白质的功能变异体并且与原始蛋白质相比可以展现出相当大的氨基酸序列一致性。例如，氨基酸一致性可合计为至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。在此情形下，术语“功能变异体”表示蛋白质的变异体能够部分或完全实现天然存在的相应蛋白质的功能。蛋白质的功能变异体可以包括例如由于一个或多个氨基酸取代、缺失或添加而与其天然存在的对应物不同的蛋白质。

氨基酸取代可以是保守性或非保守性的。优选地，取代是保守性取代，即，氨基酸残基被充当功能等效物的具有类似极性的氨基酸取代。优选地，用作取代物的氨基酸残基是选自与待取代的氨基酸残基相同的氨基酸群组。例如，疏水性残基可被另一疏水性残基取代，或极性残基可被具有相同电荷的另一极性残基取代。可用于保守性取代的功能同源的氨基酸包括例如非极性氨基酸，诸如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。不带电极性氨基酸的示例包括丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸和半胱氨酸。带电极性(碱性)氨基酸的示例包括组氨酸、精氨酸和离氨酸。带电极性(酸性)氨基酸的示例包括天冬氨酸和谷氨酸。

因一个或多个(例如2、3、4、5、10或15个)额外氨基酸而不同于其天然存在的对应物的蛋白质也被视为变异体。这些额外氨基酸可存在于原始蛋白质的氨基酸序列内(即，作为插入物)，或它们可添加到蛋白质的一个或两个末端中。基本上，如果添加氨基酸不会削弱多肽在所治疗的受试者中实现天然存在的蛋白质的功能的能力，则插入可在任何位置进行。此外，蛋白质的变异体还包括与原始多肽相比缺乏一个或多个氨基酸的蛋白质。此类缺失可能会影响任何氨基酸位置，只要它不会削弱实现蛋白质的正常功能的能力。

最后，目标蛋白质的变异体还指因结构修饰诸如经修饰的氨基酸而不同于天然存在的蛋白质的蛋白质。经修饰的氨基酸是通过天然方法，诸如处理或转译后修饰或通过此项技术中已知的化学修饰方法修饰的氨基酸。典型氨基酸修饰包括磷酸化；糖基化；乙酰化；O连接的N-乙酰基葡萄糖胺化；谷胱甘肽化；酰化；分支化；ADP核糖基化；交联；二硫桥形成；甲酰化；羟基化；羧化；甲基化；去甲基化；酰胺化；环化；和/或与磷脂酰肌醇、黄素衍生物、脂壁酸、脂肪酸或脂质共价或非共价键结。

编码目标蛋白质的治疗性多核苷酸序列可以以基因疗法载体(即,核酸构筑体)形式向待治疗的受试者施用，所述核酸构筑体包含紧邻提供外源核酸的表达所需的其他序列，诸如启动子、kozak序列、聚腺苷酸信号以及其类似序列的编码序列，包括转译和终止密码子。

例如，基因疗法载体可以是哺乳动物表达系统的一部分。有用的哺乳动物表达系统和表达构筑体是可商购的。另外，若干哺乳动物表达系统是由不同制造商经销并且可用于本发明中，诸如基于质体或病毒载体的系统，例如LENTI-Smart

用于表达本发明的外源治疗性多核苷酸序列的基因疗法载体可以是例如病毒或非病毒表达载体，所述表达载体适于将外源治疗性多核苷酸序列引入细胞中以用于随后表达由所述核酸编码的蛋白质。表达载体可以是游离型载体，即，能够自主地在宿主细胞内自我复制的载体；或整合载体，即，稳定并入细胞基因组中的载体。宿主细胞中的表达可以是组成型或调节型(例如诱导型)的。

在某一实施方案中，基因疗法载体是病毒表达载体。用于本发明的病毒载体可以包括病毒基因组，其中一部分天然序列已缺失以便引入异源多核苷酸，而不会破坏病毒的感染性。由于病毒组分与宿主细胞受体之间的特异性相互作用，病毒载体特别适于将基因有效转移到目标细胞中。适于促进基因转移到哺乳动物细胞中的病毒载体可来源于不同类型的病毒，例如AAV、腺病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、牛乳头状瘤病毒、慢病毒、牛痘病毒、多瘤病毒、仙台病毒、正粘病毒、副粘病毒、乳多泡病毒、微小RNA病毒、痘病毒、α病毒或适于基因疗法的任何其他病毒穿梭体、其变异体及其组合。

“腺病毒表达载体”或“腺病毒”意欲包括含腺病毒序列的构筑体，所述腺病毒序列足以(a)支持治疗性多核苷酸序列构筑体的包装，和/或(b)最终表达其中选殖的组织和/或细胞特异性构筑体。在本发明的一个实施方案中，表达载体包含经基因工程改造的形式的腺病毒。了解腺病毒(36千碱基(kb)的线性双股DNA病毒)的遗传组织允许用至多7kb的外来序列取代大片段腺病毒DNA。

腺病毒生长和操作是本领域的技术人员已知的，并且在活体外和活体内展现出较宽宿主范围。该组病毒可以以高效价例如10

反转录病毒(又称为“反转录病毒载体”)可能会由于它们能够将其基因整合到宿主基因组中、转移大量外来遗传物质、感染广谱物种和细胞类型和用于包装在特殊细胞系中而被选择作为基因递送载体。

反转录病毒基因组含有三个基因，即gag、pol和env，分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分。在gag基因上游发现的序列含有用于将基因组包装到病毒粒子中的信号。两个长末端重复(LTR)序列存在于病毒基因组的5'和3'端。这些序列含有强启动子和强化子序列并且也是整合在宿主细胞基因组中所需的。

为了构筑反转录病毒载体，将编码所关注基因的核酸代替某些病毒序列插入到病毒基因组中，以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，构筑含有gag、pol和/或env基因但没有LTR和/或包装组分的包装细胞系。当将含有cDNA以及反转录病毒LTR和包装序列的重组质体引入此细胞系中(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列允许将重组质体的RNA转录物包装在病毒颗粒中，所述病毒颗粒接着分泌到培养基中。接着，收集含有重组反转录病毒的培养基，任选地浓缩并且用于基因转移。反转录病毒载体能够感染广泛多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞分裂。

反转录病毒可来源于任何亚科。例如，可以使用来自鼠肉瘤病毒、牛白血病、病毒劳斯肉瘤病毒、鼠白血病病毒、貂细胞灶诱导病毒、网状内皮细胞增生病病毒或禽类白血病性病毒的载体。本领域的技术人员将能够组合来源于不同反转录病毒的部分，诸如LTR、tRNA结合位点和包装信号，以提供重组反转录病毒。这些反转录病毒接着通常用于产生转导胜任性反转录病毒载体颗粒。出于此目的，将载体引入适合的包装细胞系中。还可以通过将嵌合整合酶并入反转录病毒颗粒中来构筑反转录病毒以便位点特异性整合到宿主细胞的DNA中。

因为单纯疱疹病毒(HSV)是亲神经性的，所以它已在治疗神经系统病症中获得大量关注。此外，HSV在非分裂神经元细胞中产生潜伏感染而不会整合到宿主细胞染色体中或以其他方式改变宿主细胞的代谢的能力，以及在潜伏期期间具有活性的启动子的存在使得HSV成为有吸引力的载体。此外，尽管许多关注都集中于HSV的亲神经性应用，但考虑到其较宽的宿主范围，该载体也可以用于其他组织。

使HSV成为有吸引力载体的另一个因素是基因组的大小和组织。因为HSV很大，所以与其他较小病毒系统相比，并入多个基因或表达盒更不成问题。另外，与其他系统中相比，具有不同性能(时间、强度等)的不同病毒控制序列的可获得性使得有可能在较大程度上控制表达。还有一个优点是所述病毒具有相对较少的剪接消息，进一步便于进行遗传操作。

HSV还相对易于操作并且可生长达到高效价。因此，就获得足够感染倍率(MOI)所需的体积和减少重复给药的需求两个方面而言，递送不成问题。已研发出HSV的无毒变异体并且所述变异体可容易地用于基因疗法情形中。

慢病毒是复杂的反转录病毒，除含有共有的反转录病毒基因gag、pol和env以外，慢病毒还含有其他具有调节或结构功能的基因。较高的复杂度使得病毒能够调节其生命周期，如在潜伏感染过程中。慢病毒的一些示例包括人类免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体已通过多次减弱HIV致病性基因产生，例如基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失使得载体在生物学上为安全的。

慢病毒载体是基于质体或基于病毒的，并且经过构形以携带用于并入外来核酸、用于选择和用于将核酸转移到宿主细胞中的必需序列。所关注载体的gag、pol和env基因也是此项技术中已知的。因此，将相关基因选殖到所选载体中并且接着用于转型所关注的目标细胞。

牛痘病毒载体由于其构筑容易、获得的表达量相对较高、较宽的宿主范围和有较大容量用于携带DNA而被广泛使用。牛痘含有约186kb的线性双股DNA基因组，该基因组展现出明显的“A-T”偏好。约10.5kb的反向末端重复序列侧接所述基因组。大部分必需基因看起来是在中心区域内定位，这在痘病毒中具有极高保守性。估计牛痘病毒的开放阅读框数目为150到200个。尽管编码两个股，但阅读框的大量重叠并不常见。

可以将至少25kb插入牛痘病毒基因组中。原型牛痘载体含有经由同源重组插入到病毒胸苷激酶基因中的转殖基因。载体是基于tk表型进行选择。包括脑心肌炎病毒的非转译前导序列产生比常规载体高的表达量，其中转殖基因在24小时内积累10％或更多的受感染细胞的蛋白质。

乳多泡病毒(诸如小鼠多瘤病毒)的空衣壳已作为用于基因转移的可能载体而引起关注。空多瘤病毒的使用最先是在无细胞系统中培育多瘤病毒DNA和经纯化空衣壳时描述。新颗粒的DNA受到保护而免于胰脏脱氧核糖核酸酶的作用。使用经重构颗粒将转型多瘤病毒DNA片段转移到大鼠FIII细胞。空衣壳和经重构颗粒由全部三种多瘤病毒衣壳抗原VP1、VP2和VP3组成。

AAV是属于依赖病毒属的小病毒。它们是无包膜的小单股DNA病毒，需要辅助病毒才能进行复制。需要与辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)共感染以形成功能完整的AAV病毒粒子。在活体外，在不存在与辅助病毒共感染的情况下，AAV产生病毒基因组以游离型形式存在但不产生感染性病毒粒子的潜伏状态。随后通过辅助病毒的感染“拯救”基因组，允许其复制并且包装于病毒衣壳中，由此重构感染性病毒粒子。最新数据表明，活体内野生型AAV和重组AAV都主要以较大游离型串联体形式存在。在一个实施方案中，本文中所使用的基因疗法载体是AAV载体。AAV载体可以是经纯化的复制非胜任型假型rAAV颗粒。

AAV不与任何已知人类疾病相关，一般不被视为致病性的，并且看起来在整合后不会改变宿主细胞的生理特性。AAV可感染广泛范围的宿主细胞，包括非分裂细胞，并且可感染来自不同物种的细胞。相比于通过细胞和体液反应两者快速清除或不活化的一些载体，已表明AAV载体在活体内在各种组织中诱导持久转殖基因表达。重组AAV介导的转殖基因在活体内在非分裂细胞中的续存可能是由于缺乏天然AAV病毒基因和载体的与ITR关联的形成游离型串联体的能力。

AAV是用于本发明的细胞转导的有吸引力的载体系统，因为它作为游离型串联体具有高频续存性并且它可以感染非分裂细胞，包括心肌细胞，由此使其可用于将基因递送到哺乳动物细胞中，例如在组织培养物中和在活体内。

通常，rAAV是通过共转染含有侧接两个AAV末端重复序列的所关注基因的质体和/或含有野生型AAV编码序列并且无末端重复序列的表达质体(例如pIM45)来制造。细胞还被腺病毒和/或携带AAV辅助功能所需的腺病毒基因的质体感染和/或转染。以此类方式制造的rAAV的储备液被腺病毒污染，腺病毒必须与rAAV颗粒以物理方式分离(例如通过氯化铯密度离心或管柱层析)。另选地，可使用含有AAV编码区的腺病毒载体和/或含有AAV编码区和/或一些或全部腺病毒辅助基因的细胞系。还可以使用携带rAAV DNA作为整合的原病毒的细胞系。

自然界中存在多种AAV血清型，具有至少十二种血清型(AAV1-AAV12)。尽管具有高度同源性，但不同血清型对不同组织具有趋向性。在转染后，AAV仅在宿主中引发次要免疫反应(若存在)。因此，AAV特别适合于基因疗法方法。

在一些实施方案中，本公开可针对一种药物，所述药物包含AAV载体，所述AAV载体为以下中的一者或多者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、ANC AAV、来源于其的嵌合AAV、其变异体及其组合，所述AAV载体将甚至更佳地适于所关注组织中的高效转导。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型1载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型2载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型3载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型4载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型5载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型6载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型7载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型8载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型9载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型10载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型11载体。在某些实施方案中，基因疗法载体是AAV血清型12载体。

适用于人类的AAV的剂量可在以下范围内：约1×10

利用本文所公开的系统和方法，在一些实施方案中，由于灌注液基本上不会漏出到肾脏之外，因此可以将比原本可经由全身递送安全地施用的剂量高的剂量的药物直接并且仅对肾脏施用。在不解释为限制性的情况下，认为AAV毒性可能是由于全身作用，诸如肝毒性、血小板活化和损失以及补体活化和损失。所有这些毒性和其他影响可经由本文所公开的方法和系统中所描述的局部区域灌注液施加而减少、减到最少或完全避免。因此，至多约5×10

除病毒载体之外，还可以使用非病毒表达构筑体将编码目标蛋白质或其功能变异体或片段的基因引入患者细胞中。允许目标细胞中蛋白质的活体内表达的非病毒表达载体包括例如质体、经修饰的RNA、mRNA、cDNA、反义寡聚物、DNA-脂质复合物、纳米颗粒、胞外体、适用于基因疗法的任何其他非病毒穿梭体、其变异体及其组合。

除病毒载体和非病毒表达载体之外，核酸酶系统还可以与载体和/或电穿孔系统结合使用以进入患者的细胞中并且在其中引入编码目标蛋白质或其功能变异体或片段的基因。示例性核酸酶系统可以包括但不限于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)、DNA切割酶(例如Cas9)、大范围核酸酶、TALEN、锌指核酸酶、适于基因疗法的任何其他核酸酶系统、其变异体及其组合。例如，在一个实施方案中，一个病毒载体(例如AAV)可用于核酸酶(例如CRISPR)并且另一病毒载体(例如AAV)可用于DNA切割酶(例如Cas9)，以将(核酸酶和DNA切割酶)两者引入目标细胞中。

可用于将编码治疗性基因的治疗性多核苷酸序列递送到细胞中的其他载体递送系统是受体介导的递送媒剂。这些受体介导的递送媒剂利用通过受体介导的内饮作用在几乎所有真核细胞中进行的大分子的选择性吸收。由于各种受体的细胞类型特异性分布，递送可具有高度特异性。受体介导的基因靶向媒剂可包括两种组分：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。

适用于将非病毒载体转移到目标细胞中的方法是例如脂质转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-聚葡萄糖法和使用微玻璃管、超声波、电穿孔及其类似方法的直接DNA引入法。在引入载体之前，可用渗透剂处理肾脏细胞，所述渗透剂诸如磷脂酰胆碱、链球菌溶血素、癸酸钠、癸酰肉碱、酒石酸、溶血卵磷脂、Triton X-100及其类似物。还可以使用胞外体转移裸DNA或AAV衣壳化DNA。

本发明的基因疗法载体可包含与编码目标蛋白质的核酸序列功能性连接的启动子。启动子序列应为紧密的并且确保较强表达。优选地，启动子提供已使用基因疗法载体治疗的患者的肾脏中目标蛋白质的表达。在一些实施方案中，基因疗法载体包含可操作地连接到编码目标蛋白质的核酸序列的肾脏特异性启动子。如本文所使用，“肾脏特异性启动子”是指在肾脏细胞中的活性比任何其他非肾脏细胞类型中的活性高至少2倍的启动子。优选地，适合用于本发明的载体中的肾脏特异性启动子在肾脏细胞中的活性比其在非肾脏细胞类型中的活性要高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍。此外，肾脏特异性启动子可以是肾脏的特定子单元(例如，近端小管、远端小管、肾小球等)特定的以在该特定子单元中提供较高或专有表达。

肾脏特异性启动子可以是所选人类启动子，或包含与所选人类启动子具有至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性的功能等效序列的启动子。示例性非限制性启动子可以包括肾特异性钙粘蛋白(KSPC)、Na

可用于本发明的载体可具有不同转导效率。因此，病毒载体或非病毒载体转导超过、等于或至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％的目标血管部位的细胞。可同时或依序使用超过一种载体(病毒或非病毒载体，或其组合)。此可用于转移超过一个多核苷酸，和/或靶向超过一种细胞类型。当使用多种载体或多种试剂时，可产生超过一种转导/转染效率。

含有基因疗法载体的医药组合物可制备为液体溶液或悬浮液形式。本发明的医药组合物可以包括常用的医药学上可接受的赋形剂，诸如稀释剂和载剂。明确地说，所述组合物包含医药学上可接受的载剂，例如水、盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。除载剂以外，医药组合物还可以含有乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、染料及其类似物。

在某些实施方案中，医药组合物将包含治疗有效的基因剂量，所述剂量是能够预防或治疗受试者的肾脏疾患，而对受试者无毒的剂量。肾脏疾患的预防或治疗可以按与肾脏疾患相关联的表型特征的变化评定，其中此类变化可有效预防或治疗肾脏疾患。因此，治疗有效的基因剂量通常是当以生理上可耐受的组合物形式施用时足以改善或预防所治疗受试者的致病性肾脏表型的基因剂量。

说明性示例

阐述以下示例以帮助理解本公开，并且所述示例当然不应视为特定地限制本文所描述和主张的实施方案。实施方案的此类变化，包括将在本领域技术人员的能力范围内的目前已知或之后研发的所有等效物的替代，以及调配物的变化或实验设计的微小变化，将被认为在并入本文中的实施方案的范围内。

下文讨论的LRP系统包括以下组件：用于对肾动脉进行闭塞性顺行灌注的经皮动脉导管(经由股动脉进入)；用于闭塞肾静脉以及使静脉血返回到LRP系统的经皮静脉导管(经由颈静脉进入)；以及ECMO装置，其具有储槽及相关联管件以在LRP系统中提供氧气以及从血液中去除二氧化碳。在用氧合血液对动脉进行顺行灌注时开始LRP程序，同时经由静脉导管从静脉系统收集返回的脱氧合血液。血液随后被收集在储槽中、进行氧合并且经由动脉导管顺行再输注到器官中。在整个程序期间，经由储槽，可以采集血液样本，或者可以引入药物。

示例1：LRP程序

利用图18中所示并且关于图18描述的LRP系统1800，对猪执行LRP。这些示例中使用的附件装置列于表1中，包括其预定用途以及在根据本公开的实施方案的LRP系统中的用途。

表1：用于LRP程序的装置

定制导管用作静脉回收导管，并且包括以下尺寸：19Fr(6.3mm)的截面外形；12Fr(4.0mm)的内径；80cm的可用长度；25mm的球囊直径；以及20mm的顶端长度(类似于图1-3中示出及关于图1-3描述的示例性定制导管)。所述材料包括：作为轴的Pebax 63，由牢固的不锈钢编织物支撑；作为球囊的顺应性Chronoprene 25A；以及在顶端中的Pebax 35，装载有BaSO

图20包括示出动脉导管和静脉导管分别在猪肾的肾动脉和肾静脉中的成功放置的放射线像片。在下部图像中，静脉注射造影剂，从而显露肾脏脉管系统和闭合系统的整体密封性。

现在描述在本示例中遵循的LRP程序的详细方案：

(1)将研究的动物放成背侧卧；

(2)使研究的动物为血管内导管插入术作好准备；

(3)通过血管造影术，利用最小锐角来评估肾静脉与颈静脉通路和腹股沟通路的角；

(4)用Stryker FlowGate

(5)使用上述定制静脉导管进入静脉循环(侧和进入点：将基于各个动物来确定)；

(6)在开放配置下将导管放到其最终位置(即，球囊向下)以便注射一些造影液以及使肾脏循环视觉化；

(7)将导管放到主动脉和腔静脉中，直到程序开始；

(8)将压力导丝X穿过Flowgate

(9)通过除气和用盐水灌注使ECMO系统作好准备；将静脉管路和动脉管路连接到ECMO，同时夹紧静脉管路和动脉管路，以避免引入空气；

(10)开启ECMO泵；

(11)松开静脉管路；

(12)开始用盐水交换血液；如果一切都稳定，那么松开动脉管路并建立LRP回路；静脉侧上的抽吸力是可变的并且针对需要来进行调整(例如，-50mmHg至0)；

(13)将静脉导管放到肾动脉中的适当位置；

(14)对球囊充气；

(15)通过造影剂注射来检查导管的密封性和定位；

(16)如果动物是稳定的，那么：

a.用Flowgate

b.通过造影剂注射来检查导管的密封性和位置；检查肾脏中的压力；检查肾脏与全身压力比(目标大于1)；检查储槽体积；检查ECMO泵的RPM；以及检查导管的流量；

(17)如果在5分钟内一切都稳定，那么：

a.开始以2μg/kg体重/min的速率通过动脉管路输注三硝酸甘油；

b.检查肾脏中的压力；检查肾脏与全身压力比(目标大于1)；检查储槽体积；检查ECMO泵的RPM；以及检查导管的流量；

(18)如果在5分钟内一切都稳定，那么：

a.开始用注射到储槽中的基因治疗药物进行治疗；

b.对于第一动物组(组B1)：施用5.0E+13vg的剂量(通过用2.2mL的载剂以2.8E+13vg/mL的滴定度稀释1.8mL的载体溶液)；

c.对于第二动物组(组B2)：施用6.0E+14vg的剂量(等同于2.8E+13vg/mL滴定度下的21.4mL的载体溶液)；

(19)继续进行肾脏LRP 60分钟；

(20)每隔5分钟，检查肾脏中的压力；检查肾脏与全身压力比(目标大于1)；检查储槽体积；检查ECMO泵的RPM；以及检查导管的流量；检查所有血液动力学和心血管参数(压力，HR)；

(21)检查在程序开始之后的t＝0、15、30、45和60分钟时的尿排出量；

(22)请注意LRP储槽体积，因为可能会由于膈静脉、性腺静脉和肾上腺静脉而发生满溢，或者由于尿液生成而发生体积损失；可以动态地管理这些体积偏差；

(23)在t＝0、5、15、30、45和60分钟时：

a.从外周血收集血液样本以进行脱落分析；

b.从LRP系统收集血液样本以进行载体传染性分析；以及

c.从LRP系统收集血液样本以进行脱落分析；

(24)在60分钟的肾脏LRP结束时：

a.中止三硝酸甘油；

b.对球囊充气；以及

c.解开导管；

(25)将整个LRP回路、储集器、血液泵和导管丢弃在适当的生物安全的垃圾箱中；

(26)即刻进行术后护理，包括但不限于压缩和施用鱼精蛋白；

以上程序证明了使用密封的闭合回路对肾脏进行LRP可以持续至少60分钟。未观察到严重后遗症，并且在LRP程序之后即刻进行的靛卡红试验表明肾功能正常/未受该程序影响。

示例2：生物分布研究

图21是示出在以6.2E+14vg/kg的较高剂量进行了60分钟的LRP之后0.05-0.25vg/dg(每二倍体基因组的载体基因组拷贝数)的肾脏转导和生物分布的图。未检测到未经治疗的肾脏、肝脏或其他器官的显著污染，这证明了LRP闭合回路的密封性。

还对静脉内注射的对照动物进行了试验。发现肾脏LRP在测量的不同部位上导致更均匀的转导剖面，而IV对照组展现了在肾脏的皮质部位中的优先转导。肾脏LRP与IV对照组相比，肝脏中的转导明显更少，其中对于IV对照组，在肝脏中检测到17.2vg/dg，而对于肾脏LRP，在肝脏中几乎没有观察到转导。

示例3：载体量化

图22A和图22B示出了在高剂量(6.2E+14VG/kg，图22A)和低剂量(5.6E+13VG/kg，图22B)情况下在肾脏LRP期间的各个时间点测得的每mL血浆的载体基因组。结果显示载体在60分钟内长时间保持在LRP回路中(低载体脱落)、载体较低程度地暴露于全身循环以及载体极少泄漏到尿液中(图22A)。载体暴露于肾脏似乎是在整个程序期间被最大化。

图23A是两种不同的动物(LRP-1和LRP2)在肾脏LRP治疗后数天的C3a水平的图。图23B是各种样本稀释的转导抑制百分数的图。该两幅图均显示了对于该两种动物抗AAV中和因子均保持为低，并且在肾脏LRP之后不存在补体激活。

图24A和图24B分别是在肾脏LRP期间的流速和泵速度的图，显示了在整个程序期间约310mL/min的基本上恒定的流速。

这些示例使用临床相关的动物模型证明了AAV靶向递送到肾脏，导致均匀的转基因生物分布。本文描述和举例的实施方案通过将全身有害作用降至最少、显著减少所需载体剂量、克服免疫限制以及还有可能进行重复治疗来使得能够开发出用于肾脏的下一代先进疗法。还设想到，LRP系统和方法的用途可用于其他治疗剂和策略。

在前述描述中，阐述诸如特定材料、尺寸、工艺参数等众多具体细节，以提供对本发明的透彻理解。在一个或多个实施方案中，特定特征、结构、材料或特性可以用任何适合方式组合。“示例”或“示例性”一词在本文用以表示充当示例、例子或例示。不必将本文中描述为“示例”或“示例性”的任何方面或设计理解为比其他方面或设计更佳或有利。实际上，使用词语“示例”或“示例性”仅意欲以具体方式呈现概念。如本申请中所使用，术语“或”意欲表示包括性的“或”，而非排他性的“或”。即，除非另外说明，或根据上下文显而易见，否则“X包括A或B”意欲表示天然包括性排列中的任一者。即，如果X包括A；X包括B；或X包括A和B二者，则在前述情形中的任一者下满足“X包括A或B”。本说明书通篇提及“一实施方案”、“某些实施方案”或“一个实施方案”表示结合实施方案所描述的特定特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇各处出现的词组“一实施方案”、“某些实施方案”或“一个实施方案”未必均指代同一实施方案。

已参考本发明的特定示例性实施方案描述了本发明。因此，应在说明性意义上而非限制性意义上看待说明书和图式。除本文所显示和描述的修改外的本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见，并且其意欲落在所附权利要求书的范围内。