一种羔绵羊睾丸支持细胞及其分离方法和应用

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种羔绵羊睾丸支持细胞，本发明同时还涉及该细胞的分离方法及应用。

背景技术

羊传染性脓包皮炎（Contagious Ecthyma，CE）俗称羊口疮，是由羊口疮病毒（ORFvirus，ORFV）引起的山羊、绵羊、主要羔山羊易感的一种急性、接触性传染病，也是一种人和其他动物均可感染的人畜共患传染病。ORFV主要在内蒙、西藏、新疆、云南、甘肃、四川、宁夏等养羊业密集地区流行，近年来频繁发生于宁夏、内蒙古、新疆、西藏、山东、湖北、云南、陕西和黑龙江、青海等地区。发病羊的嘴唇、口腔黏膜、舌头和鼻孔等部位会出现菜花状增生的典型症状，严重影响其采食和生产，且羊的死亡率也逐年攀升，对养羊业造成重创，而目前控制羊口疮最有效的方法是接种疫苗，因此，从发病羊群中分离鉴定羊口疮病毒，并利用该病毒分离毒株、研制出针对地方性ORFV的有效疫苗，对于羊口疮的预防及治疗具有重要的意义。

对于预防羊口疮疫苗的制备，主要包括以下方面：第一，通过不断分离、培养牛或羊原代细胞，从中分离出羊口疮病毒，然后连续传代进行弱化，进而制备弱毒疫苗；第二、目前也有灭活疫苗研发趋势；第三，由于羊口疮病毒表面覆盖着一个形如小管、纵横交错排列的囊膜覆盖了其抗原表位，导致羊体内产生的中和抗体少，对羊的保护率也较低，鉴于这种免疫学上的特殊性，有研究者用超声波等手段将ORFV的囊膜破坏再制备羊口疮疫苗，但上述几种情况都仅限于实验室研究，并没有在生产上大规模使用。主要原因在于：分离原代细胞费时、费力，费用昂贵，原代细胞传代次数少，培养的羊口疮病毒毒价低，批内生产量小、批间重复性因原代细胞的不同也难以一致。故急需开发传代次数多，培养费用低廉，繁殖病毒滴度较高的细胞，从而为羊口疮病毒的分离、规模化繁殖、工业化生产以及病毒感染致病机制的研究提供工具。

发明内容

本发明的目的是针对以上所述，提供一种用于构建亚克隆细胞系的羔绵羊睾丸支持细胞及其分离方法。

本发明的另一目的是提供上述羔绵羊睾丸支持细胞在羊口疮病毒规模化生产中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种羔绵羊睾丸支持细胞SCST，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏日期：2019年9月22日，保藏编号为CCTCC No.C2019203。

上述羔绵羊睾丸支持细胞SCST的分离方法，包括以下步骤：

步骤1、无菌取出羔羊睾丸，去除外膜，用pH7.0、浓度为0.05mol/L的 PBS缓冲液冲洗后，无菌剪碎，先用0.25%胰酶消化2h，然后用Ⅳ型胶原酶消化0.5-1h，加入1%血清，终止消化，离心，沉淀用含0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液重悬，37℃保温10-30min后过滤，滤液离心，得到的沉淀用含1%小牛血清的营养液重悬，再离心，再用含10%进口胎牛血清的营养液重悬，部分以1.0x10

步骤2、将铺于细胞瓶的细胞次日吸出上层细胞液入另一细胞瓶，加新鲜培养基，第5d时，用0.01-0.05%胰酶消化处理细胞，弃掉细胞液，更换新鲜培养基，反复3-6次后，得到活力旺盛的羔绵羊睾丸支持细胞SCST。

优选地，上述步骤2中，采用0.01-0.05%胰酶消化处理细胞时间为2-3min。

上述羔绵羊睾丸支持细胞SCST的应用方法为：将所述羔绵羊睾丸支持细胞SCST直接用于羊口疮病毒的规模化繁殖；或将羔绵羊睾丸支持细胞SCST转染端粒酶基因使其永生化，然后进行压力粗筛、压力分种以及持续传代，得到羔绵羊睾丸支持细胞亚克隆细胞系，将该亚克隆细胞系用于羊口疮病毒的规模化繁殖。

进一步地，所述压力粗筛、压力分种以及持续传代操作为：

将转染端粒酶基因后的羔绵羊睾丸支持细胞SCST用含200ug/ml G418的培养基培养，待细胞长满后，用含200ug/ml G418的培养基分种细胞，间隔4d换液，持续3w后，细胞长出3-4个类似于单克隆样细胞岛，用0.25%胰酶消化细胞岛，转瓶，一周后用含400ug/mlG418的培养基进行抗性筛选，最终形成1-2个克隆岛，挑取单克隆细胞，采用含200ug/mlG418的培养基分种培养，从第4次分种时，采用含6-8%国产新生牛血清的培养基培养。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了一种羔绵羊睾丸支持细胞SCST，该细胞经过3-6次处理，与常规原代细胞相比，传代次数可由5-20代增加至40代以上。说明本发明通过0.01-0.05%胰酶处理细胞的方式在不影响细胞活力的同时优选出了生长、代谢旺盛细胞，从而使其传代次数进一步提升，对ORFV敏感性也相应增强，解决了原代细胞传代问题。

2、本发明的SCST细胞永生化筛选时，先用含低浓度G418的培养基粗筛，然后用含相同浓度G418的营养液分种，并用含高浓度G418的培养基进行抗性筛选，极大限度的杀死了无抗性和活力较低的细胞，存活并分裂增殖起来的亚克隆细胞系为活力旺盛、抵抗力较强的细胞，该细胞分种率1:4-1:8，与原代细胞1:2的分种率相比，提高了分种率，节约了分种时间，降低了生产成本，适合大批量生产。

3、端粒酶（Telomerase）是人体内一种特殊的具有逆转录活性的核糖核蛋白聚合酶，它可以在细胞内合成端粒DNA，维持端粒的长度，增加细胞的分裂次数，从而使细胞无限增殖。本发明将分离得到的羔绵羊睾丸支持细胞SCST转染端粒酶，筛选得到亚克隆细胞系，该亚克隆细胞系可以用含国产血清的培养基培养，与未转染细胞使用进口胎牛血清培养基相比，降低了生产成本，适合规模化生产应用。

4、本发明提供的亚克隆细胞系与常规原代细胞相比，能够明显提高羊口疮病毒的分离率，其一羊口疮病毒致亚克隆细胞系的病变时间比致常规原代细胞病变时间明显缩短（如图5），其二亚克隆细胞系分离病毒的拷贝数比原代细胞提高100倍以上（见实施例5）。

附图说明

图1为SCST细胞永生化后亚克隆细胞图；

图2为SCST细胞分离、处理、永生化及筛选等各阶段细胞图：A组为0.01-0.05%胰酶依次处理后的细胞；B组为200μg/ml 的G418处理及分种后的细胞；C组为400μg/ml 的G418处理后的细胞；

图3为亚克隆细胞系的核型：A为低倍显微镜下核型；B为油镜下核型；

图4为羔绵羊睾丸支持细胞SCST鉴定图：A为波形蛋白间接免疫之后对照；B为支持细胞表达波形蛋白荧光图。

图5为SCST-D细胞接种ORFV后发生CPE对照图：A为SCST细胞；B为SCST-D细胞，C为SCST接种LSDV第2d发生CPE情况；D为SCST-D接种ORFV第2d发生CPE情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明中所有以%表示的含量均为质量百分含量。消化液为常规细胞消化液，营养液为常规动物细胞营养液。所用羔绵羊为甘肃永昌种羊场2014年9月从新西兰引进的无角陶赛特羊的纯种繁殖后代。

材料：ORFV弱毒苗参照现有方法自制得到；Ⅳ型胶原酶（4mg/ml）、PBS缓冲液、0.25%/0.01-0.05%胰酶自配；所用培养基为DMEM/F12培养基，DMEM/F12培养基和进口胎牛血清均购自Thermo公司。国产新生牛血清购自兰州荣晔生物科技有限公司。

实施例1

分离、优选羔绵羊睾丸支持细胞

常规无菌取出羔羊睾丸，小心去除外膜，pH7.0，0.05M PBS缓冲液冲洗数次，无菌剪碎，先用0.25%胰酶37℃温箱消化2h，然后用Ⅳ型胶原酶消化0.5-1h，加入1%血清终止消化，1000rpm离心15min，沉淀用含0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液重悬，重悬液37℃保温10-30min使细胞分散后过滤，滤液依次用一层、两层、四层纱布过滤，以去除大块未消化组织及非细胞成分，消化步骤非常关键，消化时间过短，组织、细胞消化不开，时间过长，破坏细胞膜结构，接着100目、200目铜网过滤，滤液1500rpm离心10min，沉淀用含1%小牛血清的营养液重悬，再离心，再重悬，为节省资源，最后用含10%进口胎牛血清的营养液重悬，部分以1.0x10

优选细胞，待铺于细胞瓶的细胞铺满单层后，一瓶细胞继续传代，观察细胞代次，同时接种ORFV弱毒苗，测定接毒情况；一瓶细胞5d后用0.25%胰酶处理，由于支持细胞贴壁快，贴在瓶壁的不容易剥离，别的成纤维等细胞贴壁较慢，或处于半贴壁状态，低浓度（0.25%）胰酶消化时，半贴壁细胞容易从壁上掉下来，掌握好消化时间后，弃处理液，更换新鲜培养基，长满后继续处理，反复处理4次后，处理细胞一瓶继续传代，观察处理细胞传代情况，一瓶接种ORFV弱毒苗，测定接毒情况。

结果，未用0.25%胰酶处理细胞最多传20代，大多5代以上细胞状态发生变化，很难在48h长满；用0.25%胰酶处理后的细胞至少可传40代以上（图2中A组）。接种ORFV后，毒价略微升高。说明本研究通过0.25%胰酶处理细胞的方式在不影响细胞活力的同时优选出了生长、代谢旺盛细胞，从而使其传代次数进一步提升，对ORFV敏感性也相应增强，解决了原代细胞传代问题，命名为SCST，保藏于武汉典型培养物保藏中心。

实施例2

SCST细胞永生化及筛选

如实施例1所述，虽然SCST细胞可以提高传代次数，但SCST细胞的培养需用进口胎牛血清，培养成本高、且代次受限，尚不能用于规模化生产。故给SCST细胞转染端粒酶基因（简称SCST-D），使其永生化后，可以永久传代，值得一提的是，本次转染后筛选时，并不是采用常规技术的用G418抗性基因去筛，而是先用低浓度(200ug/ml)G418筛选，使未转染的脆弱细胞优先被净化，待细胞长满后再用含G418(200ug/ml)培养基分种，使转染后的脆弱细胞也得到净化，经过较长期的培养，极少数活力较强细胞分裂、增殖形成几个克隆岛，然后用高浓度(400 ug/ml) G418进行抗性筛选，本次，又使大部分细胞死亡，再经过漫长的生长，最终形成1-2个克隆岛。挑取单克隆，进行分种培养，第一次1:2分种，第二次1:4分种，当1:8分种时，细胞也可长满，可见细胞耐受力已非常强，第四次时更换6-8%国产新生牛血清培养基，正常可达到1:4-1:5的分种率。目前已传至30代左右，既解决了传代受限问题，又通过使用国产血清降低了成本（如图2中B组和C组）。

实施例3

亚克隆细胞核型染色体鉴定

按照常规染色体核型实验，利用0.5-0.7ug/ml秋水仙素使实施例2中亚克隆细胞处于分裂中期，再经冰醋酸固定，吉姆萨染色。结果显示，本发明的亚克隆细胞为正常体细胞，未发生染色体数目和结构的畸变，呈现锚着依赖和接触抑制等安全性，2n=54（见图3），可见永生化后其遗传性状没有发生改变。

实施例4

SCST细胞鉴定

由于支持细胞分泌波形蛋白，通过检测波形蛋白的表达验证分离到的是否为支持细胞，结果见图4。

图4中结果显示，睾丸支持细胞SCST分泌波形蛋白（Vimentin），进行间接免疫荧光鉴定时，阳性表达于细胞质中。

实施例5

亚克隆细胞的应用

国产血清培养的亚克隆细胞SCST-D接种ORFV弱毒苗，24h产生细胞病变，48h收毒，比常规原代细胞的收毒时间（4-5d）提前，病毒拷贝数由ct值22左右，提前至12-20（见图5），因此，本发明的亚克隆细胞可用于羊口疮病毒的规模化繁殖。