一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液及其制备工艺和应用

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，尤其涉及IPCA61K8领域，更具体的，涉及一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液及其制备工艺和应用。

背景技术

随着生活节奏的加快以及超负荷的工作，几乎每个年轻男性和女性都受到了高强度的工作压力困扰，同时皮肤长时间暴露于电子产品下，睡眠不足及精神压力影响皮肤状态，导致干燥，粗糙，皮肤屏障变薄等一些列皮肤问题。受疫情影响，戴口罩成为常态化，皮肤与口罩直接的接触和摩擦造成皮肤屏障受损加重，导致皮肤水分流失加剧，加剧皮肤屏障的恶化。2021年《化妆品功效宣称评价规范》正式实行，化妆品的功效宣称应当有充分的科学依据。根据化妆品功效的程度，该规范把化妆品功效宣称依据分为四个级别，简单理解就是：功效越强，则需越充分的依据证明，配方中添加具有实际功效原料是大势所趋。其中敏感肌的化妆品市场庞大，开发具有修护肌肤屏障的原料显得尤为重要。

CN110179743A公开了一种调节皮肤微生态平衡的组合物及其制备方法，通过益生元、后生元和生物多肽的共同作用来调节菌群生长和皮肤pH，但其对于皮肤微生态调节并未有任何直接效果证明，只有主观相对性评价，无法证实该组合物是否能够有效调节皮肤生态系统的有益菌群和有害菌群的平衡，以及是否可以协同促进相关的护肤功能。

CN106619358A公开了一种天然温和无任何刺激性的草本护肤制剂，从诱发皮肤敏感过敏的因素出发，科学搭配植物成分，改善皮肤敏感和过敏情况。每一种植物提取液，含有独特的护肤作用。黄芩提取液中的黄芩苷、黄酮类物质抗炎、抑制组胺释放，柚皮提取液中的柚皮苷、黄酮苷抗炎、抑菌，紫苏提取液中的酚酸，抑制组胺释放，积雪草提取液中的总皂苷修复强化屏障，仙人掌提取液中的多糖、甾醇保湿舒缓，土茯苓提取液中的黄酮，舒缓抗敏、免疫抑制，几种植物组分协同作用，抗炎舒缓，抑制炎症介质的释放，清除过剩的自由基，修复皮肤，恢复皮肤健康活性。使用多种植物提取液，生产成本较高，提取液中成分复杂，可能会带来一定的副作用。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液及其制备工艺和应用。本发明制备工艺是使用含有西洋接骨木(SambucusnigraL)的发酵基质，以胚芽乳酸杆菌为微生物菌种进行发酵，所得发酵液可从强化屏障、清除自由基、抑制炎症损伤三个维度协同增效，给予皮肤屏障全方位的预防和修复，可作为功效原料加入到化妆品中。

为达到本发明的目的，本发明第一方面提供了一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液，组分包括西洋接骨木茎枝，微生物菌种，培养基，纯水。

西洋接骨木发酵液中富含以多糖为主的多种植物次生代谢产物，并在微生物菌种发酵条件下转变为分子量更小的有效成分，使其变得更易于被人体吸收利用。

所述微生物菌种包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)及醋酸菌(Acetobacteraceti)中的一种或几种。

微生物菌种为胚芽乳酸杆菌时，可提高发酵液清除自由基的效用，西洋接骨木中的羟基肉桂酸、黄酮醇和花青素的含量较高，可能经过胚芽乳酸杆菌发酵后，酚酸类、黄酮类等可清除自由基的活性活性物质增加。同时研究发现，提高了胚芽乳酸杆菌能够通过产生各种抗菌化合物来减少其他杂菌的生长，推测胚芽乳酸杆菌发酵液酸性较大，不利于对酸性敏感的微生物的生存。

优选的，所述微生物菌种为胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，购自上海联祖生物科技有限公司，型号:LZ-J63226。

西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:10-30时，有利于发酵过程的进行，加水稀释，降低了发酵体系的糖浓度，从而减少了高糖环境中高渗透压对酵母繁殖和发酵的影响，酵母菌数明显增加，但由于供给的糖量高于酵母细胞所能同化的速率，酒精随之出现积累会导致发酵不均，也不利于发酵过程中各反应的进行。随着加水量继续增加，糖度随水稀释而降低，同样不利于后续发酵的进行，进一步研究发现，西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:15时，可提高发酵液的抑制炎症损伤的功效，推测西洋接骨木茎枝中糖基化的黄酮类化合物糖苷残基得到更充分的去除，使得黄酮类更容易被吸收从而发挥功效。

优选的，所述西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:10-30。

进一步优选的，所述西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:15。

本发明第二方面提供了一种修护作用的西洋接骨木发酵液的制备工艺，包括以下步骤；

S1，将西洋接骨木茎枝，干燥，粉碎，过筛，加入纯水分散，灭菌后得到发酵基质；

S2，将微生物菌种接种于培养基中，摇床培养，得种子培养液；

S3，取一定量种子培养液加入到发酵基质中，进行发酵，得初始发酵液；

S4，初始发酵液依次进行灭菌，破壁处理，过滤，收集滤液，即得一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液。

优选的，所述S1中过筛后的粒径为500-1000目。

进一步优选的，所述S1中过筛后的粒径为800目。

优选的，所述S1和S4灭菌为110-130℃下灭菌20-60min。

进一步优选的，所述S1和S4灭菌为121℃下灭菌20min。

优选的，所述S2中微生物菌种接种量质量百分数为培养基的0.5-3％，摇床转速为100-200rpm，培养温度为35-45℃，培养时间为18-48h。

进一步优选的，所述S2中微生物菌种接种量质量百分数为培养基的1.5％，摇床转速为150rpm，培养温度为37℃，培养时间为36h。

优选的，所述S2中培养基为MRS液体培养基，购自北京索莱宝科技有限公司，型号：M8540。

种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的1-5％，发酵液具有优异的强化屏障效用，可能是提高了发酵液中的柠檬酸、苹果酸等物质的含量，因而提高了发酵液的保湿型，加入到化妆品中还可改善皮肤pH值。接种量过小，发酵液菌种不足以提高活性物质的含量，接种量过大，发酵液易过度发酵，过高的酸度，会使杂蛋白富集，不利于吸收。进一步研究发现，种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的1.5-3.5％时，可进一步提高了西洋接骨木发酵液的气味，应用于化妆品中，更容易使人接受，这可能由于大量的糖酵解酶、脂解酶和蛋白水解酶将一些培养基营养素转化为具有感官特性的化合物，与西洋接骨木特殊的麝香气味所混合，相互协同提升了发酵液的气味。

优选的，种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的1-5％。

进一步优选的，所述S3中种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的1.5-3.5％。

更进一步优选的，所述S3中种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的3％。

发酵的温度为35-45℃时，可协同胚芽乳酸杆菌提高发酵效率，归因于与胚芽乳酸杆菌适宜生长的温度吻合度较高，进一步研究发现，发酵的温度为36-39℃，发酵时间为24-72h时，进一步提升了发酵液对DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除率，随着发酵的进行，体系酸度降低，发酵液中的黄酮浓度不断增加，抗氧化活性不断强，继续延长发酵时间抗氧化活性开始减弱，推测可能是发酵后期发酵液活性成分发生变化，酸度过高时，西洋接骨木中的氰苷类物质分解为醛酮和氢氰酸，对人体产生一定的副作用。

优选的，所述S3中发酵温度为35-45℃，发酵时间为24-72h时，摇床转速为100-200rpm。

进一步优选的，所述S3中发酵温度为38℃，发酵时间为48h，摇床转速为200rpm。

采用高压均质机进行破壁处理，可简化工艺、提高生产效率，压力为400-600bar时有较好的破壁效果，高速物料通过阀腔通道和限流缝隙时会产生强烈的剪切力，使细胞破碎，由于胚芽乳酸杆菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁具有很厚的肽聚糖成分，破壁较为困难，破壁效率不够高，研究发现，温度提高至70-90℃，可提高破壁效率，但长时间高温破壁，同时高速物料间摩擦生热，使得体系局部温度升高，发酵液中的部分活性成分可能因高温失去功效，进一步研究发现，采用间隙破壁可解决上述问题，特别是采用破壁4-6min，间隙4-6min，反复3-5次可达到较好效果。

优选的，所述高压均质破壁处理的压力为400-600bar，温度为70-90℃，所述破壁方法：破壁4-6min，间隙4-6min，反复3-5次

进一步优选的，所述S4中高压均质破壁处理的压力为500bar，温度为75℃，所述破壁方法：破壁5min，间隙5min，反复3次。

本发明第三方面提供了一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液的应用，应用于化妆品中。

优选的，化妆品包括水剂，乳剂，喷雾，膏霜和面膜中的一种或几种。

优选的，所述西洋接骨木发酵液在化妆品中添加的质量百分比为0.1-10％。

进一步优选的，所述西洋接骨木发酵液在化妆品中添加的质量百分比为1-5％。

有益效果：

1.西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:10-30时，有利于发酵过程的进行，同时可提高发酵液的抑制炎症损伤的功效。

2.微生物菌种为胚芽乳酸杆菌时，可提高发酵液清除自由基的效用以及减少其他杂菌的生长。

3.种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的1-5％，发酵液具有优异的强化屏障效用。

4.发酵的温度为35-45℃，发酵时间为24-72h，提升了发酵液对DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除率。

5.采用高压均质机进行破壁处理，破壁温度70-90℃，破壁压力400-600bar，破壁时间4-6min，破壁间隙时间4-6min，往复3-5次，可简化工艺、提高生产效率。

具体实施方式

实施例1

一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液，组分包括西洋接骨木(SambucusnigraL.)茎枝，微生物菌种，培养基，纯水。

所述西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:15。

所述微生物菌种为胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，购自上海联祖生物科技有限公司，型号:LZ-J63226。

一种修护作用的西洋接骨木发酵液的制备工艺，包括以下步骤；

S1，将西洋接骨木茎枝，干燥，粉碎，过筛，加入纯水分散，灭菌后得到发酵基质；

S2，将微生物菌种接种于培养基中，摇床培养，得种子培养液；

S3，取一定量种子培养液加入到发酵基质中，进行发酵，得初始发酵液；

S4，初始发酵液依次进行灭菌，破壁处理，过滤，收集滤液，即得一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液。

所述S1中过筛后的粒径为800目。

所述S1和S4灭菌为121℃下灭菌20min。

所述S2中培养基为MRS液体培养基，购自北京索莱宝科技有限公司，型号：M8540。

所述S2中微生物菌种接种量质量百分数为培养基的1.5％，摇床转速为150rpm，培养温度为37℃，培养时间为36h。

所述S3中种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的3％。

所述S3中发酵温度为38℃，发酵时间为48h，摇床转速为200rpm。

所述S4中高压均质破壁处理的压力为500bar，温度为75℃，所述破壁方法：破壁5min，间隙5min，反复3次。

一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液的应用，应用于化妆品面膜中。

所述西洋接骨木发酵液在化妆品面膜中添加的质量百分比为2％。

实施例2

一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液，组分包括西洋接骨木(SambucusnigraL.)茎枝，微生物菌种，培养基，纯水。

所述西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:20。

所述微生物菌种为胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，购自上海联祖生物科技有限公司，型号:LZ-J63226。

一种修护作用的西洋接骨木发酵液的制备工艺，包括以下步骤；

S1，将西洋接骨木茎枝，干燥，粉碎，过筛，加入纯水分散，灭菌后得到发酵基质；

S2，将微生物菌种接种于培养基中，摇床培养，得种子培养液；

S3，取一定量种子培养液加入到发酵基质中，进行发酵，得初始发酵液；

S4，初始发酵液依次进行灭菌，破壁处理，过滤，收集滤液，即得一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液。

所述S1中过筛后的粒径为1000目。

所述S1和S4灭菌为121℃下灭菌20min。

所述S2中培养基为MRS液体培养基，购自北京索莱宝科技有限公司，型号：M8540。

所述S2中微生物菌种接种量质量百分数为培养基的2％，摇床转速为150rpm，培养温度为37℃，培养时间为48h。

所述S3中种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的2.5％。

所述S3中发酵温度为38℃，发酵时间为48h，摇床转速为200rpm。

所述S4中高压均质破壁处理的压力为450bar，温度为80℃，所述破壁方法：破壁5min，间隙5min，反复3次。

一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液的应用，应用于化妆品乳剂中。

所述西洋接骨木发酵液在化妆品乳剂中添加的质量百分比为3％。

实施例3

一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液，组分包括西洋接骨木(SambucusnigraL.)茎枝，微生物菌种，培养基，纯水。

所述西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:20。

所述微生物菌种为胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)，购自上海联祖生物科技有限公司，型号:LZ-J63226。

一种修护作用的西洋接骨木发酵液的制备工艺，包括以下步骤：

S1，将西洋接骨木茎枝，干燥，粉碎，过筛，加入纯水分散，灭菌后得到发酵基质；

S2，将微生物菌种接种于培养基中，摇床培养，得种子培养液；

S3，取一定量种子培养液加入到发酵基质中，进行发酵，得初始发酵液；

S4，初始发酵液依次进行灭菌，破壁处理，过滤，收集滤液，即得一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液。

所述S1中过筛后的粒径为800目。

所述S1和S4灭菌为121℃下灭菌20min。

所述S2中培养基为MRS液体培养基，购自北京索莱宝科技有限公司，型号：M8540。

所述S2中微生物菌种接种量质量百分数为培养基的2.5％，摇床转速为150rpm，培养温度为37℃，培养时间为30h。

所述S3中种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的3％。

所述S3中发酵温度为38℃，发酵时间为48h，摇床转速为200rpm。

所述S4中高压均质破壁处理的压力为650bar，温度为70℃，所述破壁方法：破壁5min，间隙5min，反复4次。

一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液的应用，应用于化妆品喷雾中。

所述西洋接骨木发酵液在化妆品喷雾中添加的质量百分比为1％。

对比例1

一种具有修护作用的西洋接骨木发酵液，组分包括西洋接骨木(SambucusnigraL.)茎枝，微生物菌种，培养基，纯水。

所述西洋接骨木茎枝与纯水重量比为1:15。

一种西洋接骨木提取液的制备工艺，包括以下步骤；

S1，将西洋接骨木茎枝，干燥，粉碎，过筛，加入纯水分散，75℃加热回流提取2h，过滤，得初始提取液；

S2，初始提取液依次进行破壁处理，过滤，收集滤液，即得一种西洋接骨木提取液。

所述S1中过筛后的粒径为800目。

所述S2中高压均质破壁处理的压力为500bar，温度为75℃，所述破壁方法：破壁5min，间隙5min，反复3次。

对比例2

具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例2中所述西洋接骨木(SambucusnigraL.)茎枝与纯水重量比为1:35。

对比例3

具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例3中所述S3中种子培养液接种量质量百分数为发酵基质的0.5％。

对比例4

具体实施方式同实施例1；不同的是，对比例4中所述S4中高压均质破壁处理的压力为600bar，温度为90℃，所述破壁方法：连续破壁20min。

1.抗氧化DPPH清除率(％)测试，具体操作如下：

a)称取0.2g发酵液，加水98.8g，制备0.2％发酵液试样。

b)用移液器取40μl发酵液试样，再加入160μl的DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)乙醇溶液(200μg/ml)。

c)混匀后于室温避光条件下反应30min，再于517nm处测吸光度A，每组设置3组平行实验计算平均值，计算方法如下：

清除率＝[1-(A1-A2)/A0]×100％

式中：A0—未加入试样的DPPH溶液的吸光度；A1—加入试样后的DPPH溶液反应后的吸光度；A2—DPPH溶液与各试样混合后反应前的吸光度。测试数据如表1所示。

2.炎症因子IL-6/TNF-α抑制率测试：采用ELISA法进行检测。其中以没做任何处理的巨噬细胞作为空白对照组，以脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞作为阴性对照组，以0.01％地塞米松处理的巨噬细胞为阳性对照组，具体操作如下：

a)细胞接种：以2.2×10

b)得到称取0.2g发酵液，加水98.2g，制备0.2％发酵液试样。

c)吸取孔中的细胞培养液，样品组每孔分别加入1.8ml含有0.2％浓度的发酵液试样；阴性对照组每孔加入1.8ml的正常培养液；阳性对照组每孔加入1.8ml的阳性对照培养液；空白对照组每孔加入1.8ml正常培养液。

d)加液完成后，将6孔板放置于细胞培养箱(5％CO2、37℃)培养2h。

e)LPS刺激：培养2h后，各组每孔加入200μl配置的含LPS的工作液，置于细胞培养箱(5％CO2、37℃)继续培养22h。

f)检测：收集细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行ELISA检测。

根据检测数据结果，计算公式如下：

IL-6抑制率％＝(A1-B1)/A1×100

TNF-α抑制率％＝(A1-B1)/A1×100

式中：A1—阴性对照组IL-6(TNF-α)表达量；B1—测试组IL-6(TNF-α)表达量

测试数据如表1所示。

3.皮肤含水量及经表皮水份流失Tewl值测试：

a)称取2g发酵液，加水98g，制备2％的发酵液试样。

b)筛选健康志愿者30名，年龄在30-45岁，使用2％的发酵液试样，每天早晚各1次，连续使用4周；

c)使用德国CK Corneometer CM825皮肤水份测试仪测量皮肤含水量、经表皮水份流失值。

测试数据如表2所示。

表2