自身免疫性水疱病PBMCs直接免疫荧光诊断试剂盒

技术领域

本发明属于诊断试剂盒技术领域，具体涉及一种自身免疫性水疱病PBMCs直接免疫荧光诊断试剂盒。

背景技术

自身免疫性水疱病是一类皮肤和黏膜表现为水疱、红斑、皮疹、糜烂等损伤的自身免疫性疾病，多种表皮细胞间和表皮基底膜蛋白的自身抗体是该类疾病的致病因素。该类疾病单纯依靠临床表现无法诊断，实验室检测到组织结合和/或循环的自身抗体，才能进行诊断。其中组织结合的自身抗体的检测依然是公认的诊断金标准。

自身免疫性水疱病主要分为两大类，天疱疮和类天疱疮。天疱疮的患者体内存在desmogelin 1(Dsg1)、Dsg3等表皮细胞间蛋白的自身抗体，组织的直接免疫荧光表现为表皮细胞间的染色阳性。类天疱疮的患者体内存在BP180、laminin gamma 1、type VIIcollagen、laminin 332等自身抗体，组织的直接免疫荧光多表现为表皮基底膜的染色阳性(线性沉积)。

综上所述，对所有患者进行组织结合的直接免疫荧光实验，检测结合的自身抗体，并提高检测敏感性，是当务之急。

使用患者活检组织切片的直接免疫荧光实验检测自身免疫性水疱病的组织结合的自身抗体依然是目前诊断自身免疫性水疱病的金标准。然而，该方法存在两个主要的问题：(1)不是所有的患者都适合进行皮肤组织和黏膜组织取材，例如眼黏膜类天疱疮患者通常主要为眼黏膜损伤，直接眼部组织取材进行传统的组织荧光病理检查是多数患者无法接受的；(2)因为组织取材的位置或者取材后的保存和切片过程的问题等各种原因造成的假阴性结果非常常见。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种自身免疫性水疱病PBMCs直接免疫荧光诊断试剂盒，该试剂盒只需要抽取外周血，不需要切取皮肤或者黏膜组织，几乎适用于所有自身免疫性水疱病的患者；PMBCs相对比较均一，不会因为组织取材的位置等原因影响检测结果。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种自身免疫性水疱病PBMCs直接免疫荧光诊断试剂盒，组成包括：

1.经正电荷处理的九孔板；

2.封闭液；

3.FITC标记的IgG抗体；

4.10×PBS。

其中，所述经正电荷处理的九孔板中2个孔为阳性对照，1个孔为阴性对照，6个孔用于检测患者PBMCs。

所述封闭液为2.5％山羊血清，含量为4ml。

所述FITC标记的IgG抗体具体为FITC标记的兔抗人IgG抗体，含量为4ml。

所述10×PBS含量为10ml。

进一步的，所述经正电荷处理的九孔板的制备方法为：将九孔板中的九个孔命名为A、B、C、1、2、3、4、5、6，取已分离的一个大疱性类天疱疮患者、一个寻常型天疱疮患者和一个正常人的PBMCs分别加入到A、B、C孔中，每孔加入50μl PBMCs，使用枪头涂布均匀至孔底，孔1-6为空白；将九孔板室温下静置3h以上，直至孔中液体完全挥发；然后将九孔板-20℃条件下保存。

上述自身免疫性水疱病PBMCs直接免疫荧光诊断试剂盒检测方法为：检测前，待检测患者PBMCs先涂布于1-6孔，干燥后进行实验。孔1-6，可以用于同时检测6个患者，或者3个患者(每个患者2个重复孔)。每孔中加入封闭液是为了更好的去除非特异信号。孔中加入FITC标记的抗人IgG抗体后，PBMCs表面如果存在IgG自身抗体，会与FITC标记的抗人IgG抗体结合，洗涤去除未结合的FITC标记的抗人IgG抗体。在荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察，PBMCs有绿色荧光染色信号，即为阳性；PBMCs无绿色荧光染色信号，即为阴性。

本发明与现有技术相比的有益效果是：使用容易获得且均一性好的PBMCs替代患者的皮肤/黏膜组织进行直接免疫荧光染色，来检测PBMCs结合的自身抗体，从而用于自身免疫性水疱病的诊断。通过检测疑似自身免疫性水疱病患者的PBMCs上结合的自身抗体来进行诊断，不仅提高了检测的敏感性、还解决了一些患者组织获得困难的问题。而且，因为PBMCs可以多次获得，本方法不仅可以用于诊断，还可以用于患者治疗效果的监测。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明

图1是本发明自身免疫性水疱病PBMCs直接免疫荧光诊断试剂盒检测可疑自身免疫性水疱病患者的结果示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。

实施例1

自身免疫性水疱病PBMCs直接免疫荧光诊断试剂盒

检测方法：

(1)试剂准备

实验前，将所有检测材料置于室温下(20-30度)；根据需要用蒸馏水稀释适量的10xPBS(1:10)。

(2)患者PBMCs准备和使用

分离的PBMCs使用PBS稀释到浓度1x10

(3)洗涤

每孔中加入500μl PBS，洗涤3次(每次1分钟)；

(4)封闭

每孔中加入500μl封闭液，37度孵育60分钟

(5)洗涤

每孔中加入500μl PBS，洗涤3次(每次3分钟)；

(6)荧光抗体染色

每个加入300μl FITC标记的IgG抗体，37度孵育60分钟；

(7)洗涤

每孔中加入500μl PBS，洗涤3次(每次3分钟)；

(8)观察

每孔加入300μl PBS，使用荧光显微镜或共聚焦荧光显微镜观察结果

结果判定：

在荧光显微镜或者共聚焦荧光显微镜下观察，PBMCs有绿色荧光染色信号，即为阳性；PBMCs无绿色荧光染色信号，即为阴性。

质量控制：

A孔和B孔的PBMCs有绿色荧光染色信号，而C孔的PBMCs无绿色荧光染色信号，结果判定有效，否则无效。

代表性结果展示：

图1为一个可疑自身免疫性水疱病的患者使用本发明的试剂盒进行PBMCs直接免疫荧光检测的结果。A：大疱性类天疱疮患者PBMCs检测结果(阳性对照)；B：寻常型天疱疮患者PBMCs检测结果(阳性对照)；C：正常人PBMCs检测结果(阴性对照)；D：可疑自身免疫性水疱病患者PBMCs的检测结果。图A和图B都有PBMCs的绿色荧光信号，结果为阳性；图C无PBMCs的绿色荧光信号，结果为阴性。因此结果有效。图D为被检测患者的结果，有PBMCs的绿色荧光信号，因此结果判定为直接免疫荧光阳性。

主要性能指标

(1)特异性和敏感性

(2)重复性

对5个样本，分别进行了6次的重复，重复结果均保持一致。

(3)干扰物质

人外周血中的各种蛋白，可能会造成非特异荧光信号，影响对弱阳性样本的结果判定。因此，患者PBMCs分离后一定要使用PBS至少洗涤2次，并使用PBS进行浓度调节，从而最大可能的降低非特异荧光背景。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。