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一种将多能干细胞分化为间充质干细胞的方法

文献发布时间：2024-04-18 19:58:26

技术领域

本申请涉及生物医药的技术领域，更具体地说，涉及一种将多能干细胞分化为间充质干细胞的方法。

背景技术

多能干细胞(Stem Cells)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种APSC多能细胞，包括胚胎干细胞和诱导多功能干细胞。人胚胎干细胞(hESC)和诱导多能干细胞(hiPSC)是细胞治疗的干细胞来源。区别于传统成体来源的细胞，hESC和hiPSC能提供一个来源明确、质量高度可控、增殖能力趋于无限的优质细胞来源。干细胞技术的快速发展极大地推动了上述细胞的应用研究。在移植前将hESC和hiPSC分化为谱系特异性祖细胞或成熟的体细胞是安全有效地使用这些多能干细胞的必要条件。谱系特定细胞的移植可以避免由多能干细胞不受控制的自发分化引起的体内畸胎瘤形成。然而，将hESC和hiPSC稳定有效地分化为临床相关的祖细胞或成熟细胞类型仍然是一个重大挑战。

在过去的几年中，已经深入研究了将hESC和hiPSC体外分化导向所需谱系的方法。其中，所需谱系包括间充质干细胞(MSC)。MSC是一种很有前途的细胞药物，在治疗各类疾病方面都体现了明显的疗效。

目前，从hESC和hiPSC分化获得MSC细胞的策略包括使用共培养OP9细胞以及使用各类细胞因子和生长因子。也有方法首先通过胚状体的自发分化随后通过流式细胞术分选以获得所需的MSC。通过这些方法衍生的细胞通常被测试为MSC表面标记为阳性，并且能够在体外分化成两个或三个间充质谱系，即成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。但上述方面存在明显的局限性，包括处理操作复杂、需要大量的培养时间和人力成本，同时效率低和产量低。

因此，对于常规临床应用，有必要突破相关技术中的局限性，开发一种新的从hESC和hiPSC中分化获得MSC的方法。

发明内容

为了进一步提高从hESC或hiPSC细胞中分化MSC的效率，同时获得高质量MSC，本申请提供一种将多能干细胞分化为间充质干细胞的方法。

从hESC或hiPSC中分化获得MSC，除了添加细胞因子和生长因子外，还可以使用适当的生物材料基质或培养表面，通过施加物理刺激和信号调节，对细胞命运产生强烈影响。I型胶原蛋白作为一种传统的生物材料，可以通过整合素介导的信号通路促进间充质干细胞的成骨分化，还可以通过激活上皮-间质转化(EMT)来刺激间质形态发生。因此，本申请的技术方案中，利用胶原蛋白涂层在调节hESC或hiPSC向MSC的分化中发挥积极作用，能够促进扩大规模或利用生产线进行hESC或hiPSC向MSC的分化在临床中的应用。

另外，单个的、分散状态的hESC或hiPSC细胞会比集落状态的细胞更容易响应信号刺激，进而分化效率会较高。因此，本申请的技术方案中，使用单个的、分散状态的hESC或hiPSC细胞来进行分化处理，从而提高分化效率。同时，为了保证单个的、分散状态的细胞的活率，本申请中还使用了ROCK抑制剂Y-27632对细胞进行预处理。

本申请提供一种将多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，采用如下的技术方案：

一种将多能干细胞分化为间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤：

将培养好的胚胎干细胞或诱导多功能干细胞解离为分散状态的单个细胞，并维持在包含ROCK抑制剂的维持培养基中；将解离后的细胞种植到纤维状I型胶原蛋白包被涂层上，添加分化培养基后进行培养，即可获得P0代间充质干细胞。

可选地，所述分化培养基包括以下成分：α-MEM、5-50ng/ml PDGF-BB、0.5-2.5ng/ml FGF-2、0.2-2ng/ml EGF、100nM地塞米松和50μM L-抗坏血酸或抗坏血酸磷酸镁。

可选地，所述分化培养基还包括Wnt激活剂；所述Wnt激活剂的使用时间为分化培养开始后第0-3天。

可选地，所述Wnt激活剂选自CHIR99021和TWS119中的任意一种或多种。

可选地，所述分化培养基还包括CHIR99021。

可选地，所述分化培养基还包括TWS119。

可选地，所述Wnt激活剂的浓度为1-20uM。

本申请通过向分化培养基中添加Wnt激活剂，包括CHIR99021和TWS119，CHIR99021是一种GSK3抑制剂，TWS119是一种GSK-3β抑制剂，IC50为30nM，能够诱导神经细胞的分化，有助于干细胞生物学的研究。在分化培养基中添加Wnt激活剂，能够进一步提高间充质干细胞的分化效率，同时保证间充质干细胞的高质量和高纯度。

可选地，所述ROCK抑制剂为Y-27632，加入的浓度为5-40μM。

可选地，所述纤维状I型胶原蛋白包被涂层由I型胶原蛋白纤维组成，所述I型胶原蛋白纤维的直径为0.1-2μm，长度为100-5000μm。

可选地，所述纤维状I型胶原蛋白包被涂层的制备方法具体如下：

A)配置浓度不低于3mg/ml的I型胶原蛋白溶液，pH调节至中性，从而获得胶原蛋白工作液；

B)向培养板中加入所述胶原蛋白工作液，放置在37℃培养箱中18-24h，去除凝胶状上清，用1xPBS洗涤涂层表面1次，制得所述纤维状I型胶原蛋白包被涂层。

可选地，将培养好的胚胎干细胞或诱导多功能干细胞解离为分散状态的单个细胞的解离液为Accutase。

可选地，所述解离后的细胞在所述分化培养基中孵育2d后更换分化培养基；之后3-4d内更换一次；孵育10-20d，获得分化后的间充质干细胞。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1.本申请的方法中，使用纤维状I型胶原蛋白包被涂层通过以下机理促进分化：一方面，胚胎干细胞或诱导多功能干细胞通过生物物理作用利用纤维状I型胶原蛋白包被涂层贴附固定在具有相对高弹性模量高硬度的培养板表面(高于水凝胶活人体软组织的弹性模量)，高硬度力学环境有利有干细胞向间充质谱系分化。另一方面，胶原蛋白分子通过与细胞表面整联蛋白相互作用，促进细胞的黏附、迁移、增殖和分化，尤其是通过激活上皮-间质转化(EMT)机制来刺激细胞向间质形态分化。

2.本申请使用分散状态的单个hESC或hiPSC细胞，促进分化。通过把hESC或hiPSC细胞分散成单个细胞，消除潜在的细胞间的相互作用的影响，实现更高效率分化，获得间充质干细胞。

3.利用本申请的方法分化获得的间充质干细胞纯度高，方法简易、效率高，10d可获得第一代MSC，无需要复杂操作。同时，成本低。无需要昂贵试剂或添加其他成分。

4.本申请通过向分化培养基中添加Wnt激活剂，能够进一步提高间充质干细胞的分化效率，同时保证间充质干细胞的高质量和高纯度。

附图说明

图1为实施例1制备的用于分化hESC/hiPSC细胞的纤维状I型胶原蛋白包被涂层。

图2为实施例2在图1的纤维状I型胶原蛋白包被涂层分化hESC/hiPSC获得的MSC(分化培养10d)。

图3为实施例3获得的MSC的细胞表型检测结果(分别为CD73PE-A、CD105PE-AandCD45 PE-A)。

具体实施方式

本申请提供的一种将多能干细胞分化为间充质干细胞的方法以及利用上述方法分化获得的间充质干细胞。

上述方法为：将培养好的胚胎干细胞或诱导多功能干细胞解离为分散状态的单个细胞，并维持在包含ROCK抑制剂的维持培养基中；将解离后的细胞种植到纤维状I型胶原蛋白包被涂层上，添加分化培养基后进行培养，即可获得P0代间充质干细胞。

上述方法具体包括以下步骤：

(1)培养胚胎干细胞或诱导多功能干细胞。

(2)将培养好的胚胎干细胞或诱导多功能干细胞解离为分散状态的单个细胞，并维持在包含ROCK抑制剂的维持培养基(iMedCell，货号为ME-1001000)中。所用的解离液为Accutase。所用的ROCK抑制剂为Y-27632，加入的浓度为5-40μM。可选地，Y-27632的浓度为10μM。

(3)利用I型胶原蛋白制备纤维状I型胶原蛋白包被涂层。

纤维状I型胶原蛋白包被涂层由I型胶原蛋白纤维组成，所述I型胶原蛋白纤维的直径为0.1-2μm，长度为100-5000μm。

纤维状I型胶原蛋白包被涂层的制备方法具体如下：

A)配置浓度不低于3mg/ml的I型胶原蛋白溶液，pH调节至中性，从而获得胶原蛋白工作液；

B)向培养板中加入所述胶原蛋白工作液，放置在37℃培养箱中18-24h，去除凝胶状上清，用1xPBS洗涤涂层表面1次，制得所述纤维状I型胶原蛋白包被涂层。

(4)将解离后的细胞种植到纤维状I型胶原蛋白包被涂层上，添加分化培养基后进行培养，即可获得P0代间充质干细胞。细胞的种植密度为15000-45000/cm

其中，分化培养基包括α-MEM、5-50ng/ml PDGF-BB、0.5-2.5ng/ml FGF-2、0.2-2ng/ml EGF、100nM地塞米松和50μM L-抗坏血酸或抗坏血酸磷酸镁。

进一步地，所述分化培养基还包括Wnt激活剂，浓度为1-20uM，Wnt激活剂的使用时间为分化培养开始后第0-3天。即Wnt激活剂的使用时间为分化培养开始后第0-3天第0-72h。Wnt激活剂选自CHIR99021和TWS119。

培养方式如下：将解离后的细胞在所述分化培养基中孵育2d后更换分化培养基；之后3-4d内更换一次；孵育10-20d，获得分化后的间充质干细胞。

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

以下结合实施例、附图以及性能检测结果对本申请作进一步详细说明。

实施例

实施例1

本实施例提供了纤维状I型胶原蛋白包被涂层的制备方法。图1为本实施例制备的用于分化hESC/hiPSC细胞的纤维状I型胶原蛋白包被涂层。在细胞贴附和分化培养后，在纤维状I型胶原蛋白包被涂层上获得MSC。

该制备方法具体包括以下步骤：

(1)I型胶原蛋白的准备：使用稳定在酸性溶液中的纯化牛I型胶原单体(PureCol，Inamed Biomaterials，CA)制备胶原蛋白存储液，浓度为3mg/ml。

(2)胶原蛋白工作液的制备：按1xDPBS：10xDPBS：0.1M NaOH：3mg/ml胶原蛋白存储液的体积比为70:1:1:8，将上述溶液混合，制得胶原蛋白工作液。其中，胶原蛋白存储液最后加入，以最小化不溶性聚集物的形成。

(3)纤维状I型胶原蛋白包被涂层的制备：在12孔无细胞培养板的每个孔中添加1ml胶原蛋白工作液，在37℃、含5％CO

将制得的带有纤维状I型胶原蛋白包被涂层的细胞培养板密封存储在4℃的条件下，以备后续使用。纤维状I型胶原蛋白包被涂层通常由直径约300nm、长度为数微米的I型胶原纤维组成。

实施例2

本实施例提供了hiPSC的培养方法。

人类诱导多能干细胞KY01ANFB0201IPSC细胞在Matrigel

用于制备MEF培养基的基础培养基包含：基础培养基(DMEM)/F-12，20％的去除血清替代物，2mM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺(均来自Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)和0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)。同时使用伽马辐射灭活的MEF细胞(irr-MEF)制备MEF培养基，以在诱导步骤之前培养hiPSCs。每天更换维持培养基以维持hiPSCs的培养。

实施例3

本实施例提供了一种将hESC/hiPSC分化为MSC的方法。本实施例在实施例1和实施例2的基础上继续进行。图2为本实施例在图1的纤维状I型胶原蛋白包被涂层上分化hESC/hiPSC获得的MSC(分化培养10d)。

上述方法具体包括以下步骤：

(1)利用实施例2提供的方法培养hESC/hiPSC。

(2)首先，在分离hESC/hiPSC之前，在维持培养基中添加10μM Y-27632，孵育1h。然后，向其中加入1ml Accutase，在37℃的孵育箱孵育10min，使细胞解离形成分散状态的单个细胞。接着，将获得的单个细胞离心并重悬，加入10μM Y27632的维持培养基中。

(3)利用实施例1提供的方法制备纤维状I型胶原蛋白包被涂层。

(4)将解离后的、在维持培养基中的单个细胞以15000/cm

分化培养基包含基础α-MEM(Invitrogen)，25ng/ml PDGF-BB，1.5ng/ml FGF-2，1ng/ml EGF，100nM地塞米松(Sigma-Aldrich)和50μM L-抗坏血酸磷酸镁(Sigma-Aldrich)。

实施例4