地衣芽孢杆菌、菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、菌剂及其应用。

背景技术

坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌引起的肠道疾病，正常情况下肉鸡不会发生该病，但在球虫和产气荚膜梭菌共同刺激下，极易导致该病发生，对肉鸡有很高的致病率和致死率。原有防控坏死性肠炎的方法中最常见的是使用抗生素。但使用抗生素对坏死性肠炎进行防控，易造成细菌耐药性和药物残留问题。

在替代抗生素的技术应用中，因微生物具备无污染、无毒及无不良反应，不会产生药物残留和耐药性问题，所以，若能筛选出一株可防控家禽坏死性肠炎的菌种将具有非常大的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种地衣芽孢杆菌，所述的地衣芽孢杆菌菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDTN，于2020年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020536，命名为地衣芽孢杆菌HDTN，Bacillus licheniformisHDTN。

本发明还提供一种菌剂，该菌剂含有如上所述的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)HDTN。

所述的菌剂中地衣芽孢杆菌HDTN的活菌数含量不低于2×10

本发明还提供如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的菌剂在制备用于防控家禽坏死性肠炎的微生物制剂单菌剂、饲料添加剂、饮水剂中的应用。

本发明中，可以将所述的地衣芽孢杆菌HDTN制备成微生物制剂单菌剂，也可以将其与其他辅料配合制备成混合菌剂，也可以将其制备成饲料添加剂，上述微生物制剂单菌剂、混合菌剂、饲料添加剂均可根据实际需要混入家禽日粮中饲喂家禽；也可以将其制备成饮水剂，将制得的饮水剂溶于常温清水中给家禽引用。

应用本发明所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的菌剂的使用方法：

(1)微生物制剂单菌剂：

将所述的地衣芽孢杆菌HDTN经扩大培养后制得发酵液，将发酵液进行喷雾干燥制得地衣芽孢杆菌HDTN单菌剂(微生物制剂单菌剂)。

将制得所述的地衣芽孢杆菌HDTN单菌剂按照重量比(3-5)：10000的比例混入家禽全价日粮中(例如：地衣芽孢杆菌HDTN单菌剂0.3kg-0.5kg,家禽全价日粮1000kg，两者混合均匀)饲喂家禽。

(2)混合菌剂：

将所述的地衣芽孢杆菌HDTN经扩大培养后制得发酵液，将发酵液进行喷雾干燥制得地衣芽孢杆菌HDTN单菌剂，将制得所述的地衣芽孢杆菌HDTN单菌剂按照重量比(1-2)：100的比例与辅料(其他微生物制剂、饲料载体等)混匀后制得混合菌剂。

将制得所述的混合菌剂按照重量比(5-10)：10000的比例混入家禽全价日粮中饲喂家禽。

(3)饲料添加剂：

将上述制得的所述微生物制剂单菌剂或混合菌剂制备成所需的饲料添加剂产品。

将制得的饲料添加剂产品按上述相应比例(所述的地衣芽孢杆菌HDTN单菌剂与家禽全价日粮的重量比、所述的混合菌剂与家禽全价日粮的重量比)混入家禽全价日粮中饲喂家禽。

(5)家禽饮水剂：

将上述制得的所述微生物制剂单菌剂或混合菌剂制备成所需的家禽饮水剂产品。

将制得的所述微生物制剂单菌剂按照重量比(3-5)：10000的比例溶解于15-30℃的清水中后供家禽饮用。

将制得的所述混合菌剂剂按照重量比(5-10)：10000的比例溶解于15-30℃的清水中后供家禽饮用。

通过让家禽采食或者饮用本发明中所述的地衣芽孢杆菌HDTN，可以实现防控家禽坏死性肠炎。

进一步地，如上所述的应用，所述的地衣芽孢杆菌HDTN对产气荚膜梭菌有抑制作用。

进一步地，如上所述的应用，所述的地衣芽孢杆菌HDTN对产气荚膜梭菌WSSJ04有抑制作用。

所述的地衣芽孢杆菌HDTN对产气荚膜梭菌有抑制作用，特别是对产气荚膜梭菌WSSJ04抑制能力最强，抑菌圈直径达到29mm。

进一步地，如上所述的应用，所述的地衣芽孢杆菌HDTN对毒害艾美耳球虫孢子化有抑制作用。

进一步地，如上所述的应用，所述的地衣芽孢杆菌HDTN可降低球虫对鸡胚的致死率，可抑制球虫在鸡胚内中繁殖。

所述的地衣芽孢杆菌HDTN不仅可以抑制毒害艾美耳球虫孢子化，含2×10

进一步地，如上所述的应用，所述的地衣芽孢杆菌HDTN可防治家禽坏死性肠炎导致的肠道损伤。

本发明还提供如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的菌剂在制备革兰氏阳性菌抑制剂中的应用。

进一步地，如上所述的应用，所述的地衣芽孢杆菌HDTN包括对金黄色葡萄球菌、副乳房链球菌、铅黄肠球菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌均具有抑制作用，其中，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制能力最强，抑菌圈直径均达到23mm。

可以采用所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的菌剂来制备革兰氏阳性菌抑制剂，通过制得的革兰氏阳性菌抑制剂对革兰氏阳性菌进行抑制处理，其中可抑制的革兰氏阳性菌至少包括金黄色葡萄球菌、副乳房链球菌、铅黄肠球菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌。

基于本发明中所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的菌剂的作用，本发明还提供如上所述的地衣芽孢杆菌或如上所述的菌剂在饲料保鲜防腐中的应用或在制备饲料保鲜防腐剂中的应用。

本发明的有益效果：本发明的所述的地衣芽孢杆菌HDTN分离筛选自健康水牛的瘤胃内容物，通过让家禽采食或者饮用本发明中所述的地衣芽孢杆菌HDTN，可以实现防控家禽坏死性肠炎，同时，其对金黄色葡萄球菌、副乳房链球菌、铅黄肠球菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、产气荚膜梭菌多种革兰氏阳性菌均具有抑制作用；也对毒害艾美耳球虫孢子化和球虫有抑制作用，该菌株可用于制作抑制上述革兰氏阳性菌的抑制剂，其还可降低球虫对鸡胚的致死率，可抑制球虫在鸡胚内中繁殖，可防治家禽坏死性肠炎导致的肠道损伤。

生物保藏

本发明的菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDTN，于2020年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCCNO:M 2020536。

附图说明

图1为不同浓度地衣芽孢杆菌HDTN发酵液对产气荚膜梭菌抑菌能力，其中A为产气荚膜梭菌WSSJ03，B为产气荚膜梭菌WSSJ04，HDTN为HDTN发酵原液，1/2HDTN为1/2倍HDTN发酵液，1/4HDTN为1/4倍HDTN发酵液。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：菌株的筛选与鉴定

1)分离物样品取自湖北省武汉市某养牛场健康水牛的瘤胃内容物，将所取瘤胃内容物在无菌条件下分为小块，装入无菌试管中，试管中加入无菌生理盐水，对样品进行10倍梯度稀释。分别取10

所述营养琼脂培养基按重量份计由以下成分组成：蛋白胨10份、牛肉膏3份、氯化钠5份、琼脂15份、蒸馏水1000份。

2)筛选可抑制革兰氏阳性菌的芽孢杆菌

将步骤1)纯化得到的芽孢杆菌菌种分别划线营养琼脂培养基，37℃厌氧培养24h；挑取分离菌株于50mL的营养肉汤中，37℃、200r/min条件下培养24h后作为种子液；将种子液以1％的接种量接种到100mL的营养肉汤中，37℃、200r/min条件下培养48h，得到发酵液。

所述营养肉汤按重量份计由以下成分组成：蛋白胨10份、牛肉膏3份、氯化钠5份、蒸馏水1000份。

将上述发酵液于5000r/min条件下离心5min后，得到上清液，上清液使用0.22μm无菌滤膜过滤，备用。

营养琼脂平板的制备：每个平板倒营养琼脂培养基约25mL，试验前保持平皿干燥。

指示菌菌液制备：金黄色葡萄球菌划线营养琼脂培养基培养，获得单菌落；挑取单菌落于营养肉汤，37℃振荡培养16h。

对比麦氏比浊管，将培养好的指示菌菌液调整到细菌数为1×10

用无菌镊子取灭菌牛津杯，轻轻放于营养琼脂平板上。吸取各发酵上清液200μL至牛津杯中，注意不要将菌液溢出杯外。

平板放置4℃冰箱扩散8h，再转入37℃的恒温培养箱内，培养12h～16h后，观察抑菌圈大小。

其中1株芽孢杆菌发酵液对金黄色葡萄球菌具有强抑制作用，命名为HDTN菌株。

3)HDTN菌株的鉴定

将HDTN菌株接种于营养肉汤中，37℃培养12h。用细菌基因组DNA提取试剂盒参照其说明书提取HDTN菌株的基因组DNA。以HDTN基因组DNA为模板，使用16srDNA通用引物扩增HDTN菌株16srDNA，对PCR扩增产物进行测序分析。

所述的16srDNA通用引物序列为

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

测序得到的HDTN菌株的16srDNA序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI数据库中进行Nucleotide Blast比对分析，结果显示，HDTN菌株与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的Identities＝100％。故而，HDTN菌株鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，命名为地衣芽孢杆菌HDTN，于2020年9月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020536。

实施例2：地衣芽孢杆菌HDTN体外抑菌试验

指示菌：金黄色葡萄球菌，产气荚膜梭菌WSSJ03、WSSJ04购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，屎肠球菌、铅黄肠球菌和酿酒酵母购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；副乳房链球菌由湖北华大瑞尔分离保存。将上述9种指示菌进行活化。

不同指示菌活化液各取100μL接种到相应培养基中，培养。按照实施例1中步骤2)中所述的牛津杯法测定地衣芽孢杆菌HDTN对9种指示菌的抑菌圈直径。

结果如表1所示，地衣芽孢杆菌HDTN对8种革兰氏阳性菌均表现出抑菌活性，抑菌能力强弱顺序依次为产气荚膜梭菌WSSJ04＞产气荚膜梭菌WSSJ03＞枯草芽孢杆菌＝金黄色葡萄球菌＞屎肠球菌＞副乳房链球菌＝解淀粉芽孢杆菌＞铅黄肠球菌；而对酿酒酵母无抑菌能力。由结果可知，地衣芽孢杆菌HDTN对革兰氏阳性菌抑制作用显著，可用于制备抗菌药物或微生物制剂，可用于作为下述任一种或多种革兰氏阳性菌的抑制剂：金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、副乳房链球菌、铅黄肠球菌；解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌。

表1地衣芽孢杆菌HDTN发酵上清液体外抑菌试验

实施例3：地衣芽孢杆菌HDTN对产气荚膜梭菌的抑制作用

1)不同浓度地衣芽孢杆菌HDTN发酵上清液对产气荚膜梭菌的抑制能力

将产气荚膜梭菌WSSJ03和产气荚膜梭菌WSSJ04两种指示菌进行活化，两种指示菌活化液各取100μL分别接种到RCM培养基中，培养。按照实施例1中步骤2)中所述方法制备地衣芽孢杆菌HDTN发酵液，使用无菌生理盐水对发酵液原液分别进行2倍、4倍稀释。再按照实施例1中步骤2)中所述的牛津杯法测定地衣芽孢杆菌HDTN发酵原液、1/2发酵液、1/4发酵液对2种指示菌的抑菌圈直径。

所述的RCM培养基按重量份计由以下成分组成：蛋白胨10份、牛肉粉10份、酵母粉3份、葡萄糖5份、可溶性淀粉1份、氯化钠5份、醋酸钠3份、L-半胱氨酸盐0.5份、蒸馏水1000份。

结果如图1和表2所示，不同浓度HDTN菌株发酵液对产气荚膜梭菌均有强抑菌作用。

表2不同浓度地衣芽孢杆菌HDTN发酵上清液体外抑菌试验

2)HDTN发酵上清液对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度

将产气荚膜梭菌WSSJ03和产气荚膜梭菌WSSJ04两种指示菌进行活化，两种指示菌活化液各取100μL分别接种到RCM培养基中，37℃厌氧培养16h。培养结束后，各取1％指示菌菌液转接至RCM培养基中，再分别加入0％、0.5％、1％、2％、3％和6％地衣芽孢杆菌HDTN发酵上清液，以RCM培养基作为阴性对照，37℃厌氧共培养24h。培养结束后，检测各培养液中产气荚膜梭菌数量，以0％HDTN发酵上清液为对照。

结果如表3所示，3％和6％地衣芽孢杆菌HDTN发酵液对产气荚膜梭菌WSSJ03和WSSJ04都表现出完全的抑制作用，2％地衣芽孢杆菌HDTN发酵液对2株产气荚膜梭菌的抑菌率为75.8％和76.6％，表明地衣芽孢杆菌HDTN发酵液对产气荚膜梭菌的最小抑菌溶度为3％。

表3HDTN发酵上清液对产气荚膜梭菌最小抑菌浓度

实施例4：地衣芽孢杆菌HDTN抑制毒害艾美耳球虫试验

1)地衣芽孢杆菌HDTN抗毒害艾美耳球虫孢子化

地衣芽孢杆菌HDTN发酵液：按实施例1中步骤2)中的方法制备，备用。

将毒害艾美耳球虫接种1日龄雏鸡，发病后雏鸡进行剖检，取空肠和盲肠，纵向切开，用盖玻片刮取内容物，将内容物放入胃蛋白酶溶液中，混合均匀。于39℃水浴2h，依次过50目、100目和200目筛过滤，收集滤液。将滤液在1500r/min下离心10min，弃去上清液，沉淀物加入少量水反复吹洗，再加入10倍水洗涤，1500r/min离心10min，重复三次，去除蛋白酶。沉淀物即为分离得到的球虫卵囊。卵囊放入4℃冰箱中保存以防止孢子化，备用。

取卵囊沉淀物加入10倍量的2.5％重铬酸钾溶液振荡混合均匀，卵囊数调整至10

表4抗孢子化试验分组及处理

按照上述处理培养结束后，按照GB/T 18647-2002方法使用麦氏虫卵计数板，在显微镜低倍镜观察，记录卵囊数，计算每mL卵囊数和孢子化率。

卵囊数＝计数室虫卵平均数×200×稀释倍数

孢子化率(％)＝(孢子化卵囊数/卵囊总数)×100％

从表5结果可知50％浓度地衣芽孢杆菌HDTN发酵液对球虫孢子化抑制作用最大，之后抑制作用由大到小的发酵液浓度依次是40％、30％、20％、10％和5％，表明地衣芽孢杆菌HDTN发酵液具有抗毒害艾美耳球虫孢子化作用，抑制孢子化作用与发酵液浓度呈正相关。

表5地衣芽孢杆菌HDTN对孢子化的影响

2)地衣芽孢杆菌HDTN抑制毒害艾美耳球虫试验

地衣芽孢杆菌HDTN发酵液：按实施例1步骤2)方法制备，备用。

按照实施例4中1)步骤方法获得毒害艾美耳球虫卵囊，卵囊放入2.5％重铬酸钾溶液中，使卵囊浓度不超过10

选择10日龄SPF鸡胚，根据不同浓度HDTN发酵液设组，每组10枚，另设药物组、空白组和球虫阳性组。在各组试验组、药物组和球虫阳性组鸡胚接种球虫卵囊前，按表6方法处理。

表6抑制球虫试验分组及处理

反应结束后，上述各组每胚尿囊腔接种0.2mL卵囊液；空白组尿囊腔接种0.2mL无菌生理盐水。针孔蜡封后置于37℃培养箱中进行孵育，接种后每天观察鸡胚1次，记录鸡胚死亡情况。4天内死亡的鸡胚视为操作污染或中毒死亡，5-6天死亡并伴有出血症状的鸡胚视为球虫致死。

试验7天后所有胚体放于50mL生理盐水中，150r/min振荡5min，移出胚体，3000r/min离心收集生理盐水中的卵囊并镜检；剖检胚体，取出肌胃和肠道，用50mL生理盐水冲洗肠道内容物，收集卵囊，使用麦氏虫卵计数板，在显微镜低倍镜观察，记录卵囊数，计算卵囊平均减少率。

表7地衣芽孢杆菌HDTN对毒害艾美耳球虫的抑制作用

从表7结果可知，40％和50％地衣芽孢杆菌HDTN发酵液对毒害艾美耳球虫有显著地抑制作用，卵囊减少率分别为95％和96％。表明地衣芽孢杆菌HDTN发酵液对毒害艾美耳球虫孢子化卵囊有显著抑制作用。

实施例5：地衣芽孢杆菌HDTN对肉鸡坏死性肠炎的治疗作用

1)试验分组

选择9日龄健康的cobb 500肉鸡45只，分为3组，每组15只肉鸡，公母各半。各组的肉鸡基础日粮相同，试验分组及处理方式如表8。

表8试验分组及处理

2)盲肠产气荚膜梭菌的变化

实验第24天，各组随机选取5只鸡，无菌条件下收集鸡盲肠内容物。取0.2g内容物于无菌EP管中，用2mL无菌生理盐水稀释，进行10

结果表9所示，HDTN组产气荚膜梭菌数量较感染组下降74.73％。表明地衣芽孢杆菌HDTN可以在肉鸡肠道内抑制产气荚膜梭菌。

表9各组盲肠产气荚膜梭菌的变化

3)消化道变化

实验第24天，剖检观察各组消化道变化。

对照组：正常，无明显病变异常。

感染组：小肠弥漫性充血，回肠肠壁变薄，肠粘膜部分脱落出血；盲肠充气比较明显。

HDTN组：十二指肠、空肠粘膜轻微出血，回肠肠壁较正常，盲肠轻微充血。

结果表明，地衣芽孢杆菌HDTN可以减轻产气荚膜梭菌和毒害艾美耳球虫引起的肉鸡坏死性肠炎的损害。

实施例6：地衣芽孢杆菌HDTN对肉制品污染微生物的抑制作用

1)地衣芽孢杆菌HDTN发酵液：按实施例1中步骤2)方法制备，备用。

2)肉制品模拟液体培养基(MSM)：酵母膏2.5g、牛肉膏1.0g、葡萄糖1.0g、胰蛋白胨5.0g、NaCl 8.5g、蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2，115℃灭菌20min，备用。

肉制品模拟培养基(MSMA)：上述肉制品模拟培养基，加入1.5％琼脂粉。

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠球菌均分离自腐败肉制品。腐败菌分别用MSMA活化，活化后菌种分别接种MSM培养基，32℃培养24h，制成10

3)在含有8.9mL MSM的试管中，试验组加入1mL地衣芽孢杆菌HDTN发酵液和0.1mL腐败菌菌悬液；阳性对照用无菌水代替发酵液；阴性对照用MSM代替菌悬液。充分混匀后于32℃条件下培养48h。取出试管，观察浑浊程度。

4)观察结果，三组试验组培养基与阴性对照组相当，培养基清亮；阳性对照组培养基浑浊。表明地衣芽孢杆菌HDTN发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠球菌三种腐败菌具有抑制作用，可作为抑制上述三种腐败菌的抑制剂。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。