重组气单胞菌、重组蛋白表达系统和应用

技术领域

本申请涉及重组蛋白表达技术领域，具体而言，涉及一种重组气单胞菌、重组蛋白表达系统和应用。

背景技术

重组蛋白是指应用重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质。重组蛋白表达技术是研究蛋白质结构与功能的重要手段之一，先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因(gene of interest，GOI)，并将目的基因连接到适合的表达载体，导入到特定的宿主细胞，利用宿主细胞的遗传系统，表达出有功能的蛋白质分子。

由于大肠杆菌遗传背景清楚，培养成本低、可适用于多种表达载体、且通常产生的蛋白质产量较高，利用大肠杆菌表达目标蛋白是常见的重组蛋白表达方法之一。

然而，目前还存在很多异源蛋白难以在大肠杆菌中高效表达，原因主要包括密码子偏好性不同，目标蛋白具有毒性、溶解度差、难以折叠，或者目标蛋白mRNA具有复杂二级结构等。此外，在利用大肠杆菌的常规发酵中，若不慎引入噬菌体侵染大肠杆菌，则容易导致整个发酵罐的污染，造成巨大经济损失。

因此，传统大肠杆菌表达菌株无法完全满足科研、工业生产重组蛋白的需求。

发明内容

为了解决上述问题，提供一种新的蛋白表达菌株，增加生产重组蛋白的种类和产量，本申请的第一目的在于提供一种重组气单胞菌，重组气单胞菌的基因组含有用于表达T7 RNA聚合酶的T7基因。

本申请在气单胞菌上的基因组插入用于表达T7 RNA聚合酶的T7基因构建的重组气单胞菌，具有较快的生长速度和更高的蛋白表达能力，能够利用宿主细胞的背景优势和T7 RNA聚合酶的转录优势进行重组蛋白表达，大幅提高重组蛋白的产量。

在其中一个实施例中，T7基因包括lacI基因、lacZ基因和T7 RNAP基因。

在其中一个实施例中，重组气单胞菌的基因组上T7基因的插入位点满足以下特征(1)～(2)中的至少一种：

(1)T7基因的插入位点位于endA基因上游区域；

(2)T7基因的插入位点位于glmS基因下游区域；

可选地，T7基因的插入位点位于endA基因上游且连接endA基因的起始密码子ATG；

可选地，T7基因的插入位点位于glmS基因下游且连接glmS基因的终止密码子TAA。

在其中一个实施例中，重组气单胞菌不表达真核毒素、分泌系统、抗生素抗性、鞭毛调控蛋白和冗余蛋白中的至少一种；

可选地，真核毒素包括Alt毒素、Ast毒素、Act毒素、HlyA毒素、AHH1毒素以及AexU毒素中的至少一种；

可选地，分泌系统包括三型分泌系统和六型分泌系统；

可选地，鞭毛调控蛋白包括LafK蛋白和FlrA蛋白；

可选地，冗余蛋白包括S-layer蛋白VapA；

在其中一个实施例中，重组气单胞菌不表达目标基因；

目标基因选自毒素基因、分泌系统基因、抗生素抗性基因、鞭毛调控基因和冗余蛋白基因中的至少一种；

可选地，毒素基因包括act基因、alt基因、ast基因，hlyA基因、ahh1基因和aexU基因中的至少一种；

分泌系统基因包括T3SS基因和T6SS基因中的至少一种；

抗生素抗性基因包括blaOXA基因；

鞭毛调控基因包括lafK基因和flrA基因；

冗余蛋白基因包括vapA基因。

本申请的第二方面提供了上述重组气单胞菌的构建方法，方法包括：

在气单胞菌的基因组上插入用于表达T7 RNA聚合酶的T7基因以得到重组气单胞菌。

在其中一个实施例中，T7基因包括lacI基因、lacZ基因和T7 RNAP基因。

在其中一个实施例中，方法还包括：将重组气单胞菌的基因组上的目标基因进行敲除或沉默；

可选地，采用同源重组法在气单胞菌的基因组上插入T7基因和/或敲除目标基因；

目标基因选自毒素基因、分泌系统基因、抗生素抗性基因、鞭毛调控基因和冗余蛋白基因中的至少一种；

可选地，毒素基因包括act基因、alt基因、ast基因，hlyA基因、ahh1基因和aexU基因中的至少一种；

分泌系统基因包括T3SS基因和T6SS基因中的至少一种；

抗生素抗性基因包括blaOXA基因；

鞭毛调控基因包括lafK基因和flrA基因；

冗余蛋白基因包括vapA基因。

本申请的第三目的在于提供一种蛋白表达系统，包括上述重组气单胞菌以及含有T7启动子的蛋白表达载体。

在其中一个实施例中，蛋白表达载体包括pET载体、pBAD载体、pPSV载体和p15A载体中的至少一种。

本申请的第四目的在于提供上述重组气单胞菌或蛋白表达系统在表达目标蛋白中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例2中构建AMAX底盘细胞的示意图，图1中A表示T7基因簇插入位点；B表示不同菌株的T7基因插入的PCR验证结果；C表示野生型和插入T7基因后不同菌株表达GFP的结果；D表示不同菌株生产GFP的产量比较结果，D中纵坐标表示每50mL发酵液中GFP的产量；E表示T7(endA)与T7(glmS)菌株不同温度下生产GFP和总蛋白的产量比较结果，E中纵坐标表示每50mL发酵液中蛋白的产量；

图2为本申请实施例3中改造AMAX底盘细胞的示意图，图2中A表示基因改造AMAX菌株的验证结果；B表示改造菌株对青霉素的耐药性，“No antibiotic”表示未添加抗生素，“ampicillin”表示氨苄青霉素，“carbenicillin”表示羧苄青霉素；

图3为本申请实施例4中AMAX菌株生长曲线和蛋白质表达能力的测定结果；其中，图3中A表示AMAX菌株的生长曲线图；B表示AMAX菌株和大肠杆菌BL21(DE3)菌株蛋白质表达能力的对比结果，B中纵坐标表示每50mL发酵液中蛋白的产量；C表示AMAX菌株和大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达的目标蛋白在总蛋白量中占比的对比结果，C中纵坐标表示目标蛋白在总蛋白量中占比；D表示实验室大肠杆菌标准噬菌体(T4)和河段中分离的大肠杆菌噬菌体(Isolated phage)裂解AMAX的实验结果。

具体实施方式

现将详细地提供本申请实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本申请。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本申请进行多种修改和变化而不背离本申请的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本申请覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本申请的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本申请更广阔的方面。

为了解决上述技术问题，本申请的第一方面提供了重组气单胞菌，重组气单胞菌的基因组含有用于表达T7 RNA聚合酶的T7基因。

具体地，气单胞菌是水生环境的好氧或兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌，，广泛存在于海水、地表水、地下水、饮用水和灌溉水中，可以在低温(2-10℃)、高盐(4％ NaCl)、pH＝5的环境条件下存活。气单胞菌生长速度较快，在常用LB培养基下就可以长到较高细胞密度，易于实验室分离和培养。它GC含量较高约为62％，区别于传统的大肠杆菌(GC含量50％)，在表达高GC含量的异源蛋白方面具有优势。

T7 RNA聚合酶具有高度启动子专一性，且只会转录位于T7启动子下游的DNA或DNA复制品。T7 RNA聚合酶能选择性的激活T7启动子的转录，其合成mRNA的速度比普通大肠杆菌的RNA聚合酶快5倍左右。

本申请在气单胞菌基因组上插入用于表达T7 RNA聚合酶的T7基因构建的重组气单胞菌，具有较快的生长速度，能够利用宿主细胞的背景优势以及T7RNA聚合酶的转录优势用于进行重组蛋白表达，大幅提高重组蛋白的质量和产量。具体地，重组蛋白的产量可以达到大肠杆菌BL21(DE3)蛋白产量的2～3倍。

此外，本申请的重组气单胞菌具有有效抵御噬菌体的侵染的能力，可避免单一大肠杆菌发酵受到噬菌体污染带来的风险。

一些实施方案中，T7基因包括lacI基因、lacZ基因和T7 RNAP基因，其中，lacI基因作为T7 RNAP基因的阻遏基因，lacZ基因作为结构基因，T7 RNAP基因用于转录成T7 RNA聚合酶。T7基因用于在气单胞菌内表达T7转录元件，从而利于T7 RNA聚合酶的转录优势用于进行重组蛋白表达。

本申请对T7基因在气单胞菌基因组的插入位置不作具体限定，只要能实现在气单胞菌内表达T7转录元件，从而利于T7 RNA聚合酶的转录优势用于进行重组蛋白表达即可。

一些实施方案中，重组气单胞菌的基因组上T7基因位于endA基因上游区域，以便于气单胞菌的表达系统对T7基因进行表达生成T7转录元件。

一些具体实施方案中，T7基因位于endA基因的上游且连接endA基因的起始密码子ATG；

一些实施方案中，重组气单胞菌的基因组上T7基因位于glmS基因下游区域，以便于气单胞菌的表达系统对T7基因进行表达生成T7转录元件。

一些具体实施方案中，T7基因的插入位点位于glmS基因下游且连接glmS基因的终止密码子TAA。

一些实施方案中，重组气单胞菌不表达真核毒素、分泌系统、抗生素抗性、鞭毛调控蛋白和冗余蛋白中的至少一种，从而具有更高的生物安全性或者更高的蛋白生产效率。

一些实施方案中，真核毒素包括Alt毒素、Ast毒素、Act毒素、HlyA毒素、AHH1毒素以及AexU毒素中的至少一种。真核毒素的减少可以提高重组气单胞菌的安全性。

一些实施方案中，分泌系统包括三型分泌系统和六型分泌系统，不表达分泌系统可以减少重组气单胞菌的毒性，提高重组气单胞菌的安全性。

一些实施方案中，鞭毛调控蛋白包括LafK蛋白和FlrA蛋白。不表达鞭毛调控蛋白可以提高底盘细胞内的能量与物质用于目标蛋白的生产效率，提高重组气单胞菌的蛋白生产效率。

一些实施方案中，冗余蛋白包括S-layer蛋白。冗余蛋白的减少可以提高细胞内的能量与物质用于目标蛋白的生产效率，提高重组气单胞菌的蛋白质生产能力。

一些实施方案中，对气单胞菌的目标基因分别进行敲除或沉默，以使重组气单胞菌相应地不表达真核毒素、分泌系统、抗生素抗性、鞭毛调控蛋白和冗余蛋白。重组气单胞菌不表达目标基因，以获得更高的生物安全性或者更高的蛋白生产效率。

具体地，目标基因选自毒素基因、分泌系统基因、抗生素抗性基因、鞭毛调控基因和冗余蛋白基因中的至少一种。

一些实施方案中，毒素基因包括act基因、alt基因、ast基因，hlyA基因、ahh1基因和aexU基因中的至少一种。相应地，对单胞菌的毒素基因进行敲除，以降低重组气单胞菌的真核毒素，提高重组气单胞菌的安全性。

一些实施方案中，分泌系统基因包括T3SS基因和T6SS基因中的至少一种。相应地，对单胞菌的分泌系统基因进行敲除，使气单胞菌不表达分泌系统可以减少重组气单胞菌的毒性，提高重组气单胞菌的安全性。

一些实施方案中，抗生素抗性基因包括blaOXA基因。野生型的气单胞菌天然具有抗生素抗性，本申请通过不表达blaOXA基因，得到了对氨苄青霉素、羧苄青霉素敏感的气单胞菌，扩大了可兼容质粒载体的范围。

一些实施方案中，鞭毛调控基因包括lafK基因、flrA基因以及其他调控鞭毛合成的基因。相应地，对气单胞菌的鞭毛调控基因进行敲除，使气单胞菌不表达鞭毛调控蛋白，可以提高底盘细胞内的能量与物质用于目标蛋白的生产效率，提高重组气单胞菌的蛋白生产效率。

一些实施方案中，冗余蛋白基因包括vapA基因。相应地，对气单胞菌的冗余蛋白基因进行敲除，使冗余蛋白的表达减少，可以提高细胞内的能量与物质用于目标蛋白的生产效率，提高重组气单胞菌的蛋白质生产能力。

可以理解的是，本申请对目标基因的敲除或沉默不限于上述基因，只要是对重组气单胞菌表达的目的蛋白的功能和目的蛋白产量没有影响的基因都可以作为目标基因，从而提高细胞内的能量与物质用于目标蛋白的生产效率，提高重组气单胞菌的蛋白质生产能力。

相应地，本申请的第二方面提供了上述重组气单胞菌的构建方法，方法包括：

在气单胞菌的基因组上插入用于表达T7 RNA聚合酶的T7基因以得到重组气单胞菌。

可选地，T7基因包括lacI基因、lacZ基因和T7 RNAP基因。

一些实施方案中，方法还包括：将重组气单胞菌的基因组上的目标基因进行敲除或沉默。

一些实施方案中，采用同源重组法在气单胞菌的基因组上插入T7基因和/或敲除目标基因。

具体地，目标基因选自毒素基因、分泌系统基因、抗生素抗性基因、鞭毛调控基因和冗余蛋白基因中的至少一种。

具体地，毒素基因包括act基因、alt基因、ast基因，hlyA基因、ahh1基因和aexU基因中的至少一种；

具体地，分泌系统基因包括T3SS基因和T6SS基因中的至少一种；

具体地，抗生素抗性基因包括blaOXA基因；

具体地，鞭毛调控基因包括lafK基因和flrA基因；

具体地，冗余蛋白基因包括vapA基因。

其中，同源重组是一种基因组学技术，它利用某种特定的同源变异来删除或编辑特定的基因，在某种生物体中去除目标基因，或者在另一种生物体中添加这种基因。

本申请的第三方面提供了一种蛋白表达系统，包括上述重组气单胞菌以及含有T7启动子的蛋白表达载体，T7启动子是对T7 RNA聚合酶有特异性反应的强启动子，重组气单胞菌能够表达T7 RNA聚合酶，从而特异性对T7启动子下游的DNA进行过表达产生目标蛋白。

一些实施方案中，蛋白表达载体包括pET载体、pBAD载体、pPSV载体和p15A载体中的至少一种。其中，pET蛋白表达载体上的噬菌体T7强启动子能够调控目的基因的转录和翻译。气单胞菌内存在T7 RNA聚合酶时，重组蛋白的表达被激活，并大幅提高重组蛋白生产质量。阿拉伯糖诱导的pBAD载体，IPTG诱导的pPSV载体、无水四环素诱导的p15A载体能够在气单胞菌内表达蛋白，以利用气单胞菌的背景优势实现更多异源蛋白的表达。

本申请的第四方面提供了上述重组气单胞菌在表达目标蛋白中的应用，从而提高重组蛋白生产质量，同时本申请的重组气单胞菌具有有效抵御噬菌体的侵染的能力，可避免单一大肠杆菌发酵受到噬菌体污染带来的风险。

本申请的重组气单胞菌可有效抵御噬菌体的侵染，若将大肠杆菌与本申请的重组气单胞混合发酵，则避免单一大肠杆菌受到噬菌体污染所带来的风险。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但本申请不局限于这些实施例。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料，试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本实施例使用的野生型气单胞菌Aeromonas sp从广东省深圳市大沙河的水样中筛选得到。本实施例的野生型气单胞菌的16S rDNA以及gyrB两个保守基因的测序结果如下所示。

16S测序引物：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

16S rDNA测序结果：agagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcgggaaagtagcttgctacttttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgcctgggaaattgcccagtcgagggggataacagttggaaacgactgctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggaccttcgggccttgcgcgattggatatgcccaggtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaaggtcagtagctaatatctgctgactgtgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggttggataagttagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatttaaaactgtccagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgatttggaggctgtgtccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtctggaatcctgcagagatgcgggagtgccttcgggaatcagaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctgtcctttgttgccagcacgtaatggtgggaactcaagggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggcgcgtacagagggctgcaagctagcgatagtgagcgaatcccaaaaagcgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagatagcttaaccttcgggagggcgtttaccacggtgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaacc。

gyrB测序引物：3F：TCCGGCGGTCTGCACGGCGT；14R：TTGTCCGGGTTGTACTCGTC。

gyrB测序结果：tccggcggtctgcacggcgtgggcgtctccgtggtgaacgcgctctctgacaagctgttgctgaccatccgtcgcaacggtcatgtctacgagcagacctatcacctgggtgagccgcaggccccgctcaagcagatcggcgatgccaccaccaccgggaccgaagtgcgtttctggccgagcccgaccatcttcagcgacaccctgttccactacgagatcctggccaagcgtctgcgcgagctctccttcctcaactccggcgtctccatccgtctgatggacgagcgtgatggccgcgaggcgcacttctgctacgaaggcggcatcaaggcgtttgtcgagtacctgaaccagaacaagaccccgatccacccgaaggttttccacttcaccaccgagcaggacggcatcggcgtcgaagtggcgatgcagtggaacgacgcctatcaggaaggggtctactgcttcaccaacaacattccgcagcgtgatggcggcacccacctggtgggcttccgtaccgcgctgacccgtaccctcaactcctacatggacaaagaggactacagcaagaaggccaagtctgccgccagtggcgacgacgtgcgtgaaggtttgattgccgttatctccgtcaaggtgccggatcccaagttctcctctcagaccaaggacaagctggtctcttccgaagtgaagaccgccgtcgaacaggcgatgggcgagaagctggccgacttcctgctggaaaacccgggcgatgccaagatcgtggtcaacaagatcatcgatgcggcccgtgctcgtgaagcggcccgcaaggcccgcgaactgacccgccgcaagggcgcgctggatatcgccggtctgcccggcaagctggccgactgtcaggaaaaagacccggcgctctccgaactctacatagtggaaggggactctgctggcggttccgccaagcagggtcgcaaccgaaagaaccaggctatcctgccgctcaagggcaagatcctgaacgtggagaaggcccgtttcgacaagatgatctcctcccaggaggtgggcaccctgatcaccgcactgggctgtggtatcggtcgcgacgagtacaacccggacaa。

实施例1气单胞菌的改造和蛋白质生产能力测定方法

1.细菌培养

若无特殊说明，实验中所用菌种均在LB培养基中37℃，200rpm有氧培养。LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。LB3培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠30g/L。WM6026菌株培养过程中需要向培养基中加入终浓度为100μg/mL 2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelic acid，Dap)，以保证菌株正常生长。培养时抗生素、诱导剂的使用浓度如下：卡那霉素(50μg/mL)，链霉素(100μg/mL)，羧苄青霉素(50μg/mL)，氨苄青霉素(50μg/mL)，氯霉素(气单胞菌使用2.5μg/mL，大肠杆菌使用25μg/mL)，L-阿拉伯糖(1％，0.1％，0.01％[w/v])，IPTG(0.1mM或1mM)，脱水四环素(100ng/mL)。

2.菌株构建

菌株的敲除或插入突变均使用同源重组方法构建。将同源臂片段和目的片段克隆到具有sacB基因的自杀质粒pDS132中，利用供体细胞大肠杆菌WM6026通过接合转移将质粒转移到受体细胞。通过同源重组将质粒整合到染色体中，再利用sacB介导的蔗糖反选择完成两步等位基因交换。具体方法如下：其中敲除/插入质粒使用Gibson方法将目标基因的上下游约各1kb的同源臂片段连接在具有sacB基因的pDS132自杀型质粒上，所得质粒如表1所示，通过PCR和Sanger测序验证后，转化入可进行结合转移的大肠杆菌WM6026中。将携带有质粒的WM6026供体菌和目标菌株混合孵育在添加有Dap的平板上，37℃共培养3h后取出，恢复培养1h后涂布在含有选择性抗生素的LB固体平板上。挑取抗性平板上的接合转移子，在LB中37℃松弛培养4-8h，转移接种至含有10％蔗糖的LBNS培养基(胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L)中22℃培养1-2d。将培养物划线后，挑选单克隆菌株利用PCR进行基因敲除/插入验证。对于验证敲除抗性基因的菌株，将条带正确的单克隆再划至抗性平板上，确认其丢掉抗性。

本实施例涉及的引物如表2所示。表2中，后缀包括“KO1/KO2”与“KO3/KO4”的引物分别用来在同源重组过程中扩增需要删除片段的两侧同源臂的引物，后缀包括“KO5/KO6”的引物为基因敲除PCR验证引物以挑选单克隆菌株。T7基因簇从大肠杆菌BL21(DE3)中克隆得到，克隆T7基因簇使用的PCR扩增引物为表2中的T7-f-NheI，T7-r-NotI。

本实施例涉及的菌株如表3所示。

表1

表2

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表3

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3.气单胞菌电转感受态的制备

将菌株过夜培养，第二天接种至新鲜的LB中培养至OD

4.细菌生长曲线测定

将菌株过夜培养，第二天转接进新鲜已预热的LB或LB3培养基中使其初始细菌浓度为OD

5.蛋白质诱导表达与纯化

将携带相应pET表达质粒的菌株过夜培养，第二天接种至新鲜的培养基中生长至OD

6.细菌总蛋白量和GFP蛋白量的测定

总蛋白量的测定使用Bradford法或BCA法。其中Bradford法具体流程如下：将200μL稀释至不同倍数的上清液与50μL Bradford试剂混合，用酶标仪测定其在595nm的吸光度。使用商业化的1mg/mL的BSA蛋白标准品制作标准曲线，计算每50mL菌体合成sfGFP的产量。BCA使用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒(生工，C503051-0500)。

GFP含量的测定：使用酶标仪以485nm为激发波长，510nm为发射波长读取荧光，使用已知浓度的纯化sfGFP为标准品制作标准曲线，计算每50mL菌体合成sfGFP的产量。

实施例2T7(endA)与T7(glmS)菌株生产GFP

根据实施例1中的菌株构建方法，本实施例克隆了来自BL21(DE3)中的T7基因簇(包含lacI，lacZ，T7 RNAP三个基因)并将其通过同源重组的方式插入进气单胞菌基因组中endA的上游或glmS基因的下游，如图1中A所示，其中endA基因上游位点是目前生长最快的细菌需钠弧菌Vibrio natriegens(Vmax)进行改造时插入T7基因簇的选用位置，而glmS基因下游是Tn转座子的偏好插入位置。

经sanger测序，同源重组使用的质粒插入的T7序列如SEQ ID NO:1所示：

cagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtgacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctgg

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采用上述菌株构建方法分别得到了T7(endA)菌株和T7(glmS)菌株，T7(endA)菌株和T7(glmS)菌株基因插入的PCR验证结果如图1中B所示。

本实施例将pET28a-his-sfGFP载体分别转入野生型气单胞菌、T7(endA)菌株、T7(glmS)菌株后，比较它们在IPTG诱导时生产的GFP。其中，野生型气单胞菌在加入诱导剂时不能够表达GFP，而在插入T7噬箘体转录系统元件后，T7(endA)菌株和T7(glmS)菌株在加入诱导剂时能够表达GFP，具体实验结果如图1中C所示，图1的C中野生型气单胞菌、T7(endA)菌株和T7(glmS)菌株在加入葡萄糖时均不表达具有荧光的GFP蛋白，在加入0.1mM IPTG或者1mM IPTG诱导剂时，野生型气单胞菌不表达具有荧光的GFP蛋白，T7(endA)菌株和T7(glmS)菌株均能够表达具有荧光的GFP，WT表示野生型气单胞菌。

实施例3T7(endA)与T7(glmS)菌株的GFP生产能力

本实施例比较了使用BL21(DE3)、Vmax、T7(endA)、T7(glmS)四株菌使用相同的载体pET28a-his-sfGFP生产蛋白质sfGFP的产量。图1中D的实验结果显示，当使用0.1mM IPTG37℃诱导3h时，每50mL发酵液中BL21(DE3)、T7(glmS)、T7(endA)、Vmax菌株分别能够生产5.74±0.40mg、13.92±2.00mg、12.06±2.28mg、和4.75±0.62mg GFP，相较于BL21(DE3)和Vmax，T7(endA)与T7(glmS)生产GFP产量更高；而使用1mM IPTG 37℃诱导3h时，每50mL发酵液中BL21(DE3)、T7(glmS)、T7(endA)、Vmax菌株分别能够生产5.66±0.22mg、11.74±1.92mg、6.91±1.44mg、和5.50±2.53mg GFP，T7(endA)与T7(glmS)生产GFP产量依旧较高于BL21(DE3)和Vmax；而相较于使用0.1mM IPTG诱导，在使用1mM IPTG诱导时，T7(endA)与T7(glmS)生产GFP的产量略有下降，因此在发酵过程中使用0.1mM IPTG效果较好。

由于许多蛋白在高温表达时蛋白质翻译速度过快导致折叠不充分易形成包涵体，多使用低温发酵。本实施例还比较了T7(endA)与T7(glmS)菌株在不同温度下生产GFP的能力。如图1中E的实验结果显示T7(endA)与T7(glmS)菌株在30℃以上温度条件下诱导时生产GFP的能力无明显区别，大约为每50mL发酵液中生产10～13mg GFP。而当温度低于30℃时，随着温度的下降，GFP生产能力也随之下降。其中T7(endA)与T7(glmS)菌株生产GFP的能力没有显著区别。

实施例4气单胞菌毒性基因的敲除

气单胞菌中主要的真核致病因子有肠毒素Act、Alt、Ast，溶血素HlyA、AHH1、T3SS(三型分泌系统)、T6SS(六型分泌系统)等。

根据实施例1中的菌株改造方法，本实施例使用同源重组技术获得了上述毒素和分泌系统基因簇敲除的菌株，相关实验结果如图2中A所示，提高了底盘细胞的生物安全性。

同时，由于气单胞菌天然具有青霉素类抗生素抗性，因此局限了其使用载体的筛选条件。

本实施例通过分析气单胞菌基因组，找出并敲除了气单胞菌菌株中的blaOXA基因，成功得到了对氨苄青霉素、羧苄青霉素敏感的菌株，相关实验结果如图2中A和图2中B所示，扩大了载体的使用范围。

为了更多地让细胞内的能量与物质都用于目标蛋白的生产，本实施例还敲除了在细胞内表达量较高的非必需蛋白或基因簇，其中两个鞭毛调控基因lafK和flrA，以及S-layer蛋白基因vapA，最终得到AMAX菌株。

综上，本实施例获得了在T7(endA)菌株背景中删除了气单胞菌中的毒素基因、氨苄青霉素抗性基因、以及细胞中非必需的高水平表达蛋白组分的菌株，进一步简化了T7(endA)菌株基因组，减少底盘细胞自身遗传、代谢调控网络对表达元件的干扰，同时降低底盘细胞在环境中传播的风险，提高了底盘细胞的生物安全性，并且扩大了载体的使用范围。

实施例5改造的AMAX菌株的蛋白质生产能力

为了表征实施例4中改造后AMAX菌株蛋白质生产能力，本实施例测定了其在实验室常用培养基LB中的生长速度和GFP蛋白产量，并与常用蛋白质表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)进行了比较。结果显示，在LB培养基中，AMAX菌株的代时约为24.27±0.67分钟，而BL21(DE3)的代时约为27.31±0.52分钟，AMAX菌株有着比BL21(DE3)更快的生长速度，相关实验结果如图3中A所示。而当同样使用pET系列载体表达GFP蛋白时，结果显示在添加0.1mMIPTG，37℃诱导3小时条件下，AMAX菌株每50mL发酵液可以生产大约15-20mg GFP，是大肠杆菌BL21(DE3)的3倍左右，其中目标蛋白GFP含量约占细胞内总蛋白的60-70％，具有优异的蛋白质生产能力，相关实验结果如图3中B和C所示。根据上述图3中B的实验结果和图1中D的实验结果对比可知，与只插入T7元件的T7(endA)菌株相比，实施例4中改造的AMAX菌株在相同条件下生产sfGFP的产量并无显著性区别，表明敲除毒素、氨苄抗性基因、鞭毛调控基因和冗余蛋白基因等改造并没有影响AMAX菌株的蛋白质生产能力。

实施例6改造的AMAX菌株的抵御侵染能力

本实施例使用了一株实验室大肠杆菌标准噬菌体T4和一株从广东省深圳市大沙河的水样中筛选分离得到的大肠杆菌噬菌体，并测定了其对BL21(DE3)和AMAX的侵染能力，结果显示使用这两种噬菌体均不能裂解AMAX，实验结果如图3中D所示，证明了实施例4中改造的AMAX菌株可以抵御大肠杆菌噬菌体的侵染。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。