火炭母胶囊治疗和/或预防肝纤维化的应用

技术领域

本发明涉及药物应用领域，特别是火炭母胶囊治疗和/或预防肝纤维化的应用。

背景技术

火炭母来源为蓼科蓼属植物火炭母(Polygonum chinense L.)的干燥全草，其性酸、甘、寒，归肝、脾经，具有清热除湿、凉血解毒、利肝明目、舒经活血的功效，主治泄泻，痢疾，肺热咳嗽，咽喉肿痛，肝炎、湿疹、中耳炎等，主要分布于福建、广西、广东等地。在广西民间火炭母及硬毛火炭母(Polygonum chinense L.var.hispidum Hook.f.)均作为壮药和瑶药使用，被《广西壮族自治区瑶药材质量标准第一卷》及《广西壮族自治区壮药质量标准第一卷》收载，可见火炭母在广西医药领域发挥了重要的作用。火炭母主要含有黄酮类及黄酮苷类、酚酸类、甾体类等化学成分，具有抗乙肝病毒、保肝、抗炎止痛、抗氧化、抗菌等药理作用。

广东省江门市新会区中医院用火炭母22kg，布渣叶22kg，锡叶藤22kg，青皮3.4kg，枇杷叶90kg，甘草5.0kg组方制成保和汤。张辰林等取火炭母100kg、扭肚藤 100kg、车前草100kg、救必应67kg、石榴皮33kg等五味药材进行提取、沉罐、浓缩制成干膏，粉碎过100目筛，制成干膏粉，加入蔗糖粉，快速混合制粒，干燥，整粒，压片，包糖衣，分装，即得腹可安片。张嵩等还以火炭母、扭肚藤、救必应、车前草、石榴皮组方制成分散片。广州中医药大学第一附属医院用火炭母210g，党参105g等13味药材组方，经过磨粉、萃取、水煎等方法，制得稠膏，加入80g糊精，喷雾干燥，得干浸膏粉，混匀，制成颗粒，填充，即得肠激胺胶囊。临床上对火炭母药材的使用多为复方制剂，尚未见火炭母单方胶囊剂的使用，特别是火炭母胶囊治疗和/或预防急性肝损伤的应用的报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供一种火炭母胶囊对CCl

本发明所述火炭母来源为蓼科蓼属植物火炭母(Polygonum chinense L.)及硬毛火炭母 (Polygonum chinense L.var.hispidum Hook.f.)的干燥全草。

本发明通过以下技术方案实现：

(1)动物模式建立：除正常组大鼠，不做任何干预外，其余大鼠按3mL/kg(首次5mL/kg) 腹部皮下注射40％CCl4橄榄油液，每周2次，间隔2～3d，持续8w。造模开始同时药物干预，正常组和模型组大鼠，按10mL/kg灌胃给予0.5％CMC-Na，其余各组大鼠按10mL/kg 灌胃给予火炭母胶囊药液或水飞蓟素药液，按每天1次，连续给药8w。

(2)肝功能指标检测：造模后，Day56，禁食不禁水14h～16h，末次药后1h，采用眼眶后静脉丛采血3mL，静置1h～2h后，3000rpm，离心10min，收集上清液，用于肝功能指标检测；

(3)氧化应激指标检测：按3mL/kg剂量腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉，腹主动脉采血，3000rpm，离心10min，收集上清液，用于SOD、MDA、GSH、GSH-Px、CAT 和NO水平等氧化应激指标检测。

(4)炎症因子指标检测：取血清样品或肝组织匀浆上清液，使用ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

(5)试验大鼠脏器重量和脏器系数检测：采血结束，剪断腹主动脉急性失血法处死大鼠，迅速分离肝脏、脾脏和胸腺，称重，计算脏器系数(g/100g)。脏器系数＝100×(脏器重量/体重)。

(6)试验大鼠病理学检查：观察肝组织颜色、质地、大小等变化，记录并拍照。分离肝脏左上叶，置于10％福尔马林溶液中固定，6h后更换新鲜10％福尔马林溶液1次，固定24h以后，制备病理片，经苏木素-伊红染色(HE染色)，光镜下观察组织病理学改变和肝纤维化程度。

(7)分离肝脏左下叶，同一部位取材肝组织约300mg，按肝重量∶体积＝1∶9加入冰生理盐水，剪碎，使用均质仪制成10％肝组织匀浆，3000rpm，离心10min，收集上清液。采用BCA法检测肝组织匀浆上清液蛋白水平(ug/mL)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明提供的火炭母胶囊对CCl

2.本发明提供的火炭母胶囊能降低大鼠血清HA、LN、PIIINP、ColIV、HYP、TGF- β和肝TGF-β水平，其中各剂量组大鼠血清HA、PIIINP、ColIV、HYP，高剂量组LN，中高剂量组TGF-β和肝TGF-β水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，对CCl

3.本发明提供的火炭母胶囊大鼠血清及肝SOD、CAT、GSH和GSH-Px水平均升高，MDA和NO水平均降低，低剂量组血清MDA水平显著降低(P＜0.01)，肝GSH-Px水平显著升高(P＜0.05)，中高剂量组血清及肝SOD、CAT和GSH-Px水平均显著升高 (P＜0.05或P＜0.01)，肝GSH水平显著升高(P＜0.05)，MDA和NO水平均显著降低 (P＜0.05或P＜0.01)，高剂量组血清GSH水平显著升高(P＜0.05)，对CCl4所致大鼠血液和肝组织氧化应激指标异常具有明显的改善作用。

4.本发明提供的火炭母胶囊能降低大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平，升高IL-10水平，其中各剂量组IL-1β，中高剂量组IL-6及高剂量组TNF-α水平显著降低(P＜0.05或 P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著降低(P＜0.05或 P＜0.01)，中高剂量组IL-10水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，对CCl4所致大鼠血液和肝组织炎症细胞因子指标异常具有明显的改善作用。

5.本发明提供的火炭母胶囊能减轻大鼠病理性改变明，表面光滑，无明显萎缩，无小颗粒样凸起，质地柔软，可不同程度减轻CCl4所致的病理性改变，其中以中、高剂量作用最佳。

6.本发明提供的火炭母胶囊能明显改善大鼠肝细胞损伤，血管周围病变面积明显缩小，坏死、空泡形成和气球样变的肝细胞面积明显缩小，中剂量组镜下可观察到多个未发生病变的正常肝小叶，可不同程度减轻CCl4所致的病理性改变，其中以中剂量作用最佳。

7.本发明提供的火炭母胶囊能减少大鼠肝组织胶原增生，减少汇管区蓝染的胶原纤维，肝组织纤维化病理改变明显改善，其中以中、高剂量改善最为明显。

附图说明

图1为火炭母胶囊对CCl4所致急性肝损伤大鼠肝脏病理改变肉眼检查。

图2为HE染色观察火炭母胶囊对CCl4所致肝纤维化大鼠肝脏病理改变。

图3为Masson染色观察火炭母胶囊对CCl4所致急性肝损伤大鼠肝脏病理改变。

具体实施方式

实施例1 CCl

1.实验动物

由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，实验动物质量合格证号：1107272011003888。

试剂

火炭母胶囊，广西壮瑶药重点实验室，1次4粒，1天3次，1粒胶囊含0.28g浸膏和0.1g 辅料，1g浸膏＝8.88g生药，内容物为棕褐色粉末；羧甲基纤维素钠，国药集团化学试剂有限公司，批号：20151215；白介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、IV型胶原(COLN)、III型前胶原肽(PCIIINP)、一氧化氮 (NO)和羟脯氨酸(HYP)ELISA试剂盒，江苏酶免实业有限公司，批号均为202006；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、IL-1β、IL-6、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、一氧化氮(NO)、过氧化氢酶(CAT)和肿瘤坏死因子α(TNF-α) ELISA试剂盒，江苏酶免实业有限公司，批号均为202009；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20200923；BCA蛋白法含量试剂盒，上海北沪生物科技有限公司，批号：20200619；谷丙转氨酶(ALT)试剂盒，上海科华生物工程股份有限公司，批号：20200422；谷氨酰转移酶(GGT)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号：92638110；总胆红素(TBIL)试剂盒，北京利德曼生化股份有限公司，批号： 19112708；白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)和谷草转氨酶(AST)试剂盒，浙江伊利康生物技术有限公司，批号分别为200301、200401和200401；水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160225；四氯化碳(CCl4)，上海麦克林生化科技有限公司，批号： C11136534；橄榄油，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：E202108等。

仪器

MH-693型电子天平，东莞市明衡电子科技有限公司；ES 2220M型电子天平，瑞士普利赛斯公司；0104型生物安全型独立通风笼具(IVC笼)，深圳市泓腾生物科技有限公司；5810R型高速冷冻离心机，德国艾本德公司；Epoch2型酶标仪，美国Bio-Tek Instruments公司；TENLIN-C型匀浆仪，江苏天翎仪器有限公司；MDF-U74V型-80℃冰箱，日本 Panasonic公司；Direct-Q 5 UV-R型超纯水仪，美国默克密理博公司；DHG-9240A型鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；7180型全自动生化分析仪，日本HITACHI公司等。

4.饲养环境

饲养于广西中医药大学实验动物中心屏障环境，符合SPF级要求，实验动物使用许可证号为SYXK(桂)2019-0001。使用中央空调，室温控制在19.0℃～25.0℃，相对湿度控制在 40.0％～70.0％，照明明暗控制为12h/12h；大鼠饲养在无毒、耐高压、耐高温、耐腐蚀的IVC塑料笼盒中，不超过6只/笼，饲喂SPF级大鼠维持饲料，自由摄食、饮用纯净水。

方法

选取健康SD大鼠72只，按体重使用Excel软件区组分层随机分组法随机分为6组，每组 12只，分别为正常组、模型组、水飞蓟素组(120mg/kg)

一般临床观察 每天药后观察，记录大鼠的精神、活动、呼吸、体形、步态、被毛、皮肤、异常分泌物(口鼻、眼睛、耳廓、会阴部等)、粪便等是否异常及死亡情况。

采血

Day

取材及病理检查

采血结束，剪断腹主动脉急性失血法处死大鼠，迅速分离肝脏、脾脏和胸腺，称重，计算脏器系数(g/100g)。脏器系数＝100×(脏器重量/体重)。

分离肝脏左上叶，置于10％福尔马林溶液中固定，6h后更换新鲜10％福尔马林溶液 1次，固定24h以后，制备病理片，经苏木素-伊红染色(HE染色)，光镜下观察组织病理学改变。

观察肝组织颜色、质地、大小等变化，记录并拍照。分离肝脏左上叶，置于10％福尔马林溶液中固定，6h后更换新鲜10％福尔马林溶液1次，固定24h以后，制备病理片，经苏木素-伊红染色(HE染色)和Masson染色(胶原纤维染色法)，光镜下观察组织病理学改变和肝纤维化程度。

分离肝脏左下叶，同一部位取材肝组织约300mg，按肝重量∶体积＝1∶9加入冰生理盐水，剪碎，使用均质仪制成10％肝组织匀浆，3000rpm，离心10min，收集上清液。采用 BCA法检测肝组织匀浆上清液蛋白水平(ug/mL)，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

肝功能指标

使用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、GGT、ALB、TP和TBIL水平。

肝纤维化指标

使用ELISA法检测血清HA、LN、PCIIINP、COLIV、TGF-β、HYP水平和肝组织TGF-β水平。

氧化应激指标

取血清样品或肝组织匀浆上清液，检测其SOD、MDA、GSH、GSH-Px、CAT和NO水平。

炎症细胞因子指标

取血清样品或肝组织匀浆上清液，使用ELISA法检测IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

数据统计

使用SPSS17.0统计，以(±s)形式表示，当P＜0.05则认为数据差异有统计学意义。

计量数据，符合正态分布和方差齐性，采用单因素方差检验分析，使用LSD Test进行两两比较分析；若数据非正态或方差不齐，采用Kruskal-Wallis H Test分析，使用Mann-Whitney U test进行两两比较分析。

实施例2火炭母胶囊抗急性肝损伤的药效试验

1.体重

与正常组比较，W

表1火炭母胶囊对CCl

Table.1 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight ofliver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表2火炭母胶囊对CCl

Table.2 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight ofliver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表3火炭母胶囊对CCl

Table.3 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight ofliver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表4火炭母胶囊对CCl

Table.4 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight gain ofliver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表5火炭母胶囊对CCl

Table.5 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight gain ofliver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表6火炭母胶囊对CCl

Table.6 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson body weight gain ofliver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

脏器重量和脏器系数

所有组别大鼠胸腺重及系数、脾重及系数差异均不具显著性(P＞0.05)。与正常组比较，模型组大鼠肝重量及系数均显著增加(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠肝重量及系数均显著增加(P＜0.01)；火炭母胶囊各剂量组大鼠肝重量均显著增加(P＜0.01)，火炭母胶囊低、高剂量组大鼠肝系数显著增加(P＜0.01)，故认为CCl

表7火炭母胶囊对CCl

Table.7 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson organ weight ofliver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表8火炭母胶囊对CCl

Table.8 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson organ indexes ofliver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

肝功能指标

与正常组比较，模型组大鼠肝功能指标ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平均显著升高(P＜0.01)，而ALB、TP和A/G水平均显著降低(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠ALT、AST、TBIL、GLOB和GGT水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，而ALB、TP 和A/G水平均升高，其中TP和A/G水平显著升高(P＜0.05或P＜0.01)；除低剂量组大鼠 ALT和GLOB水平差异不具显著性外(P＞0.05)，火炭母各剂量组大鼠ALT、AST、TBIL、 GLOB和GGT水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，除低剂量组大鼠ALB水平差异不具显著性外(P＞0.05)，火炭母各剂量组大鼠ALB、TP和A/G水平均显著升高(P＜0.05或 P＜0.01)，故认为CCl

表9火炭母胶囊对CCl

Table.9 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver functionindicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表10火炭母胶囊对CCl

Table.10 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver functionindicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表11火炭母胶囊对CCl

Table.11 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver functionindicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

4.肝纤维化指标

与正常组比较，模型组大鼠血清HA、LN、PIIINP、COLIV、HYP、TGF-β和肝TGF-β水平均显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠血清HA、LN、PIIINP、COL IV、HYP、TGF-β和肝TGF-β水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠血清HA、LN、PIIINP、COLIV、HYP、TGF-β和肝TGF-β水平均降低，其中各剂量组大鼠血清HA、PIIINP、COLIV、HYP，高剂量组LN，中高剂量组TGF-β和肝TGF-β水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，故认为CCl

表12火炭母胶囊对CCl

Table.12 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum liverfibrosis indicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表13火炭母胶囊对CCl

Table.13 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum liverfibrosis indicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表14火炭母胶囊对CCl

Table.14 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver fibrosisindicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

5.氧化应激指标

与正常组比较，模型组大鼠血清及肝SOD、CAT、GSH和GSH-PX水平均显著降低 (P＜0.01)，MDA和NO水平均显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠血清及肝SOD、CAT、GSH和GSH-PX水平均显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，MDA和NO水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠血清及肝SOD、CAT、GSH和GSH- PX水平均升高，MDA和NO水平均降低，低剂量组血清MDA水平显著降低(P＜0.01)，肝GSH-PX水平显著升高(P＜0.05)，中高剂量组血清及肝SOD、CAT和GSH-PX水平均显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，肝GSH水平显著升高(P＜0.05)，MDA和NO水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，高剂量组血清GSH水平显著升高(P＜0.05)，故认为CCl

表15火炭母胶囊对CCl

Table.15 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum oxidativestress indicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表16火炭母胶囊对CCl

Table.16 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum oxidativestress indicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表17火炭母胶囊对CCl

Table.17 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver oxidativestress indicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表18火炭母胶囊对CCl

Table.18 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver oxidativestress indicators of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

炎症细胞因子指标

与正常组比较，模型组大鼠血清及肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著升高 (P＜0.01)，IL-10水平均显著降低(P＜0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠血清及肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低，IL-10水平均升高，其中血清IL-1β和IL-6水平显著降低(P＜0.01)，IL-10水平显著升高(P＜0.01)，肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低，IL-10水平均升高，其中各剂量组IL-1β，中高剂量组IL-6及高剂量组TNF-α水平显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)；火炭母各剂量组大鼠肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，中高剂量组IL-10水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，故认为CCl

表19火炭母胶囊对CCl

Table.19 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum inflammatoryfactors of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表20火炭母胶囊对CCl

Table.20 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson serum inflammatoryfactors of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表21火炭母胶囊对CCl

Table.21 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver inflammatoryfactors of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

表17火炭母胶囊对CCl

Table.17 Effects ofPolygonum chinense L.capsuleson liver inflammatoryfactors of liver fibrosis rats induced by CCl

注：与模型组比较，

病理学检查

7.1大体剖检肉眼观察

正常组大鼠肝脏红润，质地柔软，表面平滑色泽光亮均匀，无杂色；模型组大鼠肝脏色泽偏浅无光泽，表面粗糙，有明显小颗粒样凸起，萎缩，体积明显缩小，质地变硬；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠肝脏病理性改变明显减轻，虽较正常组肝脏体积偏大，但颜色较红润，表面光滑有光泽，无小颗粒样凸起，质地柔软；火炭母胶囊低剂量组大鼠病理性改变明显减轻，虽较正常组肝脏体积偏大，色泽偏浅无光泽，但表面光滑，无明显萎缩，无小颗粒样凸起，质地柔软；中、高剂量组大鼠肝脏病理性改变明显减轻，虽较正常组肝脏体积偏大，但颜色较红润，表面光滑有光泽，无小颗粒样凸起，质地柔软。故认为CCl

病理学镜下观察结果

正常组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，细胞结构清晰，核仁居中，大而圆，呈索状排列，无坏死及脂肪变性；模型组大鼠肝细胞损伤严重，镜下观察不到正常的肝小叶，肝小叶结构消失，或出现假肝小叶，大面积肝细胞水肿、坏死、空泡形成、气球样变或挤压，细胞排列紊乱，细胞核皱缩、核仁破裂或核膜消失；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠肝细胞损伤明显改善，细胞水肿程度明显减轻，坏死、空泡形成和气球样变的肝细胞明显减少，镜下可观察到多个未发生病变的正常肝小叶，细胞核皱缩、破裂的数目明显减少；火炭母胶囊各剂量组大鼠大鼠肝细胞损伤明显改善，血管周围病变面积明显缩小，坏死、空泡形成和气球样变的肝细胞面积明显缩小，中剂量组镜下可观察到多个未发生病变的正常肝小叶。说明火炭母胶囊可不同程度减轻CCl

病理学Masson染色镜下观察结果

正常组大鼠汇管区周围可见少量蓝染的胶原纤维，肝组织内未见明显胶原沉积；模型组大鼠肝组织可见广泛纤维化，汇管区周围有大量蓝染的胶原纤维，胶原增生明显，形成纤维隔，假小叶结构清晰可见；与模型组比较，水飞蓟素组大鼠汇管区蓝染的胶原纤维明显减少，肝组织胶原增生明显减少，观察不到假小叶结构；火炭母胶囊各剂量组大鼠肝组织胶原增生明显减少，汇管区蓝染的胶原纤维明显减少，肝组织纤维化病理改变明显改善，其中以中、高剂量改善最为明显。