纤连蛋白截短片段、组合物及用途

技术领域

本发明属于生物医药领域和化妆品领域，涉及一种人纤连蛋白截短片段、组合物及用途。

背景技术

人纤连蛋白(Fibronectin，简称为FN)是一种分子量约为250kDa的大分子糖蛋白，以二聚体的形式存在。整个分子由多个重复性结构模块组成，包含12个FN I型重复序列、2个FN II型重复序列、15个组成型表达、2个交替剪切FN III型重复序列、以及一个非同源性变量(V)或III型连接片段(III CS)区域。其中，FN I主要结合纤维蛋白、肝素和胶原蛋白，FN II只参与胶原蛋白结合，FN III参与与细胞的结合。由于纤连蛋白具有特殊的功能区域和结合区域，使得纤连蛋白可以跟不同类型的细胞、细胞因子和细胞外基质结合。例如，纤连蛋白通过纤连蛋白10Fn III和9Fn III上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp，RGD)识别整合素异二聚体α5β1和αvβ3并与之结合，进而影响细胞黏附、迁移等。

人纤连蛋白是存在于细胞外基质中的蛋白质，它在细胞外基质的形成和细胞黏附中发挥着重要的作用，可以促进皮肤组织的修复和再生，因此被广泛应用于皮肤修复和再生领域。在受损的皮肤组织中，纤连蛋白可以诱导周围细胞移动到受损区域，促进皮肤细胞的再生和修复。还可以增加皮肤细胞的黏附性，促进皮肤组织的形成和修复。

人纤连蛋白广泛存在于人体组织及组织液中，参与了细胞的迁移、黏附、增殖、止血及组织修复和胚胎的发育，具有生长因子的作用，可促进细胞增殖，诱导表皮细胞通过肉芽组织，并促进表皮下基底膜再建和正常角化过程。纤连蛋白也参与机体众多病理过程。纤连蛋白具有多种粘附功能，例如细胞间粘附。纤连蛋白在伤口愈合中也很重要。沉积在受损胶原蛋白和纤维蛋白上的可溶性纤连蛋白会增强血小板附着、吞噬细胞和成纤维细胞迁移以及细胞增殖(李秀兰,师宜健,陆静.纤维结合蛋白及其在创伤修复中的作用[J].中国中西医结合外科杂志,1998,4(1):60-62.)。Maxwell B.Johnson等通过小鼠伤口模型实验，证明了纤连蛋白可以降低在小鼠皮肤中对辐射的反应。此外，局部施用的纤连蛋白的凝胶剂可以显著促进受辐射皮肤伤口的愈合(Maxwell B.Johnson,Brandon Pang,et al.TopicalFibronectin Improves Wound Healing of Irradiated Skin[J].Scientific Reports,2017,7(Suppl 4):502-506)。

敏感性皮肤问题的发生率正在增加，在过去的几十年中，许多人报告他们的皮肤比以前更容易发生敏感反应。导致这种趋势的原因可能是多方面的。其中一些因素可能包括环境污染、气候变化、紫外线照射、不良饮食习惯、压力、化妆品使用等等。此外，人们对皮肤健康的关注程度也在增加，因此可能更多地报告敏感肌的症状。敏感性皮肤问题通常会出现皮肤泛红如红斑和红血丝等、瘙痒或刺痛、干燥或脱屑、紧绷、过敏或过度刺激，易受外界影响等症状。其中泛红指皮肤表面的血管扩张或血流量增加，导致局部皮肤呈现出红色的外观。这种现象通常是因为某些原因引起的血管扩张或炎症反应，导致局部皮肤的血流量增加，从而导致皮肤泛红。相较于其它症状，泛红是这些症状中主观性不明显，相对容易定量，且人们饱受困扰的症状。

传统的从动物血浆中逐级分离纯化得到的纤连蛋白，耗时长，得率低，步骤多，而且还存在安全性问题；而生物技术来源的纤连蛋白可以很好的规避这些风险。纤连蛋白因其独特的价值，越来越多的生物科技公司开始通过生物技术合成纤连蛋白：2019年，中国专利文献CN 110577592B利用大肠杆菌合成人源纤连蛋白片段FNIII 12-14区段，具有促进细胞黏附，伤口愈合的作用。中国专利文献CN 110404608A利用酵母发酵表达由钠钾ATP酶亚基结合域，纤维蛋白结合域，胶原蛋白结合域和肝素结合域拼接而成的片段，具有促进细胞黏附和生长的作用，并可以透皮吸收。中国专利文献CN 115785280 A利用毕赤酵母表达的方法合成重组人源纤连蛋白，包括1个胶原蛋白结合区域和2个重复的细胞整合素协同结合区域，经过理性设计后所得的人源纤连蛋白片段，具有良好的促进细胞黏附和细胞迁移的效果。

但是，目前无论是大肠杆菌作为模式生物合成的纤连蛋白，还是从毕赤酵母作为模式生物合成的纤连蛋白，都有功效不确定，成本不够低等问题。

目前，尚需要开发新的纤连蛋白功能片段相应的组合物。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种人纤连蛋白功能片段。本发明人惊奇地发现，所述人纤连蛋白功能片段具有良好的人纤连蛋白活性。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示。

本发明的分离的多肽为人纤连蛋白功能片段。

本发明的另一方面涉及一种分离的核酸，其编码本发明的分离的多肽。

在本发明的一些实施方式中，所述的分离的核酸，其序列如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4所示。

本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有本发明中任一项所述的分离的核酸。

在本发明的一些实施方式中，所述的重组载体，其中所述重组载体为重组的真核表达载体。

本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明中任一项所述的分离的核酸，或者含有本发明中任一项所述的重组载体。

根据本发明的分离的多肽、分离的核酸、重组载体或重组宿主细胞，其用于促进伤口愈合、促进细胞黏附、抑制IL-6的表达、抑制TNF-α表达、改善皮肤过敏、促进皮肤修复、促进皮肤再生、抑制皮肤炎症、降低皮肤内血管扩张、促进皮肤褪红和/或改善皮肤激惹态。

本发明进行了划痕实验、细胞黏附实验和巨噬细胞的抗炎症实验。划痕实验很好了模拟了FN功能片段在伤口愈合中的作用，细胞黏附和抗炎症实验为FN功能片段舒敏功效提供了离体数据证明。

本发明的再一方面涉及一种组合物，其含有有效量的一种或两种本发明的分离的多肽，以及一种或多种药用或者化妆品用的辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其中，其含有作为唯一活性成分的本发明的分离的多肽，以及一种或多种药用或者化妆品用的辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其由本发明的分离的多肽，以及一种或多种药用或者化妆品用的辅料组成。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其中，所述辅料为选自保湿剂、流变改性剂和防腐剂中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其中，所述辅料包括保湿剂和流变改性剂；优选地，还包括防腐剂。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其中，所述保湿剂选自甘油、丁二醇、戊二醇和己二醇中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其中，所述流变改性剂选自黄原胶、凝胶多糖、瓜尔豆胶、刺槐豆胶、魔芋胶、果胶、纤维素、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、卡波姆和丙烯酸(酯)类共聚物中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其中，所述防腐剂选自对羟基苯乙酮、辛酰羟肟酸、苯甲醇和苯氧乙醇中的一种或多种。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其中，按照100重量份的组合物计算，本发明的分离的多肽为至少0.001重量份、至少0.002重量份、至少0.003重量份、至少0.004重量份、至少0.005重量份、至少0.006重量份、0.001-1重量份、0.001-0.1重量份或0.006重量份。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其包含如下组分或者由如下组分组成：

本发明的多肽0.001-1重量份、甘油1-5重量份、丁二醇1-10重量份、黄原胶0.05-0.5重量份、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1-0.5重量份、对羟基苯乙酮0.1-1.0重量份、戊二醇0.5-2重量份；优选地，补水至组合物总量为50-200重量份。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其包含如下组分或者由如下组分组成：

本发明的分离的多肽0.001-0.1重量份、甘油3-5重量份、丁二醇4-6重量份、黄原胶0.02-0.15重量份、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1-0.5重量份、对羟基苯乙酮0.4-0.6重量份、戊二醇0.5-2重量份；优选地，补水至组合物总量为80-120重量份。

在本发明的一些实施方式中，所述的组合物，其包含如下组分或者由如下组分组成：

本发明的分离的多肽0.006重量份、甘油4重量份、丁二醇5重量份、黄原胶0.1份重量份、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1重量份、对羟基苯乙酮0.5重量份、戊二醇1重量份；优选地，补水至组合物总量为100重量份。

根据本发明的组合物，其用于促进伤口愈合、促进细胞黏附、抑制IL-6的表达、抑制TNF-α表达、改善皮肤过敏、促进皮肤修复、促进皮肤再生、抑制皮肤炎症、降低皮肤内血管扩张、促进皮肤褪红和/或改善皮肤激惹态。

通过检测0.3％的烟酸甲酯刺激皮肤前后的皮肤血红素含量的变化和VISIA CR的a*值变化可以发现0.3％的烟酸甲酯刺激皮肤后，血红素含量和VISIA CR的a*值有明显的上升趋势，说明刺激有效。使用组合物后可以在5分钟快速明显降低手前臂内侧皮肤的VISIA CR的a*值，45分钟快速明显降低手前臂内侧的血红素含量。

本发明的组合物给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗适应症或者症状的性质和严重程度，受试者的性别、年龄、体重及个体反应、给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

可改变本发明组合物中分离的多肽的实际剂量水平，以便所得的组合物能有效针对具体患者和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，分离的多肽的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明的再一方面涉及本发明的分离的多肽或者本发明的组合物在制备用于促进伤口愈合、促进细胞黏附、抑制IL-6的表达、抑制TNF-α表达、改善皮肤过敏、促进皮肤修复、促进皮肤再生、抑制皮肤炎症、降低皮肤内血管扩张、促进皮肤褪红和/或改善皮肤激惹态的药物中的用途。

本发明的再一方面涉及一种促进伤口愈合、促进细胞黏附、抑制IL-6的表达、抑制TNF-α表达、改善皮肤过敏、促进皮肤修复、促进皮肤再生、抑制皮肤炎症、降低皮肤内血管扩张、促进皮肤褪红和/或改善皮肤激惹态的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明的分离的多肽的步骤。

本发明中，术语“皮肤激惹态”是指敏感性皮肤综合征，它是一种高度敏感的皮肤亚健康状态，处于此种状态下的皮肤极易受到各种因素的激惹而产生刺痛、烧灼、紧绷、瘙痒等主观症状。

本发明中，术语“舒敏”是指舒缓皮肤敏感，包括泛红、皮肤受损等症状。

本发明，术语“有效量”是指可在受试者中实现预防或治疗本发明所述的适应症或者症状，或减轻和/或缓解所述适应症或者症状的本发明分离的多肽的量。

发明的有益效果

本发明取得了如下技术效果中的一种或多种：

(1)获得了高表达、高活性、低成本的重组FN功能片段。

(2)本发明的分离的多肽或本发明的组合物能够有效地促进伤口愈合。

(3)本发明的分离的多肽或本发明的组合物能够有效地改善皮肤过敏、促进皮肤修复或皮肤再生。

(4)本发明的分离的多肽或本发明的组合物能够有效地抑制皮肤炎症。

(5)本发明的分离的多肽或本发明的组合物能够有效地降低皮肤内血管扩张、促进皮肤褪红和/或改善皮肤激惹态。

附图说明

图1：0417、0418转化酵母GS115后的PCR验证图。从左至右依次是marker、0417和0418。

图2A：0419转化酵母GS115后的PCR验证图。从左至右依次是0419和marker。

图2B：0420转化酵母GS115后的PCR验证图。从左至右依次是0420和marker。

图3A：0417酵母发酵液的Western Blot验证图。从左至右依次是0417和marker。

图3B：0418酵母发酵液的Western Blot验证图。从左至右依次是marker和0418。

图4：0419、0420酵母发酵液的Western Blot验证图。从左至右依次是0419和0420。

图5：0417角质形成细胞的CCK实验,不同浓度下的相对细胞活性；显示0417对细胞具有安全性。NT表示无处理。

图6：0418角质形成细胞的CCK实验，不同浓度下的相对细胞活性；显示0418对细胞具有安全性。NT表示无处理。

图7：0419角质形成细胞的CCK实验，不同浓度下的相对细胞活性；显示0417对细胞具有安全性。NT表示无处理。

图8：0420角质形成细胞的CCK实验，不同浓度下的相对细胞活性；显示0420对细胞具有安全性。NT表示无处理。

图9：0417、0420在15ppm的浓度下对伤口愈合均有显著的促进作用。相同浓度下，0417的表现更加良好。NT表示无处理。

图10：0418在15ppm下对伤口愈合有显著促进作用，0419在15ppm浓度下对伤口愈合无促进作用。NT表示无处理。

图11：0417在10ppm的浓度下有显著促进细胞黏附的作用。0420在两个浓度下均没有对促进细胞黏附的作用。NT表示无处理。

图12：0418在10ppm的浓度下有显著促进细胞黏附的效果。0419在两个浓度下均没有促进细胞黏附的效果。NT表示无处理。

图13：0417和0418均可以显著抑制IL-6的表达，并具有浓度依存性。其中0417的效果优于0418。NT表示无处理。

图14：0417和0418均具有显著抑制TNF-α表达的效果，并具有浓度依存性。其中0418的效果略优于0417。NT表示无处理。

图15：VISIA CR拍摄的手臂红区图片。其中，第一行从左到右分别为测试前，烟酸甲酯刺激后，涂抹制备例2制得的本发明的组合物(2mg/cm

图16：VISIA CR拍摄的手臂红区图片。其中，第一行从左到右分别为热刺激测试前，涂抹制备例2制得的本发明的组合物(2mg/cm

本发明涉及的部分序列如下：

0417氨基酸序列

PHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSD VPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPA(SEQ ID NO:1)

0417碱基序列

GAATTCCCTCATTCTAGAAATTCTATCACTTTGACTAACTTGACTCCTGGTACTGAATATGTTGTTTCTATTGTTGCTTTGAACGGTAGAGAAGAATCTCCATTGTTGATTGGTCAACAATCTACTGTTTCTGATGTTCCAAGAGATTTGGAAGTTGTTGCTGCTACTCCAACTTCTTTGTTGATTTCTTGGGATGCTCCTGCTGTTACTGTTAGATATTATAGAATTACCTACGGTGAAACTGGTGGTAACTCTCCTGTTCAAGAGTTTACTGTTCCTGGTTCTAAATCTACTGCTACTATTTCTGGTTTGAAACCTGGTGTTGATTATACTATTACTGTTTACGCTGTTACTGGTAGAGGTGACTCTCCTGCTCATCATCATCATCACCATTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO:2)

0418氨基酸序列

GNSNGALCHFPFLYNNHNYTDCTSEGRRDNMKWCGTTQN YDADQKFGFCPMAAHEEICTTNEGVMYRIGDQWDKQHDMGH MMRCTCVGNGRGEWTCIAYS(SEQ ID NO:3)

0418碱基序列

GAATTCGGTAATTCTAACGGTGCTTTGTGTCATTTCCCTTTTCTTTACAATAACCATAACTACACTGACTGTACTTCTGAAGGTAGAAGAGATAATATGAAATGGTGTGGTACTACTCAAAACTACGATGCTGATCAAAAATTTGGTTTTTGTCCAATGGCTGCTCATGAAGAAATTTGTACTACTAATGAAGGTGTTATGTACAGAATTGGTGACCAATGGGATAAACAACATGATATGGGTCATATGATGAGATGTACTTGTGTTGGTAACGGTAGAGGTGAATGGACTTGTATTGCTTACTCTCATCATCATCATCACCATTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO:4)

0419氨基酸序列

PVVIDASTAIDAPSNLRFLATTPNSLLVSWQPPRARITGYIIK YEKPGSPPREVVPRPRPGVTEATITGLEPGTEYTIYVIALKNNQK SEPLIGRKKTVQKTPFVTH(SEQ ID NO:5)

0419碱基序列

GAATTCCCTGTTGTTATTGATGCTTCTACTGCTATTGATGCTCCATCTAATTTGAGATTCTTGGCTACTACTCCAAACTCTTTGTTGGTTTCTTGGCAACCTCCTAGAGCTAGAATTACTGGTTACATTATTAAGTACGAGAAGCCTGGTTCTCCTCCTAGAGAAGTTGTTCCTAGACCAAGACCAGGTGTTACTGAAGCTACTATTACTGGTTTGGAACCAGGTACTGAATACACTATCTATGTTATTGCTTTGAAGAACAACCAAAAGTCTGAACCATTGATTGGTAGAAAAAAGACTGTTCAAAAGACTCCTTTTGTTACTCATCATCATCATCATCACCATTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO:6)

0420氨基酸序列

PIAEKCFDHAAGTSYVVGETWEKPYQGWMMVDCTCLGEG SGRITCTSRNRCNDQDTRTSYRIGDTWSKKDNRGNLLQCICTGN GRGEWKCERHTSVQTTSSGSGPF(SEQ ID NO:7)

0420碱基序列

GAATTCCCAATTGCTGAAAAATGTTTCGATCATGCTGCTGGTACTTCTTATGTTGTTGGTGAAACTTGGGAAAAACCATACCAAGGTTGGATGATGGTTGATTGTACTTGTTTGGGTGAAGGTTCTGGTAGAATTACTTGTACTTCTAGAAACAGATGTAACGATCAAGATACTAGAACTTCTTATAGAATCGGTGACACTTGGTCTAAAAAGGATAATAGAGGTAACTTGTTGCAATGTATTTGTACTGGTAACGGTAGAGGTGAATGGAAGTGTGAAAGACATACTTCTGTTCAAACTACTTCTTCTGGTTCTGGTCCTTTCCATCATCATCATCACCATTAAGCGGCCGC(SEQ ID NO:8)

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

制备例1：人纤连蛋白截短片段的设计和制备

1.人纤连蛋白截短片段的序列设计

设计并初步筛选得到4个人纤连蛋白的截短片段，分别命名为0417、0418、0419和0420，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7所示；相应的编码核酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示。

2.重组载体的构建和扩增

全基因合成SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8序列，将载体模板进行双酶切，T4连接酶连接目的基因序列和双酶切后切胶回收的载体，转化毕赤酵母Top10感受态细胞TOP10菌株，挑单克隆重新提质粒扩增，测序经过证明得到了带有目的基因的Top10质粒。

3.毕赤酵母重组菌株的构建

1％的接种量将载有目的基因的TOP10菌液接种到含zeocin抗性的LLB液体培养基中，37℃，250rpm过夜。第二天离心收集菌液沉淀使用质粒提取试剂盒(艾柏森)进行质粒提取。

将提取好的质粒取10μg加入Sac I(thermo)，37℃酶切1h。使用胶回收试剂盒(艾柏森)进行酶切产物回收。将2-5μg线性化后的质粒加入100μl GS115感受态细胞(艾柏森)，转移到2mm电转杯中，使用电转仪电击(参数：电压2000V，电容25μF，电阻200Ω，电转杯2mm)一下后立即加入1M冰山梨醇。电转杯中菌液混匀转移到离心管中，30℃静置1h，加入1mLYPDS(YPDS组成:蛋白胨20g、酵母粉10g、磷酸氢二钾3g、磷酸二氢钾11.8g、甘油10mL,加水补足至1升，高温灭菌后冷却凝固保存)后30℃250rpm摇1h。离心去掉大部分上清留100μl，剩余菌液混匀涂布YPDS-zeocin培养皿，30℃培养5天。用于下面的PCR验证。

将生长出来的单克隆挑到30μl 0.25％ SDS，沸水煮10min。离心，取上清5μL加入到45μl 25％甘油中，作为模板进行PCR验证。

引物：

α-Factor：5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'(SEQ ID NO:9)；

3-AOX：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'(SEQ ID NO:10)。

PCR验证的结果如图1、图2A和图2B所示。结果显示，得到阳性克隆。

4.发酵

单克隆加入到50mL BMGY培养基中28℃250rpm条件下培养过夜，第二天离心收集沉淀转移到100mL BMMY培养基，OD＝1.0，28℃，250rpm培养96h，每隔24h补加1％甲醇。

5.蛋白纯化

取培养后的菌体，将菌液于低温离心机内离心，保留上清。

将上述获得的上清，用0.45μm滤膜过滤。将4ml的His填料加入过滤后的菌液，孵育2h，之后通过亲和层析柱进行蛋白纯化。

步骤如下：

1)将样品以1ml/min的速度流穿His柱；

2)用Buffer A(50mM Tris PH8.0 150mM NaCl)平衡柱子；

3)用20mM、300mM、500mM咪唑洗脱。

4)将洗脱下来的样品分别进行SDS-PAGE胶分析是否有目的蛋白。

结果如图3A、图3B和图4所示。结果显示，制得了目的蛋白0417、0418、0419和0420。

实验例1：细胞安全性测试(CCK)

细胞培养：人原代角质形成细胞(

人原代角质形成细胞活性测试：人原代角质形成细胞在5％ CO

通过计算样品组和对照组的平均OD值之比得到相对细胞活性数值，判断样品的细胞毒性作用。相对细胞活性％＝(样品组OD值/对照组OD值)x 100％。

通常认为相对细胞活性在80％以上是安全的。

结果如图5至图8所示。

图5显示了不同浓度的0417样品对角质形成细胞细胞活力的影响。结果显示，1-35ppm的该样品对细胞的活力都没有显著的损伤，证明在此浓度范围内对细胞都是安全的。

图6显示了不同浓度的0418样品对角质形成细胞活力的影响。结果显示，1-17ppm的样品对细胞活力没有显著损伤。

图7显示了0419样品对角质形成细胞的活性的影响。结果显示，在1-42ppm范围内该样品对细胞活性均没有损伤，为安全浓度。

图8显示了0420样品对角质细胞活性的影响。结果显示，1-34ppm范围内该样品对细胞均没有损伤，为安全浓度。

实验例2：划痕实验

在37℃，95％的空气湿度和5％ CO

当细胞在12孔板中快汇合的时候，用微量移液管的尖端对长满的单层细胞制造机械伤口，然后用PBS清洗三次，洗去细胞残渣。

然后立刻用100ng/ml的IGF-1(胰岛素样生长因子，阳性对照)，15ppm的样品处理并孵育24小时。

造成伤口后即刻拍照，进而在孵育24小时后拍照。

用ImgaeJ software对拍摄的图片进行定量分析，对不同处理组的数据进行分析。

采用以下公式：

伤口愈合率％＝(面积

相对伤口愈合率％＝(伤口愈合率

结果如图9至图10所示。

图9显示了0417和0420样品在15ppm条件下对伤口愈合的功效。结果显示，0417样品比0420样品对伤口愈合中的作用更加优异，两者对伤口愈合均有显著的促进作用。

图10显示了0418和0419样品在15ppm浓度下对伤口愈合的功效。结果显示，0418对伤口愈合有显著促进的功效，反之，0419对伤口愈合没有显著的促进作用。

实验例3：细胞黏附实验

使用细胞外基质包被的96孔板，接种原代成纤维细胞(

吸光度的值与黏附在培养孔表面的活细胞的数量成正比。所以细胞的粘附性可以通过下面的公式来计算：

相对细胞黏附力％＝(OD450样品/OD450对照)X 100％。

结果如图11至图12所示。

图11和图12分别显示了不同浓度条件下，0417和0420样品、0418和0419样品对细胞黏附的促进作用。结果显示，只有10ppm的0417号和0418样品对细胞黏附具有显著的促进作用，其它样品均没有显著促进作用。

实验例4：巨噬细胞的抑制炎症实验

在含有10％FBS的DMEM中培养Raw 264.7小鼠巨噬细胞(

把细胞分成不同的组，每个处理为三个重复：对照组(只有培养基)，LPS(脂多糖)处理组(LPS 1μg/mL)，阳性对照组(LPS+30μM地塞米松)和处理组(LPS+样品)取细胞上清液，用ELISA法分析TNF-α，IL-6。

结果如图13至图14所示。

图13显示了不同浓度的0417和0418样品对由LPS引起的炎症因子IL-6表达的影响。结果显示，两个浓度下的0417和0418样品均显示对炎症因子IL-6的显著抑制作用。

图14显示了不同浓度的0417和0418样品对由LPS引起的炎症因子TNF-α表达的影响。结果显示，两个浓度下的0417和0418样品均显示对炎症因子TNF-α的显著抑制作用。

制备例2：制备含有纤连蛋白截短片段的组合物

本发明的组合物：纤连蛋白截短片段(0417)0.006重量份、甘油4重量份、丁二醇5重量份、黄原胶0.1重量份、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1重量份、对羟基苯乙酮0.5重量份、戊二醇1重量份，其余用水补足到100重量份。

另外，作为对照的安慰剂组合物如下：

甘油4重量份、丁二醇5重量份、黄原胶0.1重量份、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1重量份、对羟基苯乙酮0.5重量份、戊二醇1重量份，其余用水补足到100重量份。

实验例5：可复用烟酸甲酯皮肤泛红模型评估实验

参照CN 114469948 A，使用可复用烟酸甲酯皮肤泛红模型构建进行评估。

实验步骤：

招募受试者30个，男女不限，18-60岁；

测试部位：左右手前臂内侧；测试面积2.5*4cm

实验对照：空白对照；

实验仪器：Mexameter MX18；VISIA CR；

实验样品：烟酸甲酯(造模用，购自国药)、制备例2制得的本发明组合物、制备例2制得的安慰剂组合物。

测试流程：将受试者的手前臂内侧分为2个测试区域，随机将其分别设置为本发明组合物的区域和安慰剂组合物区域；检测涂抹样品前皮肤血红素EI的基础值，用0.3％的烟酸甲酯浸润的化妆棉在测试区域敷贴2分钟，随即去除，用纸巾吸干液体，立即检测皮肤血红素值和VISIA CR的a*值，随后分别使用本发明组合物的区域和安慰剂组合物区域即时的，5分钟后，15分钟后，45分钟后和60分钟后，检测VISIA CR的a*值，同时在45分钟后和60分钟后检测皮肤血红素值。

在造模后3小时后进行热刺激，看组合物对于改善皮肤的易激惹态的能力。热刺激的方式采用42℃温水浴3分钟，并在热刺激前后检测血红素含量和VISIA CR的a*值。

最后统计分析每个测试区域各个时间点，皮肤血红素含量的变化和VISIA CR的a*值变化来看本发明组合物和安慰剂组合物是否具有快速改善泛红和改善皮肤激惹态的能力。

快速褪红-皮肤血红素含量

在使用后45min和60min使用了组合物的皮肤血红素下降，下降程度明显低于安慰剂。

表1：手前臂内侧皮肤血红素不同时间节点统计表(平均值±标准误差)

表2：手前臂内侧皮肤血红素不同时间节点与造模后即刻的差值统计表(平均值±标准误)

快速褪红-VISIA CR的皮肤红区红度a*值

在使用后5min，15min,45min,60min使用了组合物的红区红度a*值下降，下降程度明显低于安慰剂。

表3：手前臂内侧皮肤图像红区红度a值不同时间节点统计表(平均值±标准误)

表4：手前臂内侧皮肤图像红区红度a值不同时间节点与造模后即刻的差值统计表(平均值±标准误)

改善皮肤激惹态-皮肤血红素含量

与安慰剂对比，使用组合物的手前臂内侧皮肤在热刺激后血红素变化程度更小，热刺激前和初始值对比，使用组合物的手前臂内侧皮肤相比初始值的差值更小。热刺激后和热刺激前对比，使用组合物的手前臂内侧皮肤血红素变化更小，改善了皮肤的激惹态。

表5：手前臂内侧皮肤血红素不同时间节点统计表(平均值±标准误差)

表6：手前臂内侧皮肤血红素不同时间节点的差值统计表(平均值±标准误)

改善皮肤激惹态-皮肤红区红度a*值(平均值±标准误)

使用组合物与安慰剂对比，热刺激后红区红度a*值变化程度更小，热刺激前和初始值对比，使用组合物的手前臂内侧皮肤相比初始值的差值更小。热刺激后和热刺激前对比，使用组合物的手前臂内侧皮肤红区红度a*值变化更小，改善了皮肤的激惹态。

表7：手前臂内侧皮肤图像红区红度a值不同时间节点统计表(平均值±标准误)

表8：手前臂内侧皮肤图像红区红度a值不同时间节点的差值统计表(平均值±标准误)

结果如表3至表8以及图15至图16所示。

结果显示，相对于安慰剂组合物，本发明的组合物具有明确的快速褪红和改善皮肤激惹态的能力。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。